Summary
Метод с использованием полупроводниковых нанопор для контроля неспецифической адсорбции белков на поверхности неорганические описывается. Метод использует резистивный импульса принципу, что позволяет адсорбции быть проверены в режиме реального времени и в одиночных молекул уровне. Потому что процесс адсорбции одного белка далека от равновесия, мы предлагаем работу параллельных массивов синтетических нанопор, что позволяет для количественного определения очевидной реакцией первого порядка константа скорости адсорбции белка, а также и адсорбции Ленгмюра постоянной.
Abstract
Твердотельные нанопор были использованы для выполнения измерений на одной молекулы уровне изучить локальную структуру и гибкость нуклеиновые кислоты 1-6, разворачивается белков 7 и сродство различных лигандов 8. Объединяя эти нанопор на резистивная-импульсной техники 9-12, таких измерений может быть сделано при самых разнообразных условиях и без необходимости маркировки 3. В активно-импульсной техники, ионные солевой раствор вводится по обе стороны нанопор. Таким образом, ионы приводятся в движение с одной стороны камеры на другую применяется трансмембранного потенциала, в результате чего постоянный ток. Разбиение аналита в нанопор причины четко определенные отклонения в этом ток, который может быть проанализирован для извлечения одной молекулы информации. Используя эту технику, адсорбции одного белков нанопор стен можно наблюдать в широком диапазонеусловий 13. Белки адсорбции приобретает все большее значение, поскольку, как микрожидкостных устройств уменьшаться в размерах, взаимодействие этих систем с одной белков становится проблемой. Этот протокол описывает быстрый тест для связывания с белками для пленок нитрида, который может быть легко распространена на другие тонкие пленки поддаются бурения нанопор, или функциональными поверхности нитрида. Разнообразие белков можно изучить под широкий спектр решений и денатурирующих условиях. Кроме того, этот протокол может быть использован для изучения более основных проблем с использованием нанопористых спектроскопии.
Protocol
1. Производство полупроводниковых нанопор в мембранах из нитрида кремния
- Принесите / TEM FEI Tecnai F20 S для ускорения напряжением 200 кВ. При использовании различных S / TEM, ускоряющее напряжение должно быть больше или равна 200 кВ 9
- Нагрузка 20 нм SPI нитрида кремния окно сетку в ТЭМ держателя образца и чистым кислородом плазмы в течение 30 секунд, чтобы удалить любые загрязнения из держателя.
- Нагрузка образца в S / TEM и позволяют вакуум насоса вниз. Как только S / TEM имеет откачивалась до вакуума, найти окно в нитрида светлого поля TEM режима, глядя на яркий квадрат на Ronchigram. Убедитесь в том, ТЕМ выровнена должным образом, то выровнять и сосредоточиться образца.
- Переключатель S / TEM в STEM режиме. Используйте HAADF (или эквивалент) детектор изображения образец и убедитесь, что он правильно выровнен.
- Установить Монохроматор к низкой стоимости. Меньшее значение Монохроматор позволяет высшее валютамт электронов доступными для бурения. Если S / TEM не указал Монохроматор, пропустите этот шаг.
- Выберите подходящий размер места для бурения нанопор. Это соответствует диаметр электронного зонда. 3 нм зонд хорошо работает для бурения 5 поры нм в диаметре. Больше зонда (5 нм) будет сверлить быстрее и создавать большие поры. Меньшего зонда (1 нм) займет больше времени, чтобы развернуть и создать меньшие поры.
- Отрегулируйте STEM трассы, если это необходимо.
- Фокус нитрида мембраны и довести его до увеличения x1.3M. Точной фокусировки должно быть сделано путем мониторинга Ronchigram.
- Если есть движение образца, то ждать образец стабилизироваться. Это может занять до часа. Пустые электронного пучка в ожидании, чтобы не повредить нитрида.
- Место электронного зонда на образец и начать бурение.
- Периодически проверяйте образец при сканировании с детектором HAADF, и чтобы убедиться, что нанопор в настоящее время DRIlled (он будет выглядеть как темное пятно) и убедиться, что нет никакого движения образца. Если образец дрейфует чуть-чуть, отрегулировать положение электронного зонда быть старше нанопор.
- Часы Ronchigram определить, когда пора уже сформирован. Когда в фокусе, нитрид фильм мерцающий вид. Это будет исчезать, когда формы нанопор. Ввод Ronchigram немного не в фокусе позволяет увидеть Френеля бахромой связанные с нанопор.
- Возьмите образ нанопор с HAADF.
- Есть ли интенсивность профиля нанопор изображения. Диаметр нанопор может быть оценена по темной области профиля.
- Расширение нанопор может быть выполнена путем перемещения электронного зонда по краям пор.
- После нанопоры имеет желаемого диаметра, положить S / TEM в режиме TEM.
- Принесите Монохроматор его стандартов и изображения нанопор использованием светлого поля TEM для подтверждения размера
2. Смачивание твердого нанопор
- Де-газ де-ионизированной воды, содержащей 1 М KCl, 10 мМ фосфата калия, рН 7,4. Это можно сделать, поставив решений в условиях вакуума и размещения их в ванну sonicator течение 20 минут.
- Место нанопор содержащих чип нитрида кремния в стакан 10 мл Pyrex. Будьте осторожны, чтобы не сломать нитрида окна, как это очень деликатный. Место стакан на плите в вытяжной шкаф и установить до 100 ° C.
- Чистая нанопор чип с пираньи решения с использованием большой осторожностью. Сначала добавьте 3 мл серной кислоты в контейнер с помощью стеклянной пипетки. Затем, осторожно добавляют 1 мл перекиси водорода в серную кислоту, чтобы пираньи решение 14. Пожалуйста, примите все меры предосторожности.
- Разрешить нанопор чип, чтобы отдохнуть в пираньи раствор на 10 минут.
- Удалить пираньи раствор из стакана с помощью стеклянной пипетки. Поместите его в надлежащий сосуд хранения.
- Fiбуду стакан с дегазированным, де-ионизированной воды с помощью чистой пипетки стекла. Пустой стакан воды и повторить не менее 5 раз.
- Удалить нанопор чип с чистым пинцетом и высушить его светом всасывания
- Сразу же, печать нанопор чип в камеру (рис. 2а, 2б). Чип может быть обеспечено в камере уплотнительные кольца или силиконовым герметиком.
- Заполнить камеру с KCl решение
- Подключите Ag / AgCl электродов камеры (рис. 2б). Электроды могут быть сделаны путем замачивания серебряной проволоки в отбеливателя в одночасье.
- Применить трансмембранного потенциала между электродами и контролировать текущий ответ, используя Axon 200B патч-зажим усилителя напряжения зажим режиме.
- Построить I / V (ток-напряжение) кривая из измерений. I / V кривая должна быть очень линейным при использовании 1 М KCl (рис. 3). Проводимость нанопор должно соответствовать его диаметру. Если нанопор не отображаетлинейные I / V кривая, проводимость является слишком низкой, или открытые текущие из нанопор не является стабильным (рис. 4а), это означает, что нанопоры должным образом не смачивается и пираньи мытье следует повторить.
3. Мониторинг адсорбции белка
- Крайне важно провести контрольные эксперименты с одной нанопор мембраны или параллельный массив нанопор (см. ниже) для контроля тока с буфером условиях отсутствия белка образца. Мы рекомендуем следующие два этапа: (я) использование высокой чистоты на уровне буфера (чистота> 99,9%; хромато-класса уровня), и (II), использование буфера, взаимодействие которых с твердотельными нанопор не производство одноканальных событий. Кроме того, мы рекомендуем получения высокой чистоты белка примера с использованием стандартных процедур химии белка. Чистота белка образец должен быть проверен додецилсульфата натрия-полиакриламид (SDS-PAGE) анализ гель и высоким разрешением, масс-спектрометрии 15.
- Добавить очищенный образец белка для изучения в заземленной ванне камеры. Подождите, пока образец диффузного всей ванне. Типичные концентрации белка, который может быть измерен в десятки нМ до мкМ диапазоне 7,15-21.
- Применить трансмембранный потенциал напряжения смещения с полярностью противоположном суммарный заряд белка изучается. Например, BSA имеет эффективный отрицательный заряд при рН 7,4, и, следовательно, положительное напряжение смещения должны применяться. Приложенное напряжение создает градиент потенциала внутри нанопор интерьера и белков разноименных зарядов будет зависеть от противоположных сил. Только напряжение полярности, которые управляют белки в нанопор создаст измеримое сигналов.
- Приложенного потенциала величины 200 мВ должно быть достаточно большим, чтобы наблюдать наиболее аналитов белка. События будут выглядеть как переходный ток отклонения от базовой линии (рис. 4б).Если сигнал не наблюдается, увеличение концентрации белка в камере. Высшее напряжение улучшить отношение сигнал-шум. Нитрид нанопор может выдержать несколько вольт.
- Белки адсорбции появится как долгоживущие изменения в базовый ток нанопор (рис. 4в).
4. Возможности для функционализации нанопор
Там существует несколько методов для применения функциональных групп нитрида кремния 22,23. Большинство пленок нитрида имеют тонкий слой окисла на улицу и воздействию озона может создать дополнительный слой оксида, если это необходимо. Различные органосиланы могут быть использованы и самоорганизующихся на такие слои. Особый интерес представляет аминосиланом, который самостоятельно собирает и могут быть изменены в дальнейшем (например, карбоновых кислот и альдегидов), что позволяет для проверки ряда органических поверхностей. После нанопор были промывают пираний и закреплены в chambeт, аминов могут быть добавлены непосредственно в камере ванны с фонового электролита 0,5 М TBACl (тетрабутиламмония) и безводного метанола (метанола), используемого в качестве растворителя. Однослойные образование можно контролировать с помощью применения 400 мВ напряжение смещения и измерения тока падение 23.
5. Определение очевидной первого порядка константы скорости реакции и адсорбции Ленгмюра постоянном использовании параллельных массивы нанопор
5,1 очевидной реакцией первого порядка константы скорости поглощения и десорбции
Мы подчеркиваем, что положительным моментом этой методики является возможность наблюдать отдельные адсорбции на одной молекулы уровне. Одной молекулы белка измерения адсорбции на поверхности неорганические могут быть расширены за счет использования параллельных массивов полупроводниковых нанопор. Параллельный массив нанопор необходимо из-за необходимости анализа многих поры получить достоверную статистикуs. В связи с этим, использование массива нанопор позволит мониторинга отдельных адсорбции, а также измерения нескольких событий для дальнейшего анализа. Массив нанопор в нитрида кремния могут быть образованы путем выше протокол просто бурение нескольких отверстий в образце. Каждый нанопор должны быть такого же размера. Массивы нанопоры 6x6 или 7x7 должна быть адекватной. После добавления белка вещества в камере, ток будет распад в геометрической прогрессии с следующее выражение:
Я т = I ∞ - (I ∞ - Я 0) ехр (-к т ')
Здесь я т, обозначает ток при экспериментальных т времени. Я 0 является оригинальной тока, проходящего через нанопоры массива. I ∞ указывает ток на уровень насыщения (то есть, бесконечность). К 'очевидной первого порядка скорость реакции константа, которая может быть определена из йэлектронной приступе экспериментальной кривой. Больше к 'можно интерпретировать как более быстрыми темпами, адсорбции. Отношение I ∞ / I 0, которая также называется нормированный ток насыщения, является безразмерным числом между 0 и 1. Этот параметр является мерой размещение адсорбированной аналитов белка. Таким образом, каждая отдельная экспериментальная условие должно быть связано с двумя конкретными выходными параметрами I ∞ / I 0 и к '.
Следует отметить, что очевидная первого порядка константы скорости адсорбции и нормированных токов подвергаются воздействию эффективной время, проведенное белков внутри нанопор. Это время зависит от концентрации белка аналитов в натуральном водной фазы 24. Таким образом, дополнительная коррекция этих чисел нужно реализовать основанные на эффективное время, проведенное белков в интерьере нанопор. Мы предлагаем измерения частоты ФАСт (транслокация) событий и умножив его на среднем времени пребывания таких событий. Это даст среднее время белки провел в нанопор интерьера в единицу времени.
Константа скорости десорбции можно определить, используя параллельный массив нанопор, а также. Как только текущий уровень достигает насыщения (I ∞), напряжение должно быть отменено, так что никаких больше белков оказались в ловушке в нанопор. Десорбции отдельных белков будет сопровождаться изменением записал ток в сторону большей ценности. Константа скорости будет потом извлечь из роста текущего уровня.
5,2 Ленгмюра адсорбции постоянной
Поглощение белка аналитов на неорганические поверхности нанопор зависит от концентрации белка в водной фазе. Это явление уже наблюдается в одиночных молекул уровне 13. Если θ представляют с нормированный ток насыщения (I ∞ / I 0), то типичные изотермы Лэнгмюра уравнение задается следующим выражением:
где С-концентрация белка в водной фазе. α является Ленгмюра адсорбции постоянной. Эта константа возрастает с увеличением энергии адсорбции и с понижением температуры. Коллекция θ точек данных будет использовать измерения с параллельным массивов осуществляется при различных концентрациях белка в водной фазе. Данные должны быть проанализированы в комбинации с другими методами для проверки величины установлены постоянная Ленгмюра адсорбции. Кроме того, полный атомистической молекулярной динамики 25,26 могут быть также использованы для интерпретации полученных экспериментальных данных.
Название "> 6. представителю Результаты Типичные результаты для полупроводниковых нанопор будет выглядеть следующим образом. Открыть текущий поры должны быть очень стабильными, как показано на рис. 4а. I / V характеристики нанопор должны быть очень линейным в 1 М KCl, 10 фосфата калия, рН 7,4, как показано на рис. 2. Наклон линейной нужным I / V кривая обеспечит унитарного проводимость нанопор. Проводимости имеет прямого отношения к нанопор диаметром и должна соответствовать уравнению: 
, Где G является проводимость нанопор, г является его диаметр, л-его длина, а σ-проводимость раствора в камере 14. Это значение должно соответствовать с точностью до 30%. Если он слишком мал, ваши поры, скорее всего, не смачивается. С добавлением белка, быстрые события должны наступить, как видно на рис. 4б. ProtЭйн адсорбции долгоживущих текущего падения, как показано на рис. 4с. Некоторые белки очень лабильной и пройти структурные преобразования в поры интерьер. В этом случае долгоживущих падение напряжения будет сопровождаться быстрым колебаниям.
Рисунок 1. Твердотельные нанопор изготовлены с использованием Tecnai F20 S / TEM. Пор была пробурена в режиме STEM диаметром 20 нм. Снимок был сделан в ярких поля ТЕМ режиме. Нитрид составила 30 нм.
Рисунок 2. Палаты для жилищного одном твердотельным нанопор в резистивных импульса измерений.) Палаты и кремниевый чип с свободно стоящих нитрида окна (TEM сетки). Нанопор бурится в нитрида перед загрузкой. Красный уплотнительные кольца используются для формирования хорошего сEAL о чип, который разделяет две ванны ионных решение. B) Схема камеры показывающие размещение решение ванн и электродов по отношению к нанопор.
Рисунок 3. Типичные I / V следов для полупроводниковых нанопор разного диаметра. Одноканальный электрических следы были доставлены в 1 М KCl, 20 мМ Трис, рН 8,5. Нанопоры были пробурены в 30-нм нитрида кремния. Обратите внимание, толщина нитрид повлияет унитарного проводимость нанопор.
Рисунок 4. Измеренные одноканальный текущего следы и обнаружение белка адсорбции.) Одноканального электрических следа показывает открытые ток 10 нанопор диаметром нм. В) Текущая отклонения представляют разбиения бычьего сывороточного альбумина (БСА) в томIOR из нанопор. C) Адсорбция BSA на поверхности нитрида. Все следы от того же самого нанопор в 1 М KCl, 10 мМ фосфата калия, рН 7,4. Применяется трансмембранный потенциал был +40 мВ и BSA был добавлен в заземленной камеры бане при концентрации 120 нМ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Спонтанное адсорбции белков на твердотельных поверхностях 27-29 принципиально важно в ряде областей, таких как биочип приложений и проектирование нового класса функциональных биоматериалов гибрид. Предыдущие исследования показали, что белки, адсорбированных на твердотельной поверхности не показывают горизонтальной мобильности или значительные темпы десорбции, и, следовательно, адсорбции белка, как правило, считается необратимым и неспецифического процесса 30-32. Белки адсорбции на поверхности твердых тел, как полагают, связано с несколькими факторами, в том числе электростатических и гидрофобных сил среди боковых цепей белков и реактивного групп тж 13.
Процесс адсорбции белка был исследован ряд подходов, таких как кварц кристалл микровесов 28,29, электронной микроскопии, 33,34 эллипсометрии, 35 флуоресцентные маркировки, 36 и ПланаГ поляризации интерферометрии (ИЦП). 37 В отличие от этого, одного нанопор и нанопор массив методология опирается на обнаруживаемые одноканальный текущего изменения, вызываемые взаимодействием между отдельными белками аналитов и интерьер нанопор.
Наиболее важным шагом в достижении положительных результатов надлежащего смачивания интерьера нанопор. Если поры характеристики не соответствуют спецификации обсуждаются в разделе результатов, некоторые способы устранения неполадок могут быть использованы. Переходный ток блокад, которые происходят без каких-либо белков в растворе может означать, что камера загрязнена. Тефлон палаты могут быть вымыты с пираний. PDMS камеры должны быть сделаны из экологически чистых свежих пресс-формы для каждого эксперимента. Нанопоры с меньшими, чем ожидалось, проводимость и нелинейные I / V характеристики могут указывать на смачивание безуспешными. Краткое применения высокого напряжения (~ 5 В) может улучшить электрические характеристики нанопор.В противном случае нанопор следует мыть снова пираньи решение. Даже в лучшем случае, некоторые нанопор не в мокрых должным образом. Способность к влажному нанопор зависит от ее размеров. Оба тоньше нитрида нанопор и больше нанопор диаметром легче, чем толще мокрой нитрида нанопор или меньше нанопор диаметром. Для 20 нм нанопор с радиусом 5 нм успеха составляет около 70% после первого мытья. Следует проявлять осторожность при выборе размера нанопор для аналита, так как нанопор должен быть достаточно большим, чтобы приспособить белка.
Протокол обсуждается здесь относится только к адсорбции на поверхности нитрида кремния. Другие поверхности, такие как оксид кремния или алюминия 9 23 может быть пробурена с помощью этой техники, однако количество тонких пленок поддаются этой техники ограничивается теми, которые могут быть изготовлены так, чтобы они свободно стоящих, тонкие и без отверстий . Чтобы решить эту проблему, глemical покрытие нанопор могут быть использованы 23,38-40. Другой компромисс единой технике нанопор, что он может смотреть только на одну молекулу за один раз. Чтобы преодолеть это ограничение, мы предложили альтернативу с использованием параллельных массивов полупроводниковых нанопор 41. Текущий измерений с нанопор массивы обеспечивают возможность получения макроскопических кинетических параметров, таких, как очевидно реакция первого порядка константы скорости поглощения и десорбции. Кроме того, этот подход позволит определения постоянной Ленгмюра адсорбции. Одним из непосредственных ограничением этого метода является его неспособность собирать информацию на плоских и широких поверхностей. Измерения будет пытаться определить только адсорбции белка в ограниченном пространстве интерьера сфабрикованы полупроводниковых нанопор. Во многих случаях это довольно сложно получить точную информацию о геометрии и внутренней поверхности нанопор. В прошлом адсорбции белка широко изучитьд в кристалле кварца микровесов 28,29. Белка адсорбции на поверхности кристалла сопровождается увлажнения наложенных колебательное движение кристалл микровесов, производя снижение резонансной частоты. Изменение общего связанной массы за счет адсорбции белка вызывает сдвиг частоты кварцевых микровесов кристалла. Общая адсорбированных белковой массы линейно связана с частотой смены. Это основной принцип этой техники, что косвенно зондов белка адсорбции на четко определенных плоской поверхности. С другой стороны, использование массива нанопор работают активно-импульсной техники, который очень похож на подход Coulter счетчика 42. Опять же, нанопор техника может быть уменьшено, чтобы ограниченное число нанопор в мембране, так что отдельные адсорбции можно наблюдать в реальном времени. В отличие от кварцевых микровесов кристалла, нанопор измерения могут не ослы процесс адсорбции на крупных иплоской поверхности, в которой дополнительные события могут произойти (то есть, латеральная диффузия адсорбированных белков), создав тем самым изменения в изотерм адсорбции Ленгмюра. Конечно, желательно, чтобы эти подходы посвящена адсорбции белка должны использоваться в сочетании друг с другом, так как они зонд лишь некоторые аспекты процесса адсорбции. Например, Брюэр и его коллеги использовали сочетание кварцевых микровесов кристалла и ζ-потенциал методов, чтобы показать, что BSA обязательными на наночастицы золота и золотые поверхности происходит за счет электростатического механизма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Джона Grazul (Cornell University), Андре Marziali (Университет Британской Колумбии в Ванкувере) и Винсент накидка-Косса (Университет Оттавы) за их советы. Эта работа частично финансируется за счет грантов от Национального научного фонда США (DMR-0706517 и DMR-1006332) и Национального института здоровья (R01-GM088403). Бурение нанопор была выполнена на электронно фонда микроскопия Корнельского центра исследований материалов (CCMR) при поддержке Национального научного фонда - Материалы Научные исследования и инженерные центры (MRSEC) программы (ПМР 0520404). Подготовка мембраны из нитрида кремния была выполнена в Корнельском наноразмерных фонда, член Национального сетевой инфраструктуры нанотехнологий, которая при поддержке Национального научного фонда (грант ECS-0335765).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
| 20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI Supplies | 4163SN-BA | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
| silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
| SPC Technology, D sub contact, pin | Newark Inc | 9K4978 | For electrodes |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
| hot plate | Fisher Scientific | ||
| Faraday cage |
References
- Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
- Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
- Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).
- Branton, D. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).
- Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).
- Peng, H., Ling, X. S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).
- Zhao, Q. Detecting SNPs using a synthetic nanopore. Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).
- Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).
- Sexton, L. T. Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor. J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).
- Martin, C. R., Siwy, Z. S. Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores. Science. 317, 331-332 (2007).
- Sexton, L. T. An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing. J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).
- Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface. J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).
- Han, A. Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores. Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).
- Han, A. Sensing protein molecules using nanofabricated pores. Appl. Phys. Lett. 88, (2006).
- Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore. Appl. Phys. Lett. 91, (2007).
- Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis. Nano. Lett. , (2010).
- Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. Data analysis of translocation events in nanopore experiments. Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).
- Oukhaled, A. Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force. ACS. Nano.. , (2011).
- Yusko, E. C. Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls. Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).
- Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).
- Wanunu, M., Meller, A. Chemically modified solid-state nanopores. Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).
- Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore. Biophys. J. 85, 897-910 (2003).
- Aksimentiev, A. Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore. Nanoscale. 2, 468-483 (2010).
- Timp, W. Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life. IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).
- Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry. J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).
- Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes. J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).
- Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).
- Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy. Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).
- Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events. J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).
- Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin. Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).
- Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips. Scanning. 21, 394-397 (1999).
- Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures. Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).
- Giannoulis, C. S., Desai, T. A. Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films. J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).
- Gustavsson, J. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications. J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).
- Shirshov, Y. M. Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface. Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).
- Chen, P. Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores. Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).
- Siwy, Z. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).
- Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore. Anal. Chem. , (2009).
- Kim, M. -J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).
- Bezrukov, S. M. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).
