Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Overvåking Protein Adsorpsjon med Solid-state nanopores

Published: December 2, 2011 doi: 10.3791/3560
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physics, Syracuse University

Summary

En metode for å bruke solid-state nanopores å overvåke non-spesifikk adsorpsjon av proteiner på et uorganisk overflaten er beskrevet. Metoden benytter resistive-pulsen prinsippet, noe som åpner for adsorpsjon å bli analysert i sanntid og på enkelt-molekyl nivå. Fordi prosessen med singel protein adsorpsjon er langt fra likevekt, foreslår vi ansettelse av parallelle rekker av syntetiske nanopores, slik for kvantitativ måling av den tilsynelatende første orden reaksjon hastighetskonstanten av protein adsorpsjon samt og Langmuir adsorpsjon konstant.

Abstract

Solid-state nanopores har blitt brukt til å utføre målinger på enkelt-molekyl nivå for å undersøke den lokale struktur og fleksibilitet av nukleinsyrer 1-6, utfoldelsen av proteiner 7, og Bindingsaffinitet av forskjellige ligander 8. Ved kobling disse nanopores til resistive-pulsen teknikk 9-12, kan slike målinger gjøres under en rekke forutsetninger og uten behov for merking 3. I den resistive-puls teknikk, er en ionisk salt løsning introdusert på begge sider av nanopore. Derfor er ioner drevet fra den ene siden av kammeret til den andre ved et anvendt transmembrane potensial, som resulterer i en jevn strøm. Den oppdeling av en analytt i nanopore forårsaker en veldefinert avbøyning i denne strømmen, som kan analyseres for å trekke single-molekyl informasjon. Ved hjelp av denne teknikken kan adsorpsjon av single proteiner til nanopore veggene overvåkes under et bredt spekter avforhold 13. Protein adsorpsjon vokser i betydning, fordi som microfluidic enheter krympe i størrelse, blir samspillet mellom disse systemene med én proteiner en bekymring. Denne protokollen beskriver en rask test for protein binding til nitride filmer, som lett kan utvides til andre tynne filmer mottagelig for nanopore boring, eller å functionalized nitride overflater. En rekke proteiner kan utforskes under et bredt spekter av løsninger og denaturering forhold. I tillegg kan denne protokollen brukes til å utforske mer grunnleggende problemer ved hjelp nanopore spektroskopi.

Protocol

1. Produksjon av solid-state nanopores i silisiumnitrid membraner

  1. Ta med FEI Tecnai F20 S / TEM til en akselerasjon spenning på 200 kV. Hvis du bruker en annen S / TEM, bør akselerasjonen spenningen være større enn eller lik 200 kV 9
  2. Load en 20 nm tykk SPI silisiumnitrid vindu rutenett i TEM prøven holderen og ren med oksygen plasma i 30 sekunder for å fjerne eventuelle forurensninger fra holderen.
  3. Load prøven inn i S / TEM og la for vakuum til å pumpe ned. Når S / TEM har pumpet ned til vakuum, finne nitride vinduet i lyse-feltet TEM-modus ved å se etter en lysende firkant på Ronchigram. Kontroller at TEM er riktig justert, deretter justere og fokus prøven.
  4. Slå S / TEM inn STEM modus. Bruk HAADF (eller tilsvarende) detektor til bilde prøven og sørg for at den er riktig justert.
  5. Sett monokromator til en lav verdi. En lavere verdi på monokromator tillater en større valutat av elektroner tilgjengelig for boring. Hvis S / TEM ikke har monokromator, ignorere dette trinnet.
  6. Velg et passende sted størrelse for å bore nanopore. Dette tilsvarer diameteren på elektron probe. En 3 nm probe fungerer godt for boring 5 nm diameter porene. En større probe (5 nm) vil bore raskere og skape et større pore. En mindre probe (1 nm) vil ta lenger tid å bore og skape en mindre pore.
  7. Juster STEM justeringer, om nødvendig.
  8. Fokuser nitride membran og bringe den til en forstørrelse på x1.3M. Fin fokus bør gjøres ved å overvåke Ronchigram.
  9. Hvis det er noen bevegelse av prøven, og deretter vente på prøven å stabilisere. Dette kan ta opptil en time. Blank elektronstrålen mens du venter for ikke å skade nitride.
  10. Plasser elektronet sonde på prøven og begynne boring.
  11. Regelmessig sjekke prøven ved å skanne med HAADF detektor, både for å sørge for at nanopore blir drilled (det vil se ut som en mørk flekk) og kontrollere at det ikke er noen bevegelse av prøven. Dersom prøven driver litt, justere plasseringen av elektronet probe å være over nanopore.
  12. Se Ronchigram å identifisere når pore har dannet. Når du er i fokus, har nitride filmen en skinnende utseende. Dette vil forsvinne når nanopore former. Sette Ronchigram litt ute av fokus tillater en å se en Fresnel utkant forbundet med nanopore.
  13. Ta et bilde av nanopore med HAADF.
  14. Har en intensitet profil nanopore bildet. Diameteren på nanopore kan estimeres ved den mørkeste delen av profilen.
  15. Utvidelse av nanopore kan utføres ved å flytte elektronet sonden langs kantene av pore.
  16. Når nanopore er av den ønskede diameter, sette S / TEM i TEM-modus.
  17. Bring monokromator til standard innstilling og bilde nanopore bruke lyse-feltet TEM å bekrefte størrelsen

2. Wetting av solid-state nanopore

  1. De-gass de-ionisert vann som inneholder 1 M KCl, 10 mM kaliumfosfat, 7,4 pH. Dette kan gjøres ved å sette løsningene under vakuum og plassere dem i et bad sonicator i 20 minutter.
  2. Plasser nanopore inneholder silisiumnitrid chip inn i en 10 ml Pyrex begerglass. Pass på å ikke bryte nitride vinduet som det er svært delikat. Plasser begerglasset på en kokeplate i et avtrekksskap, og satt til 100 ° C.
  3. Rengjør nanopore chip med piraja løsning med stor forsiktighet. Først legge 3 ml svovelsyre til beholderen med en glass pipette. Deretter tilsett forsiktig 1 ml hydrogen peroxide til svovelsyre for å gjøre piraja løsning 14. Vennligst ta alle forholdsregler.
  4. La nanopore chip til å suge i piraja løsning for 10 minutter.
  5. Fjern piraja løsningen fra begerglasset med en glass pipette. Sett det inn i en skikkelig lagring beholder.
  6. Fill begeret med den de-gasset, de-ionisert vann med et rent glass pipette. Tøm beger med vann og gjenta minst 5 ganger.
  7. Fjern nanopore chip med ren pinsett og tørk det av lys sugeeffekt
  8. Umiddelbart, forsegle nanopore chip inn i kammeret (Fig. 2a, 2b). Brikken kan festes i kammeret ved O-ringer eller silikon fugemasse.
  9. Fyll kammeret med KCl løsning
  10. Koble Ag / AgCl elektroder til kammeret (Fig. 2b). Elektroder kan gjøres ved å dyppe sølv wire i blekemiddel over natten.
  11. Påfør en transmembrane potensial på tvers av elektroder og overvåke den nåværende responsen ved hjelp av en Axon 200B patch-clamp forsterker i spenning-klemme-modus.
  12. Konstruer en I / V (strøm-spenning) kurve fra målingene. I / V kurve bør være svært lineær når man bruker en M KCl (Fig. 3). Ledningsevne av nanopore bør tilsvare diameter. Hvis nanopore ikke vise enlineær I / V kurve, er konduktans for lavt, eller den åpne strømmen til nanopore ikke er stabil (Fig. 4a), betyr det at nanopore ikke er riktig fuktet og piraja vask bør gjentas.

3. Overvåking protein adsorpsjon

  1. Det er kritisk viktig å utføre kontroll eksperimenter med en single-nanopore membran eller parallell rekke nanopores (se nedenfor) for å overvåke den nåværende med buffer forholdene mangler proteinet prøven. Vi anbefaler følgende to trinn: (i) bruk av en høy renhet nivå buffer (renhet> 99,9%; kromatografi-klassetrinn), og (ii) bruk av en buffer hvis interaksjon med solid-state nanopore ikke produsere enkanals hendelser. I tillegg anbefaler vi å oppnå en høy renhet protein prøven ved hjelp av standard protein kjemi prosedyrer. Renheten av proteinet prøven bør kontrolleres av natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid (SDS-PAGE) gel analyse og høy oppløsning mass spektrometri 15.
  2. Legg til en renset utvalg av protein til å bli studert i jordet bath av kammeret. Sett av tid for prøven til diffuse hele badet. Typiske konsentrasjoner av protein som kan måles er i titalls nM til mM rekkevidde 7,15-21.
  3. Påfør en transmembrane potensiell spenning bias med polariteten motsatt av den totale kostnad av proteinet som studeres. For eksempel har BSA en effektiv netto negativ ladning ved pH 7,4, og dermed en positiv spenning bias bør anvendes. Spenningen skaper potensial gradient innenfor nanopore interiør og proteiner av motsatte ladninger vil bli drevet av motsatte krefter. Kun spenning polariteten som driver proteiner inn i nanopore vil skape målbare signaler.
  4. En anvendt potensial i størrelsesorden 200 mV bør være stor nok til å observere mest protein analytter. Hendelser vises som forbigående nåværende nedbøyninger fra grunnlinjen (Fig. 4b).Hvis ingen signal er observert, øke konsentrasjonen av protein i kammeret. Høyere spenninger bedre signal til støyforhold. Nitride nanopores tåler flere volt.
  5. Protein adsorptions vises som langlivede endringer i referansebanen strøm av nanopore (fig 4c).

Fire. Muligheter for funksjonalisering av nanopores

Det finnes flere metoder for å søke funksjonelle grupper silisiumnitrid 22,23. De fleste nitride filmer har et tynt oksid lag på utsiden og eksponering for ozon kan opprette en ekstra oksidsjiktet, om nødvendig. Ulike organosilanes kan brukes og selv-montert på slike lag. Av spesiell interesse er aminosilane, som selv-samler og kan endres ytterligere (dvs. karboksylsyre og aldehyder), noe som åpner for inspeksjon av en rekke organiske overflater. Etter en nanopore har blitt vasket med piraja og sikret i chamber, kan amin legges direkte til kammeret bad med en støttende elektrolytt på 0,5 M TBACl (Tetrabutylammonium) og vannfri MeOH (metanol) som brukes som løsemiddel. Monolayer dannelse kan overvåkes ved bruk av en 400 mV spenning bias og måling av dagens slipp 23.

5. Fastsettelse av den tilsynelatende første orden reaksjon hastighetskonstanten og Langmuir adsorpsjon konstant bruk parallelt nanopore arrays

5.1 Den tilsynelatende første-ordens reaksjon hastighetskonstanter for absorpsjon og desorpsjon

Vi understreker at det positive aspektet ved denne metoden er dens evne til å observere individuelle adsorptions på enkelt-molekyl nivå. Den single-molekyl målinger av protein adsorpsjon på en uorganisk overflaten kan skaleres opp ved å ansette parallelle rekker av solid-state nanopores. Parallellen rekke nanopores er nødvendig på grunn av behovet for å analysen mange porene å få pålitelig statistikks. For dette formål, vil bruk av en nanopore array tillate overvåking av individuelle adsorptions samt måling av flere hendelser for videre analyse. En rekke nanopores i silisiumnitrid kan dannes ved ovennevnte protokoll simpelthen ved å bore flere hull i prøven. Hver nanopore bør være av samme størrelse. Matriser med nanopores av 6x6 eller 7x7 bør være tilstrekkelig. Ved tilførsel av protein analytt i kammeret, vil den nåværende forråtnelse i en eksponentiell måte med følgende uttrykk:

Jeg t = Jeg ∞ - (I ∞ - I 0) exp (-k 't)

Her jeg t, betegner den nåværende på en eksperimentell tiden t. I 0 er den opprinnelige strøm passerer gjennom nanopore array. Jeg ∞ indikerer gjeldende ved metning nivå (dvs. uendelig). K 'er den tilsynelatende første orden reaksjonshastigheten konstant, som kan bestemmes fra the tilpasning av den eksperimentelle kurven. En større k 'kan tolkes som en raskere adsorpsjon rate. Forholdet jeg ∞ / I 0, også kalt normaliserte metning gjeldende, er en dimensjonsløs tall mellom 0 og 1. Denne parameteren er et mål på belegg av adsorbert protein analytter. Derfor bør hver distinkt eksperimentelle tilstanden være assosiert med to spesifikke utdataparametre jeg ∞ / I 0 og k '.

Det bør bemerkes at den tilsynelatende første orden adsorpsjon hastighetskonstanter og normaliserte strømmer er påvirket av den effektive tiden som brukes av proteiner i nanopores. Denne gangen er avhengig av konsentrasjonen av protein analytter i bulk vannfasen 24. Derfor trenger ekstra korrigering av disse tallene til å bli gjennomført basert på effektiv tidsbruk av proteiner i nanopore interiøret. Vi foreslår å måle frekvensen av FASt (translokasjon) events og multiplisere det med gjennomsnittlig holdetid av slike hendelser. Dette vil gi den gjennomsnittlige tiden av proteiner brukt innenfor de nanopore interiøret per tidsenhet.

Hastighetskonstanten av desorpsjon kan bestemmes ved hjelp av en parallell rekke nanopores også. Så snart dagens nivå når metning (I ∞), bør spenningen reverseres, slik at ikke flere proteiner er fanget inn i nanopores. Desorpsjon av individuelle proteiner vil bli ledsaget av endring av de registrerte aktuelle mot større verdier. Hastighetskonstanten blir da ekstrahert fra oppgangen i dagens nivå.

5.2 Langmuir adsorpsjon konstante

Absorpsjon av protein analytter på uorganiske overflater av nanopores er avhengig av protein konsentrasjon i vannfasen. Dette fenomenet har allerede blitt observert på enkelt-molekyl nivå 13. Dersom θ representerer er den normaliserte saturation nåværende (I ∞ / I 0), deretter en typisk Langmuir isotermen ligningen er gitt ved følgende uttrykk:

Figur 5.2

der C er protein konsentrasjon i vannfasen. α er Langmuir adsorpsjon konstant. Denne konstante øker med en økning i forpliktende energi av adsorpsjon og med en nedgang i temperaturen. Samlingen av θ datapunktene vil ansette målinger med parallelle matriser utføres på ulike protein konsentrasjoner i vannfasen. Data skal analyseres i kombinasjon med andre teknikker for å bekrefte omfanget av montert Langmuir adsorpsjon konstant. I tillegg kan full-atomistisk molekylær dynamikk simuleringer 25,26 også brukes til å hjelpe tolkninger av innhentet eksperimentelle data.

title "> 6. Representative Resultater

Typiske resultater for solid-state nanopores vil være som følger. Den åpne porer nåværende bør være svært stabile, som vist i fig. 4a. I / V egenskaper nanopore bør være svært lineær i 1 M KCl, 10 kaliumfosfat, 7,4 pH, som vist i fig. 2. Stigningstallet for en lineær tilpasning til I / V kurve vil gi enhetlig ledningsevne av nanopore. Konduktans har en direkte relasjon til nanopore diameter og skal samsvare ligningen: Figur ligningen , Hvor G er konduktans av nanopore, er d dens diameter, er l dens lengde, og σ er ledningsevnen i løsningen i kammeret 14. Denne verdien bør samsvare innenfor 30%. Hvis det er for liten, er pore sannsynligvis ikke våte. Med tillegg av protein, bør raske events ensue, som vist i fig. 4b. Protein adsorpsjon er en langlivet dagens slipp som vist i fig. 4c. Noen proteiner er svært labil og gjennomgår strukturell transformasjon innenfor pore interiøret. I dette tilfellet vil den langlivede spenningsfallet være ledsaget av raske svingninger.

Figur 1
Figur 1. Solid-state nanopore fabrikkert ved hjelp av en Tecnai F20 S / TEM. Pore ​​ble boret i STEM modus til en diameter på 20 nm. Bildet ble tatt i lyse-feltet TEM-modus. Nitride var 30 nm tykt.

Figur 2
Figur 2. Chamber brukes til bolig ett solid-state nanopore i resistive-puls målinger. A) Chamber og en silisium chip med frittstående nitride vindu (TEM rutenett). Den nanopore er boret inn i nitride før lasting. Red O-ringer brukes til å danne et gode sEAL om chip, som skiller to bad av ioniske løsning. B) Skjematisk av kammeret som viser plassering av løsningen bad og elektroder med hensyn til nanopore.

Figur 3
Figur 3. Typiske I / V spor for solid-state nanopores av forskjellige diametre. Enkanals elektriske spor ble tatt i en M KCl, 20 mM Tris, 8,5 pH. Nanopores ble boret på 30 nm tykk silisiumnitrid. Merk nitride tykkelse vil påvirke den enhetlige ledningsevne av nanopore.

Figur 4
Figur 4. Målt enkanals dagens spor og påvisning av protein adsorpsjon. A) En enkelt-kanals elektriske spor som viser åpne strøm av en 10 nm diameter nanopore. B) Nåværende nedbøyninger representerer oppdeling av bovint serum albumin (BSA) i interIOR av nanopore. C) Adsorpsjon av BSA på nitride overflaten. Alle spor er fra samme nanopore i 1 M KCl, 10 mM kaliumfosfat, 7,4 pH. Den anvendte transmembrane potensialet var 40 mV og BSA ble lagt til jordet kammer badet i en konsentrasjon på 120 nM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spontan adsorpsjon av proteiner på solid-state overflater 27-29 er fundamentalt viktig i en rekke områder, slik som biochip applikasjoner og design av en ny klasse av funksjonelle hybrid biomaterialer. Tidligere studier har vist at proteiner adsorberes til solid-state overflater ikke viser lateral mobilitet eller signifikant desorpsjon priser, og derfor protein adsorpsjon er generelt ansett som en irreversibel og ikke-spesifikk prosess 30-32. Protein adsorpsjon på solid state overflater antas å skyldes flere faktorer, inkludert elektrostatiske og hydrofobe krefter blant sidekjeder av proteiner og reaktive grupper på solid-væske grensesnitt 13.

Prosessen med protein adsorpsjon har blitt utforsket av flere tilnærminger, slik som kvartskrystall mikrovekt 28,29, elektronmikroskopi, 33,34 ellipsometry, 35 fluorescerende merking, 36 og planar polarisering interferometri (PPI). 37 I motsetning baserer denne single-nanopore og nanopore array metodikk på påvisbare enkanals aktuelle endringer produsert av samspillet mellom single-protein analytter og nanopore interiør.

Den mest kritiske trinnet i å oppnå positive resultater er riktig wetting av nanopore interiøret. Skulle pore egenskaper ikke oppfyller spesifikasjonene diskutert i resultatene delen, kan flere feilsøking metoder benyttes. Forbigående nåværende blokader som inntreffer uten noen proteiner i løsningen kan tyde på at kammeret er forurenset. Teflon kamre kan vaskes med piraja. PDMS kamre bør gjøres fersk fra rene former for hvert forsøk. Nanopores med mindre enn forventet konduktans eller ikke-lineær I / V egenskaper kan tyde på at wetting er mislykket. En kortfattet søknad med høy spenning (~ 5V) kan forbedre de elektriske egenskapene til nanopore.Ellers bør nanopore vaskes igjen med piraja løsningen. Selv i de beste forhold, noen nanopores ikke våt riktig. Evnen til å våte en nanopore avhenger dens dimensjoner. Både tynnere nitride nanopores og større diameter nanopores er lettere å våt enn tykkere nitride nanopores eller mindre diameter nanopores. For 20 nm tykk nanopores med en radius på 5 nm suksessraten er ca 70% etter første vask. Forsiktighet bør utvises i å velge en nanopore størrelse for analytten, siden nanopores må være store nok til å imøtekomme protein.

Protokollen diskutert her gjelder kun for adsorpsjon til en silisiumnitrid overflate. Andre overflater, slik som silisiumoksid 9 eller alumina 23. mai også bli boret ved hjelp av denne teknikken, men antall tynne filmer mottagelig for denne teknikken er begrenset til de som kan produseres slik at de er frittstående, tynn og uten hull . For å overvinne dette problemet, chemical belegget på nanopore kan brukes 23,38-40. En annen avveining av singelen nanopore teknikken er at den bare kan se på ett molekyl om gangen. For å overkomme denne begrensningen, tilbød vi et alternativ å bruke parallelle rekker av solid-state nanopores 41. Strømmålinger med nanopore matriser gir en mulighet til å skaffe makroskopiske kinetiske parametre, slik som den tilsynelatende første orden reaksjon hastighetskonstanter av absorpsjon og desorpsjon. I tillegg vil denne tilnærmingen tillate fastsettelse av Langmuir adsorpsjon konstant. En umiddelbar begrensning av denne teknikken er dens manglende evne til å samle inn informasjon om flate og brede overflater. Målingene vil bare sondere protein adsorpsjon innenfor avgrensede områder av interiøret i den fabrikkerte solid-state nanopores. I mange tilfeller er det ganske utfordrende å få presis informasjon om geometri og den indre overflaten av nanopore. I det siste, var protein adsorpsjon omfattende undersøked ved kvartskrystall mikrovekt 28,29. The protein adsorpsjon på krystallen overflaten er ledsaget av en demping av pålagt oscillasjon bevegelse av krystall mikrovekt, produserer en nedgang i resonansfrekvensen. En endring av den totale koblet masse pga protein adsorpsjon induserer en frekvens forskyvning av kvartskrystall mikrovekt. Den totale adsorbert proteinmasse er lineært relatert til frekvensen skift. Dette er det underliggende prinsippet om denne teknikken, som indirekte prober protein adsorpsjon på en veldefinert flat overflate. I kontrast, sysselsetter bruken av nanopore arrays den resistive-pulsen teknikk som er nært ligner på Coulter counter tilnærmingen 42. Igjen kan nanopore teknikken bli skalert ned til et begrenset antall nanopores i en membran, slik at individuelle adsorptions kan bli overvåket i sanntid. I motsetning til kvartskrystall mikrovekt, den nanopore målinger kan ikke bedømme adsorpsjon prosessen på en stor skala ogflat overflate, der flere hendelser kan forekomme (dvs. lateral diffusjon av adsorbert proteiner), og dermed produsere endringer i Langmuir adsorpsjon isotermer. Selvfølgelig er det ønskelig at disse tilnærmingene viet til protein adsorpsjon bør brukes i kombinasjon med hverandre, siden de probe bare noen aspekter av adsorpsjon prosessen. For eksempel, Brewer og kolleger ansatt en kombinasjon av kvartskrystall mikrovekt og ζ-potensial teknikker for å vise at BSA binding på gull nanopartikler og gull overflater skjer via en elektrostatisk mekanisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke John Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia i Vancouver) og Vincent Tabard-Cossa (The University of Ottawa) for deres råd. Dette arbeidet er finansiert delvis med tilskudd fra det amerikanske National Science Foundation (DMR-0706517 og DMR-1006332) og National Institutes of Health (R01-GM088403). Den nanopore Boringen ble utført ved Elektronmikroskopi Facility av Cornell Center for Materials Research (CCMR) med støtte fra National Science Foundation - Materials Research Science and Engineering Centers (MRSEC) program (DMR 0.520.404). Utarbeidelsen av silisiumnitrid membranene ble utført ved Cornell nanoskala Facility, et medlem av National Nanoteknologi Infrastructure Network, som er støttet av National Science Foundation (Grant ECS-0335765).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tecnai F20 S/TEM FEI S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source.
20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM SPI Supplies 4163SN-BA
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices
Axon Digidata 1440A Molecular Devices
pCLAMP 10 software Molecular Devices Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software
Sulfuric Acid Fisher Scientific A300
hydrogen peroxide Fisher Scientific H325
silicone O-rings McMaster-Carr 003 S70 Alternatively use PDMS
silver wire Sigma-Aldrich 348759 For electrodes
SPC Technology, D sub contact, pin Newark Inc 9K4978 For electrodes
potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P2222
potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5379
PDMS Dow Corning Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber.
Kwik-Cast Sealant World Precision Instruments, Inc. KWIK-CAST Fast acting silicone sealant
hot plate Fisher Scientific
Faraday cage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
  2. Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
  3. Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).
  4. Branton, D. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).
  5. Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).
  6. Peng, H., Ling, X. S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).
  7. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).
  8. Zhao, Q. Detecting SNPs using a synthetic nanopore. Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).
  9. Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).
  10. Sexton, L. T. Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor. J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).
  11. Martin, C. R., Siwy, Z. S. Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores. Science. 317, 331-332 (2007).
  12. Sexton, L. T. An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing. J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).
  13. Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface. J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).
  14. Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).
  15. Han, A. Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores. Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).
  16. Han, A. Sensing protein molecules using nanofabricated pores. Appl. Phys. Lett. 88, (2006).
  17. Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore. Appl. Phys. Lett. 91, (2007).
  18. Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis. Nano. Lett. , (2010).
  19. Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. Data analysis of translocation events in nanopore experiments. Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).
  20. Oukhaled, A. Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force. ACS. Nano.. , (2011).
  21. Yusko, E. C. Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls. Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).
  22. Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).
  23. Wanunu, M., Meller, A. Chemically modified solid-state nanopores. Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).
  24. Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore. Biophys. J. 85, 897-910 (2003).
  25. Aksimentiev, A. Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore. Nanoscale. 2, 468-483 (2010).
  26. Timp, W. Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life. IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).
  27. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry. J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).
  28. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes. J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).
  29. Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).
  30. Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy. Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).
  31. Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events. J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).
  32. Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin. Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).
  33. Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips. Scanning. 21, 394-397 (1999).
  34. Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures. Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).
  35. Giannoulis, C. S., Desai, T. A. Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films. J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).
  36. Gustavsson, J. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications. J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).
  37. Shirshov, Y. M. Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface. Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).
  38. Chen, P. Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores. Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).
  39. Siwy, Z. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).
  40. Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore. Anal. Chem. , (2009).
  41. Kim, M. -J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).
  42. Bezrukov, S. M. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).

Tags

Bioteknologi Solid-state nanopore S / TEM single-molekyl biofysikk protein adsorpsjon resistive-puls teknikk nanopore spektroskopi
Overvåking Protein Adsorpsjon med Solid-state nanopores
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L.… More

Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560, doi:10.3791/3560 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter