Summary
Inorganik bir yüzeye proteinlerin non-spesifik adsorpsiyon izlemek için solid-state nanopores kullanarak bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak ve tek-molekül düzeyinde probed olması adsorpsiyon için izin, rezistif-pulse prensibi kullanmaktadır. Tek bir protein adsorpsiyon süreci denge noktasından uzak olduğu için, kantitatif protein adsorpsiyonu sabit görünen birinci dereceden reaksiyon hızı belirlenmesi yanı sıra ve Langmuir adsorpsiyon sabit sağlayan sentetik nanopores paralel diziler istihdam teklif.
Abstract
Solid-state nanopores tek-molekül düzeyinde, nükleik asitlerin yapısını ve esnekliğini 1-6, proteinler 7 açılımına ve değişik ligandlar 8 afinitesi incelemek için ölçümler yapmak için kullanılmaktadır . 9-12 rezistif-pulse tekniği bu nanopores kaplin, bu ölçümler çok çeşitli koşulları altında ve etiketleme 3 için gerek kalmadan yapılabilir. Rezistif-pulse tekniği, iyonik bir tuz çözeltisi nanopore iki tarafta tanıtıldı. Bu nedenle, iyonlar, sürekli bir akım uygulanan bir transmembran potansiyel odasının bir tarafı diğerine tahrik edilmektedir. Nanopore içine bir analitin bölümleme, tek-molekül bilgileri ayıklamak için analiz edilebilir, bu akımı iyi tanımlanmış bir sapma neden olur. Bu tekniği kullanarak, nanopore duvarlara tek proteinlerin adsorpsiyon geniş bir yelpazede altında izlenebilirkoşulları 13. Mikroakışkan cihazların boyutu küçültmek gibi, bu sistemlerin tek proteinleri ile etkileşimi bir endişe olur çünkü protein adsorpsiyonu, önemi de büyüyor. Bu protokol, diğer ince filmler, nanopore delme mükellef veya Fonksiyonlu nitrür yüzeylere kolayca uzatılabilir nitrür filmler, bağlayıcı protein için hızlı bir tahlil açıklamaktadır. Proteinlerin çeşitli geniş bir yelpazede çözümler ve denatüre koşulları altında incelenebilir. Ayrıca, bu protokol nanopore spektroskopi kullanarak daha fazla temel sorunları keşfetmek için kullanılıyor olabilir.
Protocol
1. , Silisyum nitrür membranlar solid-state nanopores üretimi
- 200 kV bir ivme gerilimi FEI Tecnai F20 S / TEM getirin. Farklı bir S / TEM kullanıyorsanız, ivme gerilimi 200 kV 9 eşit veya daha büyük olmalıdır
- 20 nm kalınlığında SPI silisyum nitrür pencere ızgara TEM numune tutucu içine yerleştirin ve 30 saniye boyunca oksijen plazma ile temiz sahibinden herhangi bir kirleri çıkarmak için.
- S / TEM örnek Yük ve aşağı pompa vakum izin verir. S / TEM vakum aşağı pompalanır sonra, parlak bir kare için Ronchigram bakarak aydınlık alan TEM modu nitrür penceresi bulabilirsiniz. TEM düzgün takıldığından emin olun, sonra hizaya getirin ve örnek odaklanma.
- S / TEM KÖK moduna geçin. Örnek görüntü HAADF (veya eşdeğer) detektörü kullanın ve düzgün takıldığından emin olun.
- Monokromatör düşük bir değere ayarlayın. Monokromatör daha düşük bir değer daha yüksek bir para birim sağlardelme için elektron t. S / TEM Monokromatör yoksa, bu adımı görmezden gelebilirsiniz.
- Nanopore sondaj için uygun bir nokta boyutunu seçin. Bu elektron prob çapı karşılık gelir. 3 nm prob 5 nm çaplı gözenekler delmek için iyi çalışır. Büyük bir prob (5 nm) daha hızlı delme ve daha büyük bir gözenek yaratacaktır. Küçük bir prob (1 nm) daha küçük bir gözenek matkap ve oluşturmak için daha uzun sürer.
- Gerekirse, KÖK hizalanmalar ayarlayın.
- Odak nitrür membran ve x1.3M bir büyütme getirmek. Güzel odaklama Ronchigram izleme yapılmalıdır.
- Örnek herhangi bir hareket varsa, o örnek stabilize etmek için bekleyin. Bu bir saat kadar sürebilir. Elektron ışını nitrür zarar vermemek için beklerken boş.
- Örnek üzerinde elektron prob ve sondaj başlayın.
- HAADF dedektörü ile tarayarak periyodik olarak numune kontrol, hem nanopore dri ediliyor emin olunlled (karanlık bir nokta gibi görünecek) ve örnek bir hareket olup olmadığını kontrol edin. Örnek biraz sürükleniyor, nanopore üzerinde elektron prob konumunu ayarlamak.
- Gözenek oluşturmuştur tanımlamak için Ronchigram izleyin. Odak, nitrür filmi ışıltılı bir görünüme sahiptir. Bu zaman nanopore formları kaybolur. Biraz odak dışı Ronchigram koymak nanopore ile ilişkili bir Fresnel saçak görmek için izin verir.
- HAADF nanopore bir görüntü çekin.
- Nanopore görüntünün bir yoğunluk profili yapın. Nanopore çapı profil karanlık bölgeye göre tahmin edilebilir.
- Nanopore Genişleme elektron prob gözenek kenarları boyunca hareket ettirerek yapılabilir.
- Nanopore istenilen çapı sonra, TEM moduna S / TEM koymak.
- Monokromatör boyutu onaylamak için aydınlık alan TEM kullanarak, standart belirleme ve görüntü nanopore getirin
2. Solid-state nanopore, Islatma
- De-gaz içeren 1 M KCl, 10 mM potasyum fosfat, pH 7.4 de-iyonize su. Bu, vakum altında çözümler koyarak ve 20 dakika boyunca banyo sonikatör yerleştirerek yapılabilir.
- 10 ml Pyrex behere nanopore içeren silisyum nitrür çipi yerleştirin. Çok hassas olduğu gibi nitrür penceresi kırmamaya özen gösterin. Davlumbaz ocak behere koyun ve 100 ° C'ye kadar ayarlı
- Nanopore çip piranha çözümü ile büyük bir özenle kullanarak temizleyin. Önce cam bir pipet kullanarak konteyner 3 ml sülfürik asit ekleyin. Sonra, dikkatle piranha çözüm 14 yapmak için 1 ml sülfürik asit, hidrojen peroksit ekleyin. Lütfen tüm tedbirleri almak.
- Nanopore çip piranha çözüm emmek için 10 dakika izin verin.
- Piranha çözüm cam bir pipet kullanarak kaptan çıkarın. Uygun bir depolama yuvasına yerleştirin.
- Fitemiz bir cam pipet kullanarak de-gaz verilerek, de-iyonize su ile beher ll. Boş su beher ve en az 5 kez tekrarlayın.
- Temiz bir cımbız ile nanopore çip ışık emme çıkarın ve kurulayın
- Hemen nanopore odası (Şekil 2a, 2b) içine çip mühür, O-ring veya silikon çip odasında güvenli olabilir .
- Odanın KCl çözeltisi ile doldurun
- Odası (Şekil 2b) Ag / AgCl elektrot bağlayın. Elektrotlar gece çamaşır gümüş tel iliklerine tarafından yapılabilir.
- Elektrotlar arasında bir transmembran potansiyeli uygulayın ve voltaj-klemp modunda bir Axon 200B patch-kelepçe amplifikatör kullanarak geçerli bir yanıt monitör.
- Ölçümlerden bir I / V (akım-gerilim) eğrisi oluşturun. 1 M KCI (Şekil 3) kullanarak I / V eğrisi son derece doğrusal olmalıdır. Nanopore iletkenlik çapına uygun olmalıdır. Nanopore görünmüyorsadoğrusal I / V eğrisi, iletkenliği çok düşük, ya da nanopore açık akım sabit değildir (Şekil 4a), düzgün nanopore ıslatılmış ve piranha yıkama tekrar edilmelidir anlamına gelir.
3. İzleme protein adsorpsiyonu
- Bu protein örneği olmayan tampon koşulları ile şimdiki izlemek için bir tek nanopore membran veya nanopores paralel dizi (aşağıya bakınız) ile kontrol deneyleri gerçekleştirmek için büyük önem taşımaktadır. Biz aşağıdaki iki adımları uygulamanızı öneririz: (i) yüksek saflık düzeyinde bir tampon kullanımı (saflık>% 99.9; kromatografisi-sınıf düzeyi), ve (ii), etkileşim, solid-state nanopore bir tampon kullanımı değildir tek kanallı olaylarını üretir. Buna ek olarak, yüksek saflıkta protein örnek standart protein kimyası prosedürleri kullanarak elde öneriyoruz. Protein örnek saflığı sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel (SDS-PAGE) analizi ve yüksek çözünürlüklü ma tarafından kontrol edilmelidirss spektrometresi 15.
- Topraklı banyo odasının içine incelenecektir arıtılmış örnek protein ekleyin. Banyo boyunca diffüz örnek için zaman tanıyın. McM aralığı 7,15-21 nM onlarca tipik protein konsantrasyonu ölçülebilir.
- Toplam çalışılan protein ücretten polarite tam tersi olan bir transmembran potansiyel gerilim önyargı uygulayın. Örneğin, BSA, pH 7.4 'de etkili bir net negatif yük vardır ve bu nedenle pozitif bir gerilim önyargı uygulanmalıdır. Uygulanan gerilim zıt güçler tarafından tahrik olacak, karşılıklı suçlamaların nanopore iç ve proteinlerin içinde potansiyel degrade oluşturur. Nanopore proteinler sürücü sadece gerilim polarizasyona ölçülebilir sinyalleri yaratacaktır.
- Uygulanan potansiyeli 200 mV büyüklükte bir çok protein analitler gözlemlemek için yeterli büyüklükte olması gerekir. Etkinlikler temel (Şekil 4b) geçici akım deplasmanlar gibi görünecektir.Hiç sinyal görülürse, oda protein konsantrasyonu artırır. Yüksek gerilimler için sinyal gürültü oranını iyileştirir. Nitrür nanopores birkaç volt dayanabilir.
- Protein Adsorpsiyon, uzun ömürlü, nanopore (Şekil 4c) temel akımı değişiklikleri gibi görünecektir.
4. Nanopores işlevsellik için Olanakları
Silisyum nitrür 22,23 fonksiyonel gruplar uygulamak için çeşitli yöntemler mevcuttur. Nitrür filmlerin çoğu ince bir oksit tabakası, dış ve ozon maruz kalma, gerekirse ek bir oksit tabakası oluşur. Farklı organosilanes katmanlar üzerine kullanılan ve kendi kendini monte edilebilir. Özellikle ilgi çekici olan, aminosilane organik yüzeylerin bir dizi inceleme için izin, öz-montaj ve daha fazla (yani, karboksilik asit ve aldehit) modifiye edilebilir. Nanopore piranha ile yıkanır ve Chambe emniyete sonrar, amin odasının banyosuna 0.5 M TBACl (tetrabutylammonium) ve çözücü olarak kullanılan susuz MeOH (metanol) destekleyici bir elektrolit ile direkt olarak ilave edilebilir. Monolayer oluşumu, 400 mV gerilim önyargı ve cereyanı 23 ölçüm uygulama tarafından takip edilebilir.
5. Belirgin birinci dereceden reaksiyon hızı sabit belirlenmesi ve paralel nanopore dizileri kullanarak sabit Langmuir adsorpsiyon
5.1 absorpsiyon ve desorpsiyon için belirgin birinci dereceden reaksiyon hız sabitleri
Biz bu metodoloji olumlu yönü tek-molekül düzeyinde bireysel Adsorpsiyon gözlemlemek kabiliyeti olduğunu vurgulamak. Protein adsorpsiyonu inorganik bir yüzeye tek-molekül ölçümleri kullanılarak solid-state nanopores paralel diziler kadar ölçeklendirilebilir. Nanopores paralel dizi güvenilir istatistik almak için tahlil birçok gözenekleri ihtiyacı nedeniyle gereklis Bu amaçla, bir nanopore dizi kullanımı, bireysel Adsorpsiyon izlenmesi yanı sıra, daha fazla analiz için birden fazla olaylar ölçümü sağlayacak. Yukarıdaki örnek sadece birden fazla delik delme protokolü tarafından oluşturulan silisyum nitrür nanopores bir dizi olabilir. Her nanopore benzer büyüklükte olmalıdır. 6x6 ya da 7x7 nanopores Diziler yeterli olmalıdır. Analit odasına protein ilavesi üzerine, mevcut aşağıdaki ifade ile, üstel bir şekilde çürümeye:
I t = I ∞ (∞ - I 0) exp (-k 't)
Burada, ben t, deneysel bir t zamanında mevcut gösterir. 0 nanopore dizi üzerinden orijinal akım geçiyor. ∞ (yani sonsuz) doygunluk düzeyinde akımı gösterir. K 'görünürdeki birinci dereceden reaksiyon hızını sabit, inci tespit edilebilire deneysel eğrinin uygun. Büyük bir k 'daha hızlı bir adsorpsiyon oranı olarak yorumlanabilir. Bu oran I ∞ / I 0, aynı zamanda, normalize doyma akımı olarak adlandırılan 0 ve 1 arasında boyutsuz bir sayıdır. Bu parametre, adsorbe protein analitler doluluk bir ölçüsüdür. Bu nedenle, her farklı deneysel durum iki spesifik çıkış parametreleri I ∞ / 0 ve k 'ile ilişkili olmalıdır.
Bu görünürdeki birinci dereceden adsorpsiyon hız sabitleri ve normalize akımları nanopores içindeki proteinler tarafından harcanan zamanı etkili etkilenen olduğunu belirtmek gerekir. Bu sefer toplu sulu faz 24 protein analitlerin konsantrasyonuna bağlıdır. Bu nedenle, bu sayıların ek düzeltme nanopore iç içindeki proteinler tarafından harcanan zamanı etkili dayanarak uygulanması gerekmektedir. Biz sülfüroz frekans ölçüm öneririzt (translokasyon) ortalama ile çarpılması olaylar ve bu olayların bekleme süresi. Bu proteinlerin birim zamanda nanopore iç içinde harcanan ortalama süre verecek.
Desorpsiyon oranı sabit, hem de nanopores paralel bir dizi kullanılarak tespit edilebilir. Mevcut düzeyi en kısa sürede doygunluk (I ∞) ulaştığında, voltaj ters olmalı, o yüzden artık proteinler nanopores içine sıkışmış. Desorpsiyon bireysel proteinlerin büyük değerler doğru kaydedilen akımının değişmesi ile eşlik edecek. Hız sabiti, daha sonra mevcut seviyesinin yükselişi çıkarılan olacaktır.
Sabit 5.2 Langmuir adsorpsiyon
Nanopores inorganik yüzeyler üzerine protein analitlerin emme sulu faz protein konsantrasyonu bağlıdır. Bu olgu, zaten tek-molekül düzeyinde 13 gözlenmiştir. Θ temsil ediyorsa s normalize doyma akımı (I ∞ / I 0), daha sonra tipik bir Langmuir izoterm denklemi aşağıdaki ifade ile verilir :
C sulu faz protein konsantrasyonu. α Langmuir adsorpsiyon sabit. Bu sabit bir artış ile adsorpsiyon bağlayıcı enerji ve sıcaklık bir azalma ile artar. Θ veri toplama noktaları, sulu faz çeşitli protein konsantrasyonları yürütülen paralel diziler ölçümler istihdam sağlayacak . Veri büyüklüğü monte Langmuir adsorpsiyon sabit doğrulamak için diğer tekniklerle birlikte analiz edilmelidir. Buna ek olarak, tam atomlarla moleküler dinamik simülasyonları 25,26 da, elde edilen deneysel veriler yorumlara yardımcı olabilir .
başlığı "> 6 Temsilcisi Sonuçlar Solid-state nanopores için tipik sonuçlar aşağıdaki gibi olacaktır. Açık gözenek akımı Şekil de görüldüğü gibi, son derece kararlı olmalıdır. 4a. Nanopore I / V özellikleri 1 M KCl 10 Şekil görüldüğü gibi potasyum fosfat, pH 7.4, yüksek doğrusal olmalıdır. 2. I / V eğrisinin doğrusal bir uyum eğimi nanopore üniter iletkenlik sağlayacak. Iletkenlik nanopore çapı doğrudan bir ilişki vardır ve denklem uymalıdır: 
L, G nanopore iletkenlik, d çapı, uzunluğu ve 14 oda çözüm iletkenliği σ. Bu değer% 30 içinde eşleşmesi gerekir. Çok küçük ise, gözenek muhtemelen ıslatılmış değildir. Protein ilavesi ile, hızlı olaylar Şekil de görüldüğü gibi, birbirini takip gerekir. 4b. Protein adsorpsiyon Şekil görüntülenir, uzun ömürlü bir akım damla. 4c. Bazı proteinler çok dayanıksız ve gözenek iç içinde yapısal değişim geçirmiştir. Bu durumda, uzun ömürlü bir gerilim düşümü hızlı dalgalanmalar eşlik edecek.
Şekil 1 Tecnai F20 S / TEM kullanılarak üretilen Solid-state nanopore. Gözenek çapı 20 nm KÖK modunda açılmış. Görüntü aydınlık alan TEM modu alınmıştır. Nitrür 30 nm kalınlığında idi.
Şekil 2. Odası rezistif-nabız ölçümleri tek bir solid-state nanopore konut için kullanılır.) Odası ve serbest duran nitrür penceresi (TEM ızgara) ile bir silikon yongası. Nanopore yüklemeden önce nitrür içine delinmiş. Red O-ring, iyi bir s oluşturmak için kullanılır.iyonik çözüm iki hamam ayıran çip hakkında eal. B) odası nanopore açısından çözüm banyoları ve elektrot yerleştirme gösteren şematik.
Şekil 3 farklı çaplarda solid-state nanopores Tipik I / V izler. Tek kanallı elektrik izlerini 1 M KCl 20 mM Tris, pH 8.5 alınmıştır. 30 nm kalınlığında silisyum nitrür Nanopores delinmiştir. Not nitrür kalınlığı nanopore üniter iletkenlik etkileyecektir.
Şekil 4 tek kanallı mevcut izleri ve protein adsorpsiyonu algılama ölçülmüştür. A) 10 nm çapında nanopore açık gösteren bir tek kanal elektrik iz. B) Cari deplasmanlar arası (BSA), sığır serum albümin bölümleme temsilnanopore IOR. C) Adsorpsiyon BSA nitrür yüzeye. 1 M KCl 10 mM potasyum fosfat, pH 7.4 de aynı nanopore tüm izleri. Uygulanan transmembran potansiyeli +40 mV ve BSA 120 nM konsantrasyonda topraklı odasının banyosuna eklendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Solid-state yüzeyler üzerine 27-29 protein spontan adsorpsiyon biochip uygulamaları ve fonksiyonel melez Biyomalzemelerin yeni bir sınıf tasarım gibi alanlarda bir dizi, temelde önemli. Önceki çalışmalar, solid-state yüzeylere adsorbe proteinler yatay hareketlilik veya önemli desorpsiyon oranlarının görünmüyor olduğunu göstermiştir ve bu nedenle protein adsorpsiyon genellikle nonspesifik ve geri dönüşü olmayan bir süreç 30-32 olarak kabul edilir. Katı hal yüzeylerinden Protein adsorpsiyon, elektrostatik ve hidrofobik yan zincirleri arasında katı-sıvı arayüzü 13 protein ve reaktif grupların güçleri de dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlı olduğu düşünülmektedir .
Protein adsorpsiyon süreci, mikro kuvars kristali 28,29, elektron mikroskobu, ellipsometry 33,34, 35 floresan etiketleme, 36 ve plana gibi yaklaşımlar, sayısına göre incelenmiştir .r kutuplaşma interferometri (ÜFE) Buna karşılık 37, bu tek nanopore ve nanopore bir dizi yöntem, tek bir protein analit ve nanopore iç arasındaki etkileşimler tarafından üretilen saptanabilir tek kanal akımı değişiklikleri dayanmaktadır.
Olumlu sonuçlar elde en kritik adım nanopore iç uygun ıslatıcı. Gözenek özellikleri sonuç bölümünde tartışılan özelliklere uymuyorsa, birkaç sorun giderme yöntemleri kullanılıyor olabilir. Herhangi bir çözüm proteinler olmadan ortaya çıkan geçici akım blokajları odanın kirli olduğunu gösterebilir. Teflon odaları piranha ile yıkanmış olabilir. PDMS odaları, her bir deney için temiz kalıpları taze yapılmalıdır. Beklenen iletkenlik veya doğrusal olmayan I / V özellikleri daha küçük Nanopores ıslatma başarısız olduğunu gösterebilir. Yüksek gerilim (5V) kısa bir uygulama nanopore elektriksel özellikleri artırabilir.Aksi takdirde, nanopore piranha çözeltisi ile tekrar yıkanmış olmalıdır. En iyi koşullarda bile, bazı nanopores düzgün ıslak başarısız olur. Nanopore ıslak yetenek boyutları bağlıdır. Nitrür nanopores daha ince ve daha büyük çaplı nanopores ıslak, kalın nitrür nanopores ya da daha küçük çaplı nanopores daha kolaydır. 5 nm çapa sahip 20 nm kalınlığında nanopores için ilk yıkamadan sonra yaklaşık% 70 başarı oranı. Nanopores protein sığabilecek büyüklükte olmalıdır Bakımı, analit için bir nanopore boyut seçtikten alınmalıdır.
Bu protokol, burada tartışılan sadece bir silisyum nitrür yüzeyine adsorpsiyonu için de geçerlidir. Silisyum oksit 9 veya 23 alümina gibi diğer yüzeyler, aynı zamanda bu tekniği kullanarak delinmiş olabilir, ancak bu tekniğe uygun ince filmlerin sayısı, serbest duran, ince ve delik olacak şekilde imal edilebilir sınırlı . Bu sorunu aşmak için kanalnanopore emical kaplama 23,38-40 kullanılıyor olabilir. Tek nanopore tekniğin başka bir sendikaya sadece bir defada bir molekül bakabilirsiniz. Bu sınırlama üstesinden gelmek için, solid-state nanopores 41 paralel diziler kullanılarak bir alternatif sundu. Nanopore dizileri ile akım ölçümleri, absorpsiyon ve desorpsiyon belirgin birinci dereceden reaksiyon hız sabitleri gibi makroskopik kinetik parametrelerini elde etmek için bir fırsat sağlar. Buna ek olarak, bu yaklaşım, Langmuir adsorpsiyon sabit belirlenmesine izin verecek. Bu teknikte hemen tek bir sınırlama, düz ve geniş yüzeylerde bilgi toplamak için onun yeteneksizliği. Ölçümler sadece fabrikasyon solid-state nanopores iç sınırlı alanlarda içinde protein adsorpsiyonu prob. Birçok durumda, geometri ve nanopore iç yüzeyi hassas bilgileri elde etmek için oldukça zordur. Geçmişte, protein adsorpsiyon yaygın olarak incelemekd kuartz kristal mikro 28,29. Kristal yüzeye protein adsorpsiyonu rezonans frekansında bir azalma üreten kristal mikro dayatılan salınım hareketi bir nemlendirme eşlik ediyor. Protein adsorpsiyonu nedeniyle toplam birleştiğinde kitlesel bir değişiklik kuartz kristal mikro bir frekans kayması neden olur. Toplam adsorbe protein kitlesi doğrusal frekans kayması ile ilgili. Bu, bu tekniğin, iyi tanımlanmış bir düz bir yüzey üzerinde dolaylı probları protein adsorpsiyonu temel ilkedir. Buna karşılık, nanopore diziler kullanımı yakından Coulter sayacı yaklaşım 42 benzer rezistif-pulse tekniği kullanmaktadır. Yine, bir zar nanopores sınırlı sayıda nanopore teknik küçülttüm olabilir, bu nedenle bireysel Adsorpsiyon gerçek zamanlı olarak izlenebilecek. Kuartz kristal mikro aksine, nanopore ölçümleri eşek adsorpsiyon süreci ve büyük ölçekte değil.Böylece ek olaylar oluşabilir düz bir yüzeye (yani adsorbe proteinlerin, lateral difüzyon), Langmuir adsorpsiyon izotermleri değişiklikler. Tabii ki, adsorpsiyon sürecinin sadece bazı yönlerini prob yılından bu yana, protein adsorpsiyonu yönelik bu yaklaşımlar birbirleri ile kombinasyon halinde kullanılması gerektiğini arzu edilir. Örneğin, Brewer ve arkadaşları, altın nanopartiküller ve altın yüzeyler üzerine bağlayıcı BSA elektrostatik bir mekanizma ile oluşur göstermek için kuartz kristal mikro ve ζ potansiyel teknikleri bir arada kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Yazarlar, onların tavsiyelerini John Grazul (Cornell Üniversitesi), Andre Marziali (Vancouver, British Columbia Üniversitesi) ve Vincent yeleği Cossa (Ottawa Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, ABD Ulusal Bilim Vakfı (DMR-0.706.517 ve DMR-1.006.332) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01-GM088403) hibe kısmen finanse edilmektedir. Malzeme Araştırma Bilim ve Mühendislik Merkezleri (MRSEC) programı (DMR 0.520.404) - nanopore delme, Ulusal Bilim Vakfı desteği ile Cornell Malzeme Araştırma Merkezi (CCMR) Elektron Mikroskopi Tesisleri'nde yapıldı. Silisyum nitrür membranların hazırlanması, Ulusal Bilim Vakfı (Hibe ECS-0.335.765) tarafından desteklenen Cornell Nanoseviye Tesisi, Ulusal Nanoteknoloji Altyapı Ağı üyesi yapıldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
| 20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI Supplies | 4163SN-BA | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
| silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
| SPC Technology, D sub contact, pin | Newark Inc | 9K4978 | For electrodes |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
| hot plate | Fisher Scientific | ||
| Faraday cage |
References
- Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
- Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
- Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).
- Branton, D. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).
- Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).
- Peng, H., Ling, X. S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).
- Zhao, Q. Detecting SNPs using a synthetic nanopore. Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).
- Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).
- Sexton, L. T. Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor. J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).
- Martin, C. R., Siwy, Z. S. Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores. Science. 317, 331-332 (2007).
- Sexton, L. T. An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing. J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).
- Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface. J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).
- Han, A. Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores. Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).
- Han, A. Sensing protein molecules using nanofabricated pores. Appl. Phys. Lett. 88, (2006).
- Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore. Appl. Phys. Lett. 91, (2007).
- Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis. Nano. Lett. , (2010).
- Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. Data analysis of translocation events in nanopore experiments. Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).
- Oukhaled, A. Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force. ACS. Nano.. , (2011).
- Yusko, E. C. Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls. Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).
- Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).
- Wanunu, M., Meller, A. Chemically modified solid-state nanopores. Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).
- Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore. Biophys. J. 85, 897-910 (2003).
- Aksimentiev, A. Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore. Nanoscale. 2, 468-483 (2010).
- Timp, W. Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life. IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).
- Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry. J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).
- Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes. J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).
- Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).
- Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy. Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).
- Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events. J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).
- Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin. Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).
- Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips. Scanning. 21, 394-397 (1999).
- Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures. Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).
- Giannoulis, C. S., Desai, T. A. Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films. J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).
- Gustavsson, J. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications. J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).
- Shirshov, Y. M. Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface. Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).
- Chen, P. Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores. Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).
- Siwy, Z. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).
- Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore. Anal. Chem. , (2009).
- Kim, M. -J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).
- Bezrukov, S. M. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).
