Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Overvågning Protein Adsorption med Solid-state Nanopores

Published: December 2, 2011 doi: 10.3791/3560
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physics, Syracuse University

Summary

En metode til ved hjælp af solid-state nanopores til at overvåge ikke-specifikke adsorption af proteiner ud på en uorganisk overflade er beskrevet. Metoden anvender resistive-puls princip, der giver mulighed for adsorption til probed i real-time og på enkelt-molekyle niveau. Fordi processen med enkelt protein adsorption er langt fra ligevægt, foreslår vi ansættelse af parallelle arrays af syntetiske nanopores, der gør det muligt for kvantitativ bestemmelse af den tilsyneladende første-ordens reaktion hastighedskonstanten af ​​protein adsorption samt og Langmuir adsorption konstant.

Abstract

Solid-state nanopores er blevet brugt til at udføre målinger på enkelt-molekyle niveau for at undersøge den lokale struktur og fleksibilitet af nukleinsyrer 1-6, udfoldelsen af proteiner 7, og bindende affinitet for forskellige ligander 8. Ved at koble disse nanopores til resistive-puls teknik 9-12, kan sådanne målinger ske under en lang række betingelser og uden behov for mærkning 3. I den resistive-puls teknik, er en ionisk salt-opløsning, der indføres på begge sider af nanopore. Derfor er ioner drevet fra den ene side af salen til den anden ved en påført transmembrane potentiale, hvilket resulterer i en lind strøm. Opdelingen af ​​en analyt i nanopore forårsager en veldefineret afbøjning i denne strøm, som kan analyseres for at udtrække en enkelt-molekyle oplysninger. Ved hjælp af denne teknik, kan adsorption af enkelte proteiner til nanopore væggene blive overvåget i henhold til en bred vifte afbetingelser 13. Protein adsorption vokser i betydning, for som mikrofluidenheder skrumpe i størrelse, samspillet mellem disse systemer med enkelte proteiner bliver et problem. Denne protokol beskriver en hurtig analyse for protein binding til nitrid film, som let kan udvides til andre tynde film gøres til genstand for nanopore boring, eller at funktionaliserede nitrid overflader. En række af proteiner kan undersøges under en bred vifte af løsninger og denaturering betingelser. Derudover kan denne protokol bruges til at udforske mere grundlæggende problemer med at bruge nanopore spektroskopi.

Protocol

1. Fremstilling af solid-state nanopores i siliciumnitrid membraner

  1. Bring FEI Tecnai F20 S / TEM til en acceleration spænding på 200 kV. Hvis du bruger et andet S / TEM, bør acceleration spændingen være større end eller lig med 200 kV 9
  2. Load en 20 nm tyk SPI siliciumnitrid vindue gitter i TEM prøveholderen og rengør med Oxygen plasma i 30 sekunder for at fjerne forurenende stoffer fra indehaveren.
  3. Læg prøven i S / TEM og give mulighed for vakuum at pumpe ned. Når S / TEM har pumpet ned til vakuum, find nitrid vinduet i lyse-field TEM-tilstand ved at lede efter en lysende firkant på Ronchigram. Sørg for TEM er justeret korrekt, så afpasse og målrette prøven.
  4. Skift S / TEM ind STEM mode. Brug HAADF (eller tilsvarende) detektor til billede prøven, og sørg for at det er korrekt justeret.
  5. Sæt Monochromator til en lav værdi. En lavere værdi af Monochromator giver mulighed for en højere current af elektroner til rådighed for boring. Hvis S / TEM ikke har en Monochromator, skal du ignorere dette trin.
  6. Vælg et passende sted størrelse for at bore nanopore. Dette svarer til diameteren af ​​elektron sonden. En 3 nm sonde virker godt til boring 5 nm diameter porer. En større sonde (5 nm) vil bore hurtigere og skabe en større pore. En mindre probe (1 nm) vil tage længere tid at bore og skabe en mindre pore.
  7. Juster STEM justeringer, hvis det er nødvendigt.
  8. Fokus på nitrid membranen og bringe det til en forstørrelse på x1.3M. Finindstilling af fokus bør ske ved at overvåge Ronchigram.
  9. Hvis der er nogen bevægelse af prøven, og derefter vente på, at prøve at stabilisere sig. Dette kan tage op til en time. Blank elektronstrålen, mens man venter for ikke at beskadige nitrid.
  10. Placer elektron probe på selve prøven og begynde at bore.
  11. Kontrollér med jævne prøven ved scanning med HAADF detektoren, både for at sikre, nanopore bliver DRIlled (det vil se ud som en mørk plet), og at kontrollere, at der ikke er bevægelse af prøven. Hvis prøven glider let, justere placeringen af ​​elektronens sonden til at være over nanopore.
  12. Se Ronchigram at identificere, når pore har dannet. Når du er i fokus, nitrid filmen har en flimrende udseende. Dette vil forsvinde, når nanopore former. Sætte Ronchigram lidt ude af fokus gør det muligt at se en Fresnel frynser forbundet med nanopore.
  13. Tag et billede af nanopore med HAADF.
  14. Gør en intensitet profil af nanopore billedet. Diameteren på nanopore kan estimeres ved mørkeste region i profilen.
  15. Udvidelsen af ​​nanopore kan udføres ved at flytte elektronen sonden langs kanterne af pore.
  16. Når nanopore er af den ønskede diameter, sætter S / TEM i TEM-mode.
  17. Bring Monochromator til sin standard indstilling, og billedet af nanopore med lyse-feltet TEM at bekræfte størrelsen

2. Befugtning af solid-state nanopore

  1. De-gas afioniseret vand tilsat 1 M KCl, 10 mM kalium fosfat, pH 7,4. Dette kan gøres ved at sætte de løsninger under vakuum og placere dem i et badekar sonicator i 20 minutter.
  2. Placer nanopore indeholder siliciumnitrid chip i et 10 ml Pyrex bægerglas. Pas på ikke at bryde nitrid vinduet, da det er meget delikat. Anbring bægerglasset på en varmeplade i et stinkskab og indstillet til 100 ° C.
  3. Rengør nanopore chip med Piranha løsning med stor omhu. Først tilsættes 3 ml svovlsyre til containeren ved hjælp af en glas pipette. Derefter tilsættes forsigtigt 1 ml hydrogenperoxid til svovlsyre for at gøre Piranha løsning 14. Venligst tage alle forholdsregler.
  4. Lad nanopore chip til at suge i Piranha opløsningen i 10 minutter.
  5. Fjern Piranha løsning fra bægerglasset med en glas pipette. Læg det til en korrekt opbevaring beholder.
  6. Fill bægeret med degasses afioniseret vand ved hjælp af et rent glas pipette. Tøm bæger vand og gentag mindst 5 gange.
  7. Fjern nanopore chip med rent pincet og tørre det af lys suge
  8. Straks, forsegle nanopore chip ind i kammeret (Fig. 2a, 2b). Chippen kan fastgøres i kammeret af O-ringe eller silikone fugemasse.
  9. Fyld kammeret med KCl løsning
  10. Forbind Ag / AgCl elektroder til kammer (Fig. 2b). Elektroder kan ske ved iblødsætning sølv wire i blegemiddel natten over.
  11. Påfør et transmembrane potentiale på tværs af elektroder og overvåge den aktuelle reaktion ved hjælp af en Axon 200B patch-clamp forstærker i spænding-clamp-tilstand.
  12. Konstruer et I / V (strøm-spænding) kurve fra de målinger. I / V-kurve skal være meget lineær, når du bruger 1 M KCl (Fig. 3). Konduktans af nanopore skal svare til dens diameter. Hvis nanopore ikke viser etlineær I / V kurve, ledeevne er for lav, eller åbne strøm nanopore ikke er stabil (fig. 4a), betyder det, at nanopore ikke er ordentligt fugtet og Piranha-vask bør gentages.

3. Overvågning af protein adsorption

  1. Det er kritisk vigtigt at udføre kontrol eksperimenter med et enkelt-nanopore membran eller parallel række nanopores (se nedenfor) til at overvåge den aktuelle med buffer betingelser mangler proteinet prøven. Vi anbefaler følgende to trin: (i) brug af en høj renhed niveau buffer (renhed> 99,9%; kromatografi-klassetrin), og (ii) anvendelse af en buffer, hvis samspil med solid-state nanopore ikke producerer en enkelt-kanal arrangementer. Derudover anbefaler vi at opnå en høj renhed protein prøve ved hjælp af standard proteinkemi procedurer. Renheden af ​​proteinet prøven bør kontrolleres af natrium dodecyl sulfat-polyacrylamid (SDS-PAGE) gel analyse og høj opløsning mass spektrometri 15.
  2. Tilføj en renset udsnit af de proteiner, der skal undersøges i det grundstødte badet af kammeret. Give tid til prøven diffuse hele badet. Typiske koncentrationer af proteiner, der kan måles er i snesevis af nM til μM vifte 7,15-21.
  3. Påfør et transmembrane potentiale spænding skævhed med polaritet modsatte af den samlede afgift af proteinet blive undersøgt. For eksempel har BSA en effektiv netto negativ ladning ved pH 7,4, og dermed en positiv spænding skævhed bør anvendes. Den anvendte spænding skaber spændingsgradient i nanopore interiør og proteiner af modsat afgifter vil blive drevet af modsatrettede kræfter. Kun spænding polariteter, der driver de proteiner ind i nanopore vil skabe målbare signaler.
  4. En anvendt potentiale i størrelsesordenen 200 mV skal være stort nok til at observere de fleste protein analytter. Begivenheder vises som forbigående aktuelle omlægninger fra baseline (fig. 4b).Hvis der ikke signal observeres, øge koncentrationen af ​​proteinet i kammeret. Højere spænding forbedre signal-støj-forhold. Nitrid nanopores kan tåle flere volt.
  5. Protein adsorptions vil fremstå som lang levetid ændringer i baseline strøm nanopore (Fig. 4c).

4. Mulighederne for funktionalisering af nanopores

Der findes flere metoder til at anvende funktionelle grupper for at siliciumnitrid 22,23. De fleste nitrid film har et tyndt oxidlag på ydersiden og eksponering for ozon kan oprette en ekstra oxidlag, hvis det er nødvendigt. Forskellige organosilanes kan bruges og selv-samlet på en sådan lag. Af særlig interesse er aminosilane, som selv samler og kan blive ændret yderligere (dvs. carboxylsyre og aldehyder), giver mulighed for inspektion af en række økologiske overflader. Efter en nanopore er blevet vasket med Piranha og sikret i chamber, kan amin kan tilføjes direkte til kammeret bad med en understøttende elektrolyt på 0,5 M TBACl (tetrabutylammonium) og vandfri MeOH (methanol), der anvendes som opløsningsmiddel. Éncellelag dannelse kan overvåges ved anvendelse af en 400 mV spænding bias og måling af den aktuelle dråbe 23.

5. Bestemmelse af den tilsyneladende første-ordens reaktion, hastighedskonstant og Langmuir adsorption konstant ved hjælp af parallelle nanopore arrays

5,1 Den tilsyneladende første-ordens reaktion hastighedskonstanter for absorption og desorption

Vi understreger, at det positive aspekt af denne metode er dens evne til at observere individuelle adsorptions på enkelt-molekyle niveau. Den fælles-molekyle målinger af protein adsorption på en uorganisk overflade, kan skaleres op ved at ansætte parallelle arrays af solid-state nanopores. Den parallelle vifte af nanopores er nødvendigt på grund af behovet for at analysen mange porer for at få pålidelige statistiskeS. Til dette formål, ville anvendelsen af ​​en nanopore vifte tillader overvågning af enkelte adsorptions samt måling af flere arrangementer for yderligere analyse. En vifte af nanopores i silicium nitrid kan stiftes ved ovennævnte protokol blot ved at bore flere huller i prøven. Hver nanopore bør være af samme størrelse. Arrays af nanopores af 6x6-eller 7x7 bør være rimelig. Ved tilsætning af protein analyt i kammeret, vil de nuværende henfald i en eksponentiel måde med en følgende udtryk:

Jeg t = Jeg ∞ - (jeg ∞ - Jeg 0) exp (-k 't)

Her, jeg t, betegner den nuværende på forsøgsstadiet tidspunkt t. I 0 er den oprindelige strøm passerer gennem nanopore array. Jeg ∞ viser den strøm ved mætning niveau (dvs. uendeligt). K 'er den tilsyneladende første-ordens reaktion sats konstant, hvilket kan bestemmes ud fra the fit af den eksperimentelle kurve. En større k 'kan tolkes som en hurtigere adsorption sats. Forholdet Jeg ∞ / I 0, også kaldet det normaliserede mætning nuværende, er en dimensionsløs tal mellem 0 og 1. Denne parameter er et mål for belægning af adsorberet protein analytter. Derfor bør hvert enkelt forsøgsbetingelse være forbundet med to specifikke output-parametre jeg ∞ / I 0 og k «.

Det skal bemærkes, at den tilsyneladende første-ordens adsorption hastighedskonstanter og normaliseret strømme er påvirket af den effektive tid af proteiner i nanopores. Denne gang er afhængig af koncentrationen af protein analytter i bulk vandfasen 24. Derfor er yderligere korrektion af disse numre skal være gennemført baseret på den effektive tid af proteiner i nanopore interiør. Vi foreslår at måle omfanget af fast (translokation) arrangementer og multiplicere med den gennemsnitlige opholdstid af sådanne begivenheder. Dette vil give den gennemsnitlige tid af proteiner anvendes inden for nanopore interiør per tidsenhed.

Hastighedskonstanten af ​​desorption kan bestemmes ved hjælp af en parallel række nanopores så godt. Så snart det aktuelle niveau når mætning (I ∞), bør spændingen vendes, så ikke flere proteiner er fanget ind i nanopores. Desorption af de enkelte proteiner vil blive ledsaget af ændringen af ​​den optagne nuværende retning af større værdier. Satsen konstant vil så blive hentet fra stigningen i det aktuelle niveau.

5.2 Den Langmuir adsorption konstante

Absorptionen af ​​protein analytter på uorganiske overflader nanopores er afhængig af protein koncentration i vandfasen. Dette fænomen er allerede blevet observeret på enkelt-molekyle niveau 13. Hvis θ repræsenterer s den normaliserede mætning strøm (I ∞ / I 0), derefter en typisk Langmuir isoterm ligning er givet ved følgende udtryk:

Figur 5.2

hvor C er det protein koncentration i den vandige fase. α er Langmuir adsorption konstant. Denne konstant stiger med en stigning i bindingen energien af ​​adsorption og med et fald i temperaturen. Indsamlingen af de θ datapunkter vil beskæftige målinger med parallelle arrays udføres på forskellige protein koncentrationer i vandfasen. Data bør analyseres i kombination med andre teknikker til at kontrollere omfanget af de monterede Langmuir adsorption konstant. Desuden kan fuld-atomistisk molekylære simuleringer 25,26 kan også bruges til at hjælpe fortolkninger af de opnåede eksperimentelle data.

title "> 6. repræsentative resultater

Typiske resultater for solid-state nanopores bliver som følger. De åbne porer nuværende bør være meget stabile, som det ses i Fig. 4a. I / V karakteristika nanopore skal være meget lineær i 1 M KCl, 10 kalium fosfat, pH 7,4, som det ses i Fig. 2. Hældningen på et lineært fit til I / V-kurven vil give enhedskarakter konduktans af nanopore. Ledeevne har et direkte forhold til den nanopore diameter og skal svare til ligningen: Figur ligning , Hvor G er den konduktans af nanopore, d er dens diameter, l er dens længde, og σ er ledningsevnen af løsningen i kammeret 14. Denne værdi skal matche inden for 30%. Hvis den er for lille, er din pore sandsynligt ikke fugtet. Med tilføjelsen af protein, bør hurtige begivenheder følge deraf, som det ses i Fig. 4b. Protein adsorption er et langlivet aktuelle fald som vist i Fig. 4c. Nogle proteiner er meget labile og gennemgår strukturelle transformation inden for pore interiør. I dette tilfælde vil de langlivede spændingsfald være ledsaget af hurtige udsving.

Figur 1
Figur 1. Solid-state nanopore fremstillet ved hjælp af en Tecnai F20 S / TEM. Pore ​​blev boret i STEM tilstand til en diameter på 20 nm. Billedet blev taget i lyse-field TEM-tilstand. Nitrid var 30 nm tykt.

Figur 2
Figur 2. Salen anvendes til boliger en enkelt solid state nanopore i resistive-puls målinger. A), Afdeling og en silicium chip med fritstående nitrid vindue (TEM gitter). Den nanopore er boret ind i nitrid før ilægning. Rød O-ringe bruges til at danne en god sEAL om den chip, der adskiller to bade af ioniske løsning. B) Skematisk af kammeret, der viser placeringen af ​​løsningen bade og elektroder med hensyn til nanopore.

Figur 3
Figur 3. Typisk I / V-spor for solid-state nanopores af forskellige diametre. Enkelt-kanal el-spor blev taget i 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8,5. Nanopores blev boret i 30 nm tyk siliciumnitrid. Bemærk nitrid tykkelse vil påvirke enhedskarakter konduktans af nanopore.

Figur 4
Figur 4. Målt single-channel nuværende spor og påvisning af protein adsorption. A) En enkelt-kanal elektriske trace viser den åbne nuværende af en 10 nm diameter nanopore. B) Nuværende omlægninger repræsenterer opdeling af bovin serum albumin (BSA) i den interIOR af nanopore. C) Adsorption af BSA på nitrid overflade. Alle spor er fra samme nanopore i 1 M KCl, 10 mM kalium fosfat, pH 7,4. Den anvendte transmembrane potentiale blev 40 mV og BSA blev tilføjet til det grundstødte kammeret badet i en koncentration på 120 Nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spontan adsorption af proteiner på solid-state overflader 27-29 er fundamentalt vigtige i en række områder, såsom biochip applikationer og design af en ny klasse af funktionelle hybrid biomaterialer. Tidligere undersøgelser har vist, at proteiner adsorberes til solid state-overflader ikke viser lateral mobilitet eller væsentlige desorption satser, og derfor er protein adsorption er generelt betragtes som en irreversibel og uspecifik proces 30-32. Protein adsorption på solid state overflader menes at skyldes flere faktorer, herunder elektrostatiske og hydrofobe kræfter blandt de sidekæder af proteiner og de ​​reaktive grupper på faststof-væske berøringsfladen 13.

Processen med protein adsorption er blevet udforsket af flere tilgange, såsom kvarts krystal mikrovægt 28,29, elektronmikroskopi, 33,34 ellipsometry, 35 fluorescerende mærkning, 36 og Planar polarisering interferometri (PPI). 37 I modsætning hertil denne single-nanopore og nanopore vifte metode er afhængig af påviselige single-channel aktuelle ændringer produceret af samspillet mellem enkelt-protein analytter og nanopore interiør.

De mest kritiske skridt til at opnå positive resultater er den korrekte befugtning af nanopore interiør. Skulle pore egenskaber ikke opfylder de specifikationer, der drøftes i resultaterne sektionen, kan flere fejlfinding metoder benyttes. Forbigående nuværende blokader, der opstår uden nogen proteiner i opløsning kan indikere, at kammeret er forurenet. Teflon kamre kan vaskes med Piranha. PDMS kamre bør gøres frisk fra ren forme til hvert forsøg. Nanopores med mindre end forventet ledningsevne eller ikke-lineær I / V karakteristika kan indikere, at befugtning er mislykket. En kort ansøgning med høj spænding (~ 5 V) kan forbedre de elektriske egenskaber nanopore.Ellers skal nanopore vaskes igen med Piranha løsning. Selv i de bedste tilfælde, undlader nogle nanopores til våd ordentligt. Evnen til at våde en nanopore afhænger af dens dimensioner. Begge tyndere nitrid nanopores og større diameter nanopores er lettere at våde end tykkere nitrid nanopores eller mindre diameter nanopores. For 20 nm tyk nanopores med en radius af 5 nm succes rate er ca 70% efter første vask. Der bør udvises forsigtighed med at vælge en nanopore størrelse til din analyt, da nanopores skal være store nok til at rumme det protein.

Protokollen diskuteres her kun gælder for adsorption til en siliciumnitrid overflade. Andre overflader, som f.eks siliciumoxid 9 eller aluminiumoxid 23 kan ligeledes bores ved hjælp af denne teknik, men antallet af tynde film gøres til genstand for denne teknik er begrænset til dem, der kan fremstilles, så de er fritstående, tynde og fri for huller . For at overvinde dette problem, lmemical belægning af nanopore kan anvendes 23,38-40. En anden trade-off af det indre nanopore teknik er, at den kun kan se på et molekyle ad gangen. For at overvinde denne begrænsning, vi tilbudt et alternativ til at bruge parallelle arrays af solid-state nanopores 41. Nuværende målinger med nanopore arrays giver en mulighed for at få makroskopiske kinetiske parametre, såsom den tilsyneladende første-ordens reaktion hastighedskonstanter af absorption og desorption. Desuden ville denne tilgang kunne fastlæggelse af Langmuir-adsorption konstant. En umiddelbar begrænsning af denne teknik er dens manglende evne til at indsamle oplysninger om flade og brede flader. Målingerne vil kun sonden protein adsorption i lukkede rum i det indre af fabrikerede solid-state nanopores. I mange tilfælde er det ganske udfordrende at opnå præcise oplysninger om geometri og den indvendige overflade nanopore. I fortiden, var protein adsorption omfattende undersøged fra kvarts krystal mikrovægt 28,29. Det protein adsorption på krystaloverfladen er ledsaget af en afdæmpning af den pålagte oscillerende bevægelse af krystal mikrovægt, der producerer et fald i resonansfrekvens. En ændring af den samlede koblede masse på grund af protein adsorption inducerer en frekvens skift af kvarts krystal mikrovægt. Den samlede adsorberet protein masse er lineært relateret til frekvensen skift. Dette er det grundlæggende princip for denne teknik, der indirekte sonder protein adsorption på en veldefineret plan flade. I modsætning hertil benytter sig af nanopore arrays de resistive-puls teknik, der er tæt svarer til den Coulter counter tilgang 42. Igen, kan nanopore teknikken blive skaleret ned til et begrænset antal nanopores i en membran, så de enkelte adsorptions kan ses i realtid. I modsætning til kvarts krystal mikrovægt, kan nanopore målinger ikke vurdere adsorption processen i stor skala ogflade, hvor yderligere begivenheder kan forekomme (dvs. lateral spredning af adsorberet protein), hvilket frembringer forandringer i Langmuir adsorptionsisotermerne. Selvfølgelig er det ønskeligt, at disse tilgange afsat til protein adsorption bør anvendes i kombination med hinanden, da de sonden kun nogle aspekter af adsorption processen. For eksempel, ansat Brewer og kolleger en kombination af kvarts krystal mikrovægt og ζ-potentiale teknikker til at vise, at BSA bindende ned guld nanopartikler og guld overflader sker via en elektrostatisk mekanisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke John Grazul (Cornell University), André Marziali (University of British Columbia i Vancouver) og Vincent Tabard-Cossa (The University of Ottawa) for deres rådgivning. Dette arbejde er finansieret delvist af tilskud fra den amerikanske National Science Foundation (DMR-0706517 og DMR-1006332) og National Institutes of Health (R01-GM088403). Den nanopore boring blev udført ved Electron Microscopy facilitet i Cornell Center for Materials Research (CCMR) med støtte fra National Science Foundation - Materialeforskning Science and Engineering Centers (MRSEC) program (DMR 0.520.404). Forberedelsen af ​​silicium nitrid membranerne blev udført på Cornell nanoskala Facility, et medlem af National Nanotechnology Infrastructure Network, som er støttet af National Science Foundation (Grant ECS-0335765).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tecnai F20 S/TEM FEI S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source.
20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM SPI Supplies 4163SN-BA
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices
Axon Digidata 1440A Molecular Devices
pCLAMP 10 software Molecular Devices Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software
Sulfuric Acid Fisher Scientific A300
hydrogen peroxide Fisher Scientific H325
silicone O-rings McMaster-Carr 003 S70 Alternatively use PDMS
silver wire Sigma-Aldrich 348759 For electrodes
SPC Technology, D sub contact, pin Newark Inc 9K4978 For electrodes
potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P2222
potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5379
PDMS Dow Corning Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber.
Kwik-Cast Sealant World Precision Instruments, Inc. KWIK-CAST Fast acting silicone sealant
hot plate Fisher Scientific
Faraday cage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
  2. Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
  3. Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).
  4. Branton, D. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).
  5. Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).
  6. Peng, H., Ling, X. S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).
  7. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).
  8. Zhao, Q. Detecting SNPs using a synthetic nanopore. Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).
  9. Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).
  10. Sexton, L. T. Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor. J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).
  11. Martin, C. R., Siwy, Z. S. Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores. Science. 317, 331-332 (2007).
  12. Sexton, L. T. An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing. J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).
  13. Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface. J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).
  14. Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).
  15. Han, A. Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores. Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).
  16. Han, A. Sensing protein molecules using nanofabricated pores. Appl. Phys. Lett. 88, (2006).
  17. Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore. Appl. Phys. Lett. 91, (2007).
  18. Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis. Nano. Lett. , (2010).
  19. Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. Data analysis of translocation events in nanopore experiments. Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).
  20. Oukhaled, A. Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force. ACS. Nano.. , (2011).
  21. Yusko, E. C. Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls. Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).
  22. Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).
  23. Wanunu, M., Meller, A. Chemically modified solid-state nanopores. Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).
  24. Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore. Biophys. J. 85, 897-910 (2003).
  25. Aksimentiev, A. Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore. Nanoscale. 2, 468-483 (2010).
  26. Timp, W. Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life. IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).
  27. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry. J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).
  28. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes. J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).
  29. Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).
  30. Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy. Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).
  31. Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events. J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).
  32. Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin. Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).
  33. Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips. Scanning. 21, 394-397 (1999).
  34. Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures. Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).
  35. Giannoulis, C. S., Desai, T. A. Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films. J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).
  36. Gustavsson, J. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications. J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).
  37. Shirshov, Y. M. Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface. Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).
  38. Chen, P. Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores. Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).
  39. Siwy, Z. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).
  40. Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore. Anal. Chem. , (2009).
  41. Kim, M. -J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).
  42. Bezrukov, S. M. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).

Tags

Bioteknik Solid-state nanopore S / TEM enkelt-molekyle biofysik protein adsorption resistiv-puls teknik nanopore spektroskopi
Overvågning Protein Adsorption med Solid-state Nanopores
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L.… More

Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560, doi:10.3791/3560 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter