Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

חלבון ניטור ספיחה עם מצב מוצק nanopores

doi: 10.3791/3560 Published: December 2, 2011

Summary

השיטה של ​​שימוש מצב מוצק nanopores לפקח על הלא ספציפית ספיחה של חלבונים על פני השטח אורגניים מתואר. השיטה משתמשת בעיקרון דופק-התנגדות, ומאפשר ספיחה להיות נחקר בזמן אמת והן ברמת מולקולה בודדת. בגלל תהליך ספיחה של חלבון יחיד רחוק שיווי משקל, אנו מציעים את העסקתם של מערכים מקבילים של nanopores סינתטי, מה שמאפשר לקביעת כמותית של קצב מסדר ראשון נראית לעין תגובה קבועה של חלבון ספיחה, כמו גם את לאנגמיור ספיחה מתמדת.

Abstract

מצב מוצק nanopores שימשו כדי לבצע מדידות ברמת יחיד המולקולה לבחון את מבנה הגמישות המקומית של חומצות גרעין 1-6, את התגלגלות של חלבונים 7, זיקה מחייבת של ligands שונים 8. על ידי צימוד אלה nanopores לטכניקה הדופק התנגדות, 12/09, מדידות כאלה ניתן לעשות זאת תחת מגוון רחב של מצבים רחב ללא צורך תיוג 3. בטכניקה התנגדות, דופק, פתרון מלח יוניים הוא הציג על שני הצדדים של nanopore. לכן, יונים מונעים מצד אחד של החדר לצד השני על ידי פוטנציאל הטרנסממברני מיושם, וכתוצאה מכך זרם יציב. חלוקת אנליטי לתוך nanopore גורמת סטיה מוגדרת היטב בזרם זה, אשר ניתן לנתח כדי לחלץ מידע יחיד מולקולה. באמצעות טכניקה זו, ספיחה של חלבונים יחיד על הקירות nanopore יכול להיות פיקוח תחת מגוון רחב שלהתנאים 13. חלבון ספיחה גוברת בחשיבותו, כי כמו מכשירים microfluidic לכווץ בגודל, את האינטראקציה של מערכות אלה עם חלבונים יחיד הופך לדאגה. פרוטוקול זה מתאר assay מהיר של חלבון מחייב סרטים ניטריד, אשר יכול בקלות להיות מורחבת סרטים דקים אחרים מקובל קידוח nanopore, או משטחים ניטריד פונקציונליות. מגוון של חלבונים עלול להיחקר תחת מגוון רחב של פתרונות ותנאי denaturing. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור יותר בעיות בסיסיות באמצעות ספקטרוסקופיית nanopore.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. תוצר של מצב מוצק nanopores ממברנות סיליקון ניטריד

  1. תביא / פיי Tecnai S F20 TEM למתח האצה של kV 200. אם אתה משתמש שונה S / TEM, מתח ההאצה צריך להיות גדול או שווה ל 200 kV 9
  2. טען 20 ננומטר חלון עבה SPI סיליקון ניטריד רשת לתוך מחזיק מדגם TEM ונקי עם פלזמה חמצן למשך 30 שניות כדי להסיר מזהמים מבעל.
  3. טען המדגם אל S / TEM ולאפשר ואקום כדי לשאוב למטה. לאחר S / TEM יש נשאבים אל הריק, למצוא את חלון ניטריד במצב בהיר שדה TEM ידי מחפש ריבוע בהיר על Ronchigram. ודא TEM מיושר כמו שצריך, אז ליישר ולמקד את המדגם.
  4. כבה את S / TEM למצב גזע. השתמש גלאי (או שווה ערך) HAADF לתמונה מדגם וודא שהוא מיושר כראוי.
  5. הגדר את monochromator לערך נמוך. ערך נמוך של monochromator מאפשר curren גבוה יותרt של אלקטרונים עבור קידוח. אם S / TEM אין monochromator, התעלם משלב זה.
  6. בחר גודל נקודה מתאימה לקידוח nanopore. זה מתאים בקוטר של החללית אלקטרונים. בדיקה 3 ננומטר עובד היטב עבור קידוח בקוטר 5 הנקבוביות ננומטר. בדיקה גדול (5 ננומטר) יהיה לקדוח מהר יותר וליצור נקבוביות גדולות יותר. בדיקה קטן (1 ננומטר) ייקח זמן רב יותר כדי לתחקר וליצור נקבוביות קטנות יותר.
  7. התאם את יישור גזע, במידת הצורך.
  8. פוקוס הממברנה ניטריד ולהביא אותו בהגדלה של x1.3M. התמקדות פיין צריך להיעשות על ידי ניטור Ronchigram.
  9. אם יש תנועה של המדגם, ואז לחכות למדגם לייצב. זה יכול להימשך עד שעה. בלנק אלומת אלקטרונים בזמן ההמתנה, כדי לא לגרום נזק ניטריד.
  10. מניחים את החללית אלקטרונים על המדגם ולהתחיל לקדוח.
  11. מפעם לפעם לבדוק את המדגם על ידי סריקה עם הגלאי HAADF, הן כדי לוודא nanopore היא להיות DRIlled (זה ייראה כמו כתם כהה) ולבדוק כי אין תנועה של המדגם. אם המדגם נסחפת קצת, להתאים את המיקום של החללית האלקטרון להיות מעל nanopore.
  12. צפה Ronchigram לזהות כאשר הנקבובית יצרה. כאשר במוקד, הסרט ניטריד יש מראה מנצנץ. זה יעלם כאשר צורות nanopore. לשים את Ronchigram קצת מחוץ לפוקוס מאפשר לראות שוליים פרנל הקשורים nanopore.
  13. קח תמונה של nanopore עם HAADF.
  14. האם פרופיל העוצמה של התמונה nanopore. בקוטר של nanopore ניתן לחשב לפי אזור האפלים ביותר של הפרופיל.
  15. ההרחבה של nanopore עשוי להתבצע על ידי העברת אלקטרון בדיקה בשולי הנקבובית.
  16. לאחר nanopore הוא בקוטר הרצוי, את S / TEM למצב TEM.
  17. תביאו את monochromator להגדרה הסטנדרטי שלה והתמונה nanopore באמצעות בהיר שדה TEM לאשר את גודל

2. הרטבת nanopore של מצב מוצק

  1. De-de-גז מיונן מים המכילים 1 M KCl, 10 mM אשלגן זרחתי, pH 7.4. ניתן לעשות זאת על ידי הצבת הפתרונות תחת ואקום הכנסתם sonicator אמבטיה במשך 20 דקות.
  2. מניחים את ניטריד nanopore המכיל שבב סיליקון לתוך כוס פיירקס 10 מ"ל. היזהר שלא לשבור את החלון ניטריד כפי שהוא עדין מאוד. הנח את הכוס על פלטה חמה במנדף קטר ולהגדיר עד 100 ° C.
  3. נקו את שבב nanopore עם פתרון פיראניה שימוש בזהירות רבה. ראשית להוסיף 3 מ"ל חומצה גופרתית למיכל באמצעות פיפטה מזכוכית. לאחר מכן, בזהירות להוסיף 1 מ"ל מי חמצן לחומצה גופרתית כדי להפוך פתרון פיראניה 14. בבקשה לנקוט בכל אמצעי הזהירות.
  4. אפשר שבב nanopore לטבול בתמיסה פיראניה במשך 10 דקות.
  5. הסר את הפתרון פיראניה מן הקנקן באמצעות פיפטה מזכוכית. המקום אותו לתוך כלי קיבול האחסון הנכון.
  6. Fiכוס עם מים בגז דה דה מיונן, בעזרת פיפטה זכוכית נקי יהיה. כוס ריקה של מים חוזרים לפחות 5 פעמים.
  7. הסר את שבב nanopore עם פינצטה נקי ויבש זה על ידי יניקה אור
  8. מיד, חותם את השבב nanopore לתוך תא (איור 2a, 2b). השבב עשוי להיות מאובטח בתא על ידי O-טבעות או סיליקון איטום.
  9. ממלאים את החדר עם פתרון KCl
  10. חבר את Ag / AgCl אלקטרודות לתאי (איור 2b). אלקטרודות עשוי להתבצע על ידי השריית חוט כסף להלבין בן לילה.
  11. החלת פוטנציאל הטרנסממברני פני האלקטרודות ולנטר את התגובה הנוכחית באמצעות 200B אקסון תיקון-clamp מגבר במצב מתח מהדק.
  12. לבנות עקומת I / V (מתח הנוכחי) מן המדידות. עקומת I / V צריך להיות ליניארי מאוד בעת שימוש KCl 1 M (איור 3). המוליכות של nanopore צריך להתאים לקוטר שלו. אם nanopore לא להציגליניארי אני / V עקומה, מוליכות נמוכה מדי, או הנוכחי הפתוח של nanopore אינו יציב (איור 4 א), פירוש הדבר כי nanopore לא הרטובות כראוי כביסה פיראניה יש לחזור.

3. חלבון ניטור ספיחה

  1. חשוב ביותר לבצע ניסויים מלאה עם קרום חד nanopore או מערך מקביל של nanopores (ראה להלן) כדי לנטר את זרם עם התנאים חיץ חסר המדגם חלבון. אנו ממליצים על שני השלבים הבאים: (i) השימוש חיץ טוהר ברמה גבוהה (טוהר> 99.9%; כרומטוגרפיה כיתה ברמה), (ii) את השימוש חיץ אשר האינטראקציה עם מצב מוצק nanopore לא לייצר יחידה ערוץ אירועים. בנוסף, אנו ממליצים על קבלת מדגם הטוהר גבוהה חלבון באמצעות תקן כימיה נהלים חלבון. טוהר המדגם חלבון צריך להיבדק על ידי ניתוח dodecyl נתרן סולפט-polyacrylamide ג'ל (SDS-PAGE) ברזולוציה גבוהה מאss ספקטרומטריית 15.
  2. הוסף מדגם מטוהרים של החלבון כדי להיחקר לאמבטיה מקורקע של החדר. לאפשר זמן המדגם כדי לפזר ברחבי באמבטיה. ריכוזים אופייניים של חלבון זה ניתנת למדידה הן של עשרות nM למגוון מיקרומטר 7,15-21.
  3. החלת מתח פוטנציאל הטרנסממברני הטיה עם קוטביות הפוכה לזו של תשלום הכולל של החלבון הנחקר. לדוגמה, ארגון ה-BSA יש מטען שלילי נטו יעיל ב-pH 7.4, ולכן הטיה מתח חיובי צריך להיות מיושם. המתח להחיל יוצרת שיפוע הפוטנציאל בתוך הפנים וחלבונים nanopore של חיובים מול יהיה מונע על ידי כוחות מנוגדים. רק הקטבים מתח המניעים את החלבונים לתוך nanopore תיצור אותות מדידים.
  4. הפוטנציאל היישומי של גודל של mV 200 צריך להיות גדול מספיק כדי להתבונן analytes חלבון ביותר. אירועים יופיעו deflections הנוכחית חולף מנקודת ההתחלה (איור 4 ב).אם אין אות הוא ציין, להגדיל את הריכוז של חלבון בתא. מתח גבוה לשפר את יחס אות לרעש. Nanopores Nitride יכול לעמוד כמה וולט.
  5. Adsorptions חלבון יופיעו חיים ארוכים שינויים הבסיס הנוכחי של nanopore (איור 4c).

4. אפשרויות functionalization של nanopores

קיימות מספר שיטות ליישום קבוצות פונקציונליות על סיליקון ניטריד 22,23. סרטים ניטריד רוב שכבת תחמוצת דקה בחוץ וחשיפה האוזון יכול ליצור שכבת תחמוצת נוסף, במידת הצורך. Organosilanes שונים ניתן להשתמש עצמית המורכב על גבי שכבות כאלה. מעניינת במיוחד היא aminosilane, אשר עצמית מרכיב והוא יכול להיות שונה יותר (חומצה כלומר, carboxylic ו אלדהידים), המאפשר בדיקה של מגוון רחב של משטחים אורגני. לאחר nanopore נחפף עם דגי פיראנה טורפים ומאובטחת ב chamber, אמין ניתן להוסיף ישירות באמבטיה קאמרית עם אלקטרוליט תומכת של 0.5 M TBACl (tetrabutylammonium) ו anhydrous MeOH (מתנול) המשמש כממיס. היווצרות monolayer יכול להיות פיקוח על ידי יישום של הטיה mV 400 מתח המדידה של ירידה הנוכחי 23.

5. קביעת לכאורה מסדר ראשון שיעור התגובה מתמיד לאנגמיור ספיחה קבוע באמצעות מערכים מקבילים nanopore

5.1 לכאורה מסדר ראשון שיעור התגובה קבועים עבור קליטה desorption

אנו מדגישים כי הפן החיובי של מתודולוגיה זו היא היכולת שלה להתבונן adsorptions הפרט ברמה אחת המולקולה. מולקולה בודדת המדידות של חלבון ספיחה על גבי משטח אורגניים וניתן לשנותם על ידי העסקת מערכים מקבילים של מצב מוצק nanopores. מערך מקביל של nanopores הכרחי בשל הצורך הנקבוביות assay רבים כדי לקבל נתון אמיןs. לשם כך, השימוש במערך nanopore תאפשר ניטור של adsorptions הפרט, כמו גם מדידה של מספר אירועים לניתוח נוסף. מערך של nanopores ב סיליקון ניטריד יכול להיווצר על ידי פרוטוקול הנ"ל פשוט על ידי קידוח חורים מרובים במדגם. Nanopore כל צריך להיות בסדר גודל דומה. מערכים של nanopores של 6x6 או 7x7 צריך להיות הולם. עם תוספת של אנליטי החלבון בתא, הזרם יתפרק באופן מעריכי עם הבעה הבאים:

אני לא = אני - (אני - אני 0) exp (-k t ")

הנה, אני לא, מציין את הנוכחי לא זמן הניסוי. אני 0 הוא חולף הנוכחית המקורי באמצעות מערך nanopore. אני מציין הנוכחי ברמת רוויה (כלומר, אינסוף). "K הוא שיעור ניכר מסדר ראשון התגובה תמידי, אשר יכול להיקבע בין הדואר להתאים עקומת הניסוי. K גדול "יכול להתפרש בקצב מהיר יותר ספיחה. יחס אני / אני 0, הנקרא גם את הרוויה מנורמל הנוכחי, הוא מספר מימדים בין 0 ל -1. פרמטר זה הוא מדד התפוסה על ידי analytes חלבון adsorbed. לכן, כל תנאי הניסוי ברורים צריך להיות מזוהה עם שני פרמטרים פלט ספציפי אני / I 0 ו-k ".

יצוין, כי לכאורה מסדר ראשון קבועי קצב ספיחה וזרמים מנורמל מושפעים זמן יעיל בילה על ידי חלבונים בתוך nanopores. הפעם זה תלוי בריכוז של analytes חלבון בשלב מימית בתפזורת 24. לכן, תיקון נוסף של המספרים האלה צריך להיות מיושם על בסיס זמן יעיל בילה על ידי חלבונים בתוך הפנים nanopore. אנו מציעים למדוד את התדירות של FASt (טרנסלוקציה) אירועים הכפלת זה בממוצע להתעכב זמן של אירועים כאלה. זה ייתן את הזמן הממוצע של חלבונים בילה בתוך הפנים nanopore ליחידת זמן.

שיעור קבוע של desorption ניתן לקבוע באמצעות מערך מקביל של nanopores גם כן. ברגע שהרמה הנוכחית מגיעה לרוויה (אני ∞), המתח צריך להיות הפוך, אז לא יותר חלבונים לכודים בתוך nanopores. Desorption של חלבונים בודדים ילווה שינוי של הנוכחי רשמה לערכים יותר. קבוע קצב יחולצו אז מעליית ברמה הנוכחית.

5.2 לאנגמיור קבוע ספיחה

קליטת analytes חלבון על גבי משטחים אורגניים של nanopores תלויה בריכוז החלבון בשלב מימית. תופעה זו כבר נצפו ברמת מולקולה בודדת 13. אם θ מייצגים s הנוכחית הרוויה מנורמל (אני / I 0), אז משוואה לאנגמיור טיפוסי האיזותרמה ניתנת על ידי הביטוי הבא:

איור 5.2

כאשר C הוא ריכוז חלבון בשלב מימית. α הוא לאנגמיור ספיחה מתמדת. זה מגדיל מתמיד עם עלייה אנרגיה המחייב של ספיחה עם ירידה בטמפרטורה. אוסף של נקודות נתונים θ יעסיק מדידות עם מערכים מקבילים שבוצעו בריכוזים שונים חלבון בשלב מימית. נתונים יש לנתח בשילוב עם טכניקות אחרות כדי לאמת את גודל קבוע מצויד לאנגמיור ספיחה. בנוסף, מלא atomistic סימולציות דינמיקה מולקולרית 25,26 עשוי לשמש גם כדי לעזור פירושים של נתוני הניסוי שהתקבלו.

הכותרת "> 6. תוצאות נציג

תוצאות אופייניות של מצב מוצק nanopores יהיה כדלקמן. הנוכחי נקבוביות פתוחות צריך להיות מאוד יציבה, כפי שניתן לראות באיור. 4a. אני / V המאפיינים של nanopore צריך להיות ליניארי מאוד 1 M KCl, 10 פוספט אשלגן, pH 7.4, כפי שניתן לראות באיור. 2. שיפוע מתאים ליניארי עקומת I / V יספק המוליכות יחידתי של nanopore. המוליכות יש קשר ישיר לקוטר nanopore וצריך להתאים את המשוואה: איור המשוואה שם G היא מוליכות של nanopore, d הוא הקוטר שלה, אני הוא באורך שלה, σ היא המוליכות של התמיסה בתא 14. ערך זה צריך להתאים אל תוך 30%. אם זה קטן מדי, נקבוביות שלך סביר לא הרטובות. עם תוספת של חלבון, אירועים מהיר צריך להתחולל, כפי שניתן לראות באיור. 4b. Protעין ספיחה היא ירידה חיים ארוכים הנוכחית מוצגת באיור. 4c. חלבונים מסוימים מאוד יציב ולעבור השינוי המבני הפנימי בתוך הנקבוביות. במקרה זה, ירידה חיים ארוכים מתח ילווה תנודות מהירה.

איור 1
באיור 1. מצב מוצק nanopore מפוברק באמצעות F20 Tecnai S / TEM. הנקבוביות נקדחה במצב גזע בקוטר של 20 ננומטר. התמונה צולמה במצב בהיר שדה TEM. Nitride היה 30 ננומטר עבה.

איור 2
באיור 2. הקאמרית למגורים nanopore יחיד מצב מוצק ב-דופק התנגדות מידות. קאמרית) שבב סיליקון עם חלון שעמד חופשי ניטריד (רשת TEM). Nanopore הוא קדח לתוך ניטריד לפני הטעינה. רד O-טבעות משמשים כדי ליצור טובeal על השבב, המפריד בין שתי אמבטיות של פתרון יוניים. ב) סכמטי של החדר מראה מיקום של אמבטיות פתרון ואלקטרודות ביחס nanopore.

איור 3
באיור 3. טיפוסי אני / V עקבות של מצב מוצק nanopores של קטרים ​​שונים. עקבות ערוץ יחיד חשמל צולמו 1 M KCl, 20 מ"מ טריס, pH 8.5. Nanopores שנקדחו סיליקון ניטריד בעובי 30 ננומטר. ניטריד בעובי הערה תשפיע על המוליכות של יחידתי nanopore.

איור 4
איור 4. נמדד יחיד ערוץ עקבות הנוכחית זיהוי של חלבון ספיחה.) זכר יחיד ערוץ חשמל מראה הנוכחי פתוח של nanopore בקוטר 10 ננומטר. ב) deflections נוכחי מייצגים חלוקה של אלבומין בסרום שור (BSA) אל ביןIOR של nanopore. ג) ספיחה של ארגון ה-BSA על פני השטח ניטריד. כל עקבות של nanopore זהה 1 M KCl, 10 mM אשלגן זרחתי, pH 7.4. הפוטנציאל הטרנסממברני מיושם היה 40 mV ו - BSA נוספה באמבטיה קאמרית מעוגנת בריכוז של 120 ננומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ספיחה ספונטנית של חלבונים על מצב מוצק משטחים 27-29 חשוב ביסודו במספר תחומים, כגון יישומים biochip ועיצוב של מעמד חדש של biomaterials היברידית תפקודית. מחקרים קודמים הראו כי חלבונים adsorbed כדי מצב מוצק משטחים לא מראים הניידות לרוחב או שיעורי desorption משמעותי, ולכן חלבון ספיחה נחשבת בדרך כלל תהליך בלתי הפיך ולא ספציפי 30-32. חלבון ספיחה על משטחים מצב מוצק נחשב בשל מספר גורמים, כולל כוחות אלקטרוסטטיים ו הידרופובי בין הרשתות בצד של חלבונים ושל קבוצות תגובתי על ממשק מוצק לנוזל 13.

התהליך של חלבון ספיחה נחקר על ידי מספר גישות, כגון microbalance קריסטל קוורץ 28,29, מיקרוסקופית אלקטרונים, ellipsometry 33,34, 35 תיוג פלורסנט, 36 ו planainterferometry r קיטוב (PPI). 37 לעומת זאת, זה מתודולוגיה מערך יחיד nanopore ו nanopore מסתמך על ערוץ אחד השינויים לגילוי הנוכחי המיוצר על ידי יחסי הגומלין בין חלבון יחיד analytes ואת הפנים nanopore.

השלב הקריטי ביותר בהשגת תוצאות חיוביות הוא הרטבה נאותה הפנים nanopore. המאפיינים נקבוביות האם לא לפגוש את מפרט דנו בסעיף התוצאות, שיטות לפתרון בעיות בכמה ניתן להשתמש. חסימות הנוכחית חלוף המתרחשות ללא חלבונים פתרון עשוי להצביע על כך קאמרית מזוהם. טפלון לתאי ניתן לשטוף עם דגי פיראנה טורפים. PDMS לתאי צריכים להיות טריים תבניות נקי עבור כל ניסוי. Nanopores עם קטן יותר מאשר מוליכות צפוי או שאינו ליניארי אני / V תכונות הרטבה עשויים להעיד כי הוא נכשל. יישום קצר של מתח גבוה (~ 5V) עשוי לשפר את המאפיינים החשמליים של nanopore.אחרת, nanopore יש לשטוף שוב את הפתרון פיראניה. גם בנסיבות הטובות ביותר, nanopores כמה נכשלים רטוב כראוי. היכולת רטוב nanopore תלוי את ממדיו. שני nanopores ניטריד רזה nanopores בקוטר גדול יותר קל יותר רטוב מאשר nanopores ניטריד עבה או nanopores בקוטר קטן יותר. במשך 20 nanopores ננומטר עבה עם רדיוס של 5 ננומטר שיעור ההצלחה הוא כ 70% לאחר כביסה ראשונה. יש להקפיד בבחירת גודל nanopore עבור אנליטי שלך, מאז nanopores חייב להיות גדול מספיק כדי להכיל את החלבון.

הפרוטוקול נדון כאן חל רק על ספיחה על משטח סיליקון ניטריד. משטחים אחרים, כגון תחמוצת סיליקון 9 או אלומינה 23 מאי גם לקידוח באמצעות טכניקה זו, עם זאת מספר סרטים דקים מקובל טכניקה זו היא מוגבלת אלה יכולים להיות מיוצרים כך שהם שעמד חופשי, רזה ללא חורים . כדי להתגבר על בעיה זו, chציפוי emical של nanopore עשוי לשמש 23,38-40. עוד לסחור את הטכניקה nanopore יחיד היא שזה יכול רק להסתכל על מולקולה אחת בכל פעם. כדי להתגבר על מגבלה זו, הצענו חלופה של שימוש מערכים מקבילים של מצב מוצק nanopores 41. מדידות שוטפות עם מערכים nanopore לספק הזדמנות לקבל פרמטרים קינטיים מאקרוסקופיים, כגון לכאורה מסדר ראשון שיעור קבועים התגובה הקליטה desorption. בנוסף, גישה זו תאפשר קביעת קבוע לאנגמיור ספיחה. מגבלה אחת מיידית של טכניקה זו היא חוסר יכולתו לאסוף מידע על משטחים שטוחים ורחבים. המדידות רק בדיקה חלבון ספיחה בתוך בחללים סגורים הפנים של מצב מוצק nanopores מפוברק. במקרים רבים, זה די מאתגר להשיג מידע מדויק על הגיאומטריה ואת פני השטח הפנימי של nanopore. בעבר, חלבון ספיחה היתה לבחון בהרחבהד על ידי microbalance קריסטל קוורץ 28,29. החלבון ספיחה על פני השטח גביש מלווה על ידי ריסון התנועה שהוטלו oscillatory של microbalance גביש, ייצור ירידה בתדירות התהודה. שינוי המסה בשילוב הכולל בשל חלבון ספיחה גורם שינוי תדירות microbalance קריסטל קוורץ. המסה הכוללת חלבון adsorbed קשורה באופן ליניארי לשינוי תדר. זהו העיקרון הבסיסי של טכניקה זו, אשר בעקיפין בדיקות חלבון ספיחה על פני השטח מוגדר היטב שטוח. לעומת זאת, השימוש במערכים nanopore מעסיקה את הטכניקה הדופק התנגדות, כי הוא דומה מקרוב הגישה קולטר נגד 42. שוב, הטכניקה nanopore וניתן לשנותם עד מספר מוגבל של nanopores בקרום, כך adsorptions בודדים ניתן לצפות בזמן אמת. בניגוד microbalance קריסטל קוורץ, המדידות nanopore לא יכול להעריך את תהליך ספיחה על בקנה מידה גדולמשטח שטוח, שבו יכולים להתרחש אירועים נוספים (דיפוזיה, כלומר לרוחב של חלבונים adsorbed), ובכך לייצר שינויים איזותרמות לאנגמיור ספיחה. כמובן, רצוי כי גישות אלו מוקדש חלבון ספיחה יש להשתמש בשילוב אחד עם השני, מכיוון שהם בדיקה רק כמה היבטים של תהליך ספיחה. לדוגמה, ברואר ועמיתיו המועסקים שילוב של קריסטל קוורץ microbalance ζ-פוטנציאל טכניקות להראות כי BSA מחייב על חלקיקי זהב ומשטחים זהב מתרחשת באמצעות מנגנון אלקטרוסטטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו שום דבר לגלות.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות ג'ון Grazul (אוניברסיטת קורנל), אנדרה Marziali (האוניברסיטה של ​​קולומביה הבריטית ונקובר ב) ו - וינסנט התחפושת-Cossa (מאוניברסיטת אוטווה) עבור עצתם. עבודה זו ממומנת בחלקה על ידי תרומות של המוסד האמריקני למדע (DMR-0706517 ו DMR-1006332) לבין המכון הלאומי לבריאות (R01-GM088403). הקידוח nanopore בוצעה במתקן מיקרוסקופית אלקטרונים מרכז קורנל עבור חומרים מחקר (CCMR) בתמיכת הקרן הלאומית למדע - חומרים מדע והנדסה מרכזי מחקר (MRSEC) בתוכנית (DMR 0,520,404). הכנה של ממברנות סיליקון ניטריד בוצעה במתקן ננו קורנל, חבר של רשת ננוטכנולוגיה התשתיות הלאומיות, אשר נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק ECS-0335765).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tecnai F20 S/TEM FEI S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source.
20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM SPI Supplies 4163SN-BA
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices
Axon Digidata 1440A Molecular Devices
pCLAMP 10 software Molecular Devices Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software
Sulfuric Acid Fisher Scientific A300
hydrogen peroxide Fisher Scientific H325
silicone O-rings McMaster-Carr 003 S70 Alternatively use PDMS
silver wire Sigma-Aldrich 348759 For electrodes
SPC Technology, D sub contact, pin Newark Inc 9K4978 For electrodes
potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P2222
potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5379
PDMS Dow Corning Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber.
Kwik-Cast Sealant World Precision Instruments, Inc. KWIK-CAST Fast acting silicone sealant
hot plate Fisher Scientific
Faraday cage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
  2. Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
  3. Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).
  4. Branton, D. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).
  5. Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).
  6. Peng, H., Ling, X. S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).
  7. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).
  8. Zhao, Q. Detecting SNPs using a synthetic nanopore. Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).
  9. Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).
  10. Sexton, L. T. Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor. J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).
  11. Martin, C. R., Siwy, Z. S. Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores. Science. 317, 331-332 (2007).
  12. Sexton, L. T. An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing. J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).
  13. Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface. J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).
  14. Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).
  15. Han, A. Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores. Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).
  16. Han, A. Sensing protein molecules using nanofabricated pores. Appl. Phys. Lett. 88, (2006).
  17. Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore. Appl. Phys. Lett. 91, (2007).
  18. Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis. Nano. Lett. (2010).
  19. Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. Data analysis of translocation events in nanopore experiments. Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).
  20. Oukhaled, A. Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force. ACS. Nano.. (2011).
  21. Yusko, E. C. Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls. Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).
  22. Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).
  23. Wanunu, M., Meller, A. Chemically modified solid-state nanopores. Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).
  24. Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore. Biophys. J. 85, 897-910 (2003).
  25. Aksimentiev, A. Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore. Nanoscale. 2, 468-483 (2010).
  26. Timp, W. Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life. IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).
  27. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry. J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).
  28. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes. J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).
  29. Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).
  30. Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy. Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).
  31. Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events. J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).
  32. Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin. Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).
  33. Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips. Scanning. 21, 394-397 (1999).
  34. Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures. Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).
  35. Giannoulis, C. S., Desai, T. A. Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films. J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).
  36. Gustavsson, J. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications. J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).
  37. Shirshov, Y. M. Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface. Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).
  38. Chen, P. Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores. Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).
  39. Siwy, Z. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).
  40. Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore. Anal. Chem. (2009).
  41. Kim, M. -J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).
  42. Bezrukov, S. M. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).
חלבון ניטור ספיחה עם מצב מוצק nanopores
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560, doi:10.3791/3560 (2011).More

Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560, doi:10.3791/3560 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter