Summary
En metod för att med hjälp av solid-state nanopores att övervaka icke-specifika adsorption av proteiner på en oorganisk yta beskrivs. Metoden använder den resistiva-puls princip gör det möjligt att adsorption ska sonderas i realtid och vid enda molekyl nivå. Eftersom processen med enda protein adsorption är långt från jämvikt, föreslår vi att anställa parallella kedjor av syntetiska nanopores, vilket möjliggör för kvantitativ bestämning av den synbara första ordningens reaktion hastighetskonstant protein adsorption samt och Langmuir adsorption konstant.
Abstract
Solid-state nanopores har använts för att göra mätningar vid enda molekyl nivå för att undersöka den lokala strukturen och flexibilitet av nukleinsyror 1-6, den pågående av proteiner 7 och affinitet för olika ligander 8. Genom att koppla dessa nanopores med resistiv-puls teknik 9-12, kan sådana mätningar göras under en lång rad olika villkor och utan behov för märkning 3. I den resistiva-puls teknik, är en jonisk saltlösning införts på båda sidor av nanopore. Därför joner drivs från ena sidan av kammaren till den andra genom en tillämpad transmembrana potential, vilket resulterar i en stadig ström. Den uppdelning av en analyt i nanopore orsakar en väl definierad utslag i denna ström, som kan analyseras för att extrahera enda molekyl information. Med denna teknik kan adsorptionen av enstaka proteiner till nanopore väggarna övervakas i ett brett spektrum avvillkor 13. Protein adsorption växer i betydelse, för som mikroflödessystem enheter krympa i storlek, blir samspelet mellan dessa system med enstaka proteiner ett problem. Detta protokoll beskriver en snabb test för protein bindning till bornitrid filmer, som lätt kan utvidgas till andra tunna filmer mottaglig för nanopore borrning eller functionalized bornitrid ytor. En mängd olika proteiner kan undersökas inom ramen för ett brett utbud av lösningar och denaturering villkor. Dessutom kan detta protokoll användas för att utforska mer grundläggande problem med hjälp av nanopore spektroskopi.
Protocol
1. Tillverkning av solid-state nanopores i membran kiselnitrid
- Ta med FEI Tecnai F20 S / TEM till en acceleration spänning på 200 kV. Om du använder ett annat S / TEM, bör accelerationen spänningen vara större än eller lika med 200 kV 9
- Ladda ett 20 nm tjockt SPI kisel nätet nitride fönster i TEM provhållaren och ren med syre plasma i 30 sekunder för att ta bort eventuella föroreningar från hållaren.
- Ladda provet till S / TEM och möjliggöra vakuum att pumpa ner. När S / TEM har pumpats ner till vakuum, hitta nitrid fönstret i ljusa fält TEM-läge genom att leta efter en ljus ruta på Ronchigram. Se till att TEM är rätt placerad, sedan rikta och fokusera provet.
- Switch S / TEM i STEM läge. Använd HAADF (eller motsvarande) detektor för att bilden provet och se till att den är korrekt inställd.
- Ställ monokromator till ett lågt värde. Ett lägre värde på monokromator tillåter en större valutort av elektroner för borrning. Om S / TEM inte har en monokromator, ignorera det här steget.
- Välj en lämplig plats storlek för borrning nanopore. Detta motsvarar diametern på elektron sonden. En 3 nm sond fungerar bra för borrning 5 porer nm diameter. En större sond (5 nm) kommer att borra snabbare och skapa en större por. En mindre sond (1 nm) kommer att ta längre tid att borra och skapa en mindre por.
- Justera STEM anpassningar vid behov.
- Fokusera nitrid membranet och föra den till en förstoring av x1.3M. Fin fokus bör göras genom att övervaka Ronchigram.
- Om det finns någon rörelse av provet, sedan vänta på provet för att stabilisera. Detta kan ta upp till en timme. Tomma elektronstrålen väntan för att inte skada bornitrid.
- Placera elektron sond på provet och börja borra.
- Kontrollera regelbundet provet genom skanning med HAADF detektor, både att se till att nanopore är drilled (det kommer se ut som en mörk fläck) och kontrollera att det inte finns någon rörelse av provet. Om provet driver något, justera positionen av elektronen sonden vara över nanopore.
- Titta på Ronchigram att identifiera när porerna har bildats. När du är i fokus, har nitrid filmen en skimrande utseende. Detta kommer att försvinna när nanopore former. Att sätta Ronchigram lite ur fokus gör att man kan se en Fresnel frans i samband med nanopore.
- Ta en bild av nanopore med HAADF.
- Gör en intensitet profil nanopore bilden. Diametern på nanopore kan uppskattas genom den mörkaste delen av profilen.
- Utvidgningen av nanopore kan utföras genom att flytta en elektron sond längs kanterna på porerna.
- När nanopore är av önskad diameter, lägg S / TEM i TEM-läge.
- Ta monokromator till dess normgivning och bild nanopore med ljusa fält TEM att bekräfta storleken
2. Vätning av solid-state nanopore
- De-gas avjoniserat vatten som innehåller 1 M KCl, 10 mm kaliumfosfat, pH 7,4. Detta kan göras genom att sätta lösningar under vakuum och placera dem i ett bad sonicator i 20 minuter.
- Placera nanopore innehåller chip kiselnitrid i en 10 ml Pyrex bägare. Se till att inte bryta nitrid fönstret eftersom det är mycket känslig. Placera bägaren på en värmeplatta i dragskåp och satt till 100 ° C.
- Rengör nanopore chip med piraya-lösning med stor omsorg. Först lägger 3 syra ml svavelsyra till behållaren med hjälp av ett glas pipett. Nästa, tillsätt försiktigt en peroxid ml vätgas till svavelsyra för att göra piraya lösning 14. Vänligen vidta alla försiktighetsåtgärder.
- Låt nanopore chip för att suga i piraya-lösning i 10 minuter.
- Ta bort piraya lösningen ur bägaren med ett glas pipett. Placera den i en lämplig förvaring kärl.
- Fill bägaren med avgasade, avjoniserat vatten med en ren glaspipett. Tomma bägare med vatten och upprepa minst 5 gånger.
- Ta bort nanopore chip med ren pincett och torka den med ljus sug
- Omedelbart försegla nanopore chip i kammaren (fig. 2a, 2b). Chippet kan fästas i kammaren av O-ringar eller silikon.
- Fyll kammaren med KCl-lösning
- Anslut Ag / AgCl elektroder till kammaren (fig. 2b). Elektroder kan göras genom att blötlägga silvertråd i blekmedel över natten.
- Applicera en transmembranös potential över elektroderna och övervaka nuvarande svaret med hjälp av en Axon 200B patch-clamp förstärkare i spänningen-clamp-läge.
- Konstruera en I / V (ström-spänning) kurva från mätningarna. I / V-kurva bör vara mycket linjärt när man använder 1 M KCl (Fig. 3). Värmeledningsförmåga nanopore bör motsvara dess diameter. Om nanopore inte visar enlinjär I / V-kurva, är konduktans för låg, eller den öppna strömmen för nanopore inte är stabil (Fig. 4a), betyder det att nanopore inte är ordentligt fuktade och piraya tvätt bör upprepas.
3. Övervakning proteinadsorption
- Det är ytterst viktigt att utföra kontroll experiment med ett enda nanopore membran eller parallellt mängd nanopores (se nedan) för att övervaka aktuell med bufferten villkor som saknar proteinet provet. Vi rekommenderar följande två steg: (i) användning av en hög renhet nivå buffert (renhet> 99,9%, kromatografi-klass nivå), och (ii) användning av en buffert vars interaktion med solid-state nanopore inte producera en enda kanal händelser. Dessutom rekommenderar vi att få en hög renhet protein prov med hjälp av standardprocedurer proteinkemi. Renhet av proteinet prov bör kontrolleras av natriumdodecylsulfat-polyakrylamid (SDS-PAGE) gel analys och högupplösta mass spektrometri 15.
- Lägg till ett renat urval av det protein som ska studeras i det jordade bad av kammaren. Tillåt tid för provet diffusa i hela badet. Typiska halter av protein som kan mätas är i tiotals nM till mikroM utbud 7,15-21.
- Applicera en transmembranös potentiell spänning partiskhet med polaritet motsatsen till att av den totala avgiften av det protein som studeras. Till exempel har BSA en effektiv netto negativ laddning vid pH 7,4, och därför en positiv spänning partiskhet bör tillämpas. Den pålagda spänningen skapar potential gradient inom nanopore interiör och proteiner av motsatt avgifter kommer att drivas av motsatta krafter. Endast spänningen polaritet som driver proteiner i nanopore kommer att skapa mätbara signaler.
- En tillämpad potentialen i storleksordningen 200 mV bör vara tillräckligt stor för att observera de flesta protein analyter. Evenemang kommer att visas som transienta nuvarande omläggningar från baslinjen (Fig. 4b).Om ingen signal observeras, öka koncentrationen av protein i kammaren. Högre spänningar förbättra signal-brus-förhållande. Nitrid nanopores tål flera volt.
- Protein adsorptions visas som långlivade förändringar i baslinjen ström nanopore (bild 4c).
4. Möjligheter för funktionalisering av nanopores
Det finns flera metoder för att tillämpa funktionella grupper att kiselnitrid 22,23. De flesta bornitrid filmer har ett tunt oxidskikt på utsidan och exponering för ozon kan skapa ytterligare ett oxidskikt, om det behövs. Olika organosilanes kan användas och egna sammansatta på ett sådant lager. Av särskilt intresse är aminosilane, som själv sätter ihop och kan modifieras ytterligare (dvs karboxylsyra och aldehyder), vilket möjliggör inspektion av ett urval av ekologiska ytor. Efter en nanopore har tvättats med piraya och förankrad i chamber, kan amin läggas till direkt i kammaren bad med en stödjande elektrolyt på 0,5 M TBACl (Tetrabutylammonium) och vattenfri MeOH (metanol) används som lösningsmedel. Cellslager bildning kan övervakas genom tillämpning av en 400 mV spänning partiskhet och mätning av den aktuella drop 23.
5. Fastställande av den uppenbara första ordningens reaktion hastighetskonstant och Langmuir adsorptionen konstant med hjälp av parallella nanopore matriser
5,1 Den skenbara första ordningens reaktion hastighetskonstanterna för absorption och desorption
Vi betonar att den positiva aspekten av denna metod är dess förmåga att observera enskilda adsorptions vid enda molekyl nivå. Den enda molekyl mätningar av protein adsorption på en oorganisk yta kan skalas upp genom att använda parallella kedjor av solid-state nanopores. Den parallella utbud av nanopores är nödvändig på grund av behovet att analysera många porer för att få tillförlitlig statistikS. För detta ändamål skulle använda en nanopore array möjliggöra övervakning av enskilda adsorptions samt mätning av flera händelser för ytterligare analys. En mängd nanopores i kiselnitrid får bildas av ovannämnda protokoll helt enkelt genom att borra flera hål i provet. Varje nanopore bör vara av liknande storlek. Kedjor av nanopores av 6x6 eller 7x7 bör vara tillräckligt. Vid sidan av protein analyt i kammaren kommer den nuvarande förfallet i ett exponentiellt, med en följande uttryck:
Jag t = I ∞ - (jag ∞ - Jag 0) exp (-k 't)
Här, jag t, betecknar aktuell vid en experimentell tiden t. I 0 är den ursprungliga ström passerar genom nanopore matrisen. Jag ∞ anger aktuell vid mättnad nivå (dvs. oändligt). K 'är den skenbara första ordningens reaktionshastighet konstant, vilket kan fastställas med hjälp av ee plats i den experimentella kurvan. En större k "kan tolkas som en snabbare adsorption takt. Förhållandet jag ∞ / I 0, även kallad den normaliserade mättnad ström, är ett dimensionslöst tal mellan 0 och 1. Denna parameter är ett mått på den beläggning som adsorberade proteinet analyterna. Därför bör varje tydliga experimentella villkor kan associeras med två specifika utdataparametrar jag ∞ / I 0 och k ".
Det bör noteras att den uppenbara första ordningens adsorption hastighetskonstanterna och normaliserade strömmar påverkas av den effektiva tid som proteiner inom nanopores. Denna tid är beroende av koncentrationen av protein analyter i bulk vattenfasen 24. Därför behöver ytterligare korrigering av dessa siffror som ska genomföras baserat på den effektiva tid som de proteiner inom nanopore interiör. Vi föreslår att mäta frekvensen av FASt (translokation) evenemang och multipliceras med den genomsnittliga uppehållstid av sådana händelser. Detta ger den genomsnittliga tiden för proteiner används inom nanopore interiören per tidsenhet.
Frekvensen konstant desorption kan bestämmas med hjälp av en parallell rad nanopores också. Så snart den aktuella nivån når mättnad (I ∞), bör spänningen vändas, så inga fler proteiner är fångade i nanopores. Desorption av enskilda proteiner kommer att åtföljas av ändringen av det inspelade aktuella mot större värden. Hastighetskonstanten kommer sedan att hämtas från höjningen av nuvarande nivå.
5,2 Den Langmuir adsorptionen konstant
Absorptionen av protein analyter på oorganiska ytor nanopores är beroende av det protein koncentrationen i vattenfasen. Detta fenomen har redan observerats vid enda molekyl nivå 13. Om θ representerar är den normaliserade mättnad ström (I ∞ / I 0), då en typisk Langmuir isoterm ekvationen ges av följande uttryck:
där C är det protein koncentrationen i vattenfasen. α är Langmuir adsorption konstant. Denna konstant ökar med en ökning i bindningsenergi för adsorption och med en minskning av temperaturen. Insamlingen av θ datapunkter kommer att sysselsätta mätningar med parallella arrayer som utförs vid olika protein koncentrationer i vattenfasen. Data bör analyseras i kombination med andra tekniker för att kontrollera omfattningen av monterade Langmuir adsorptionen konstant. Dessutom kan full-atomistisk molekyldynamiksimuleringar 25,26 också användas för att hjälpa tolkningar av erhållna experimentella data.
Titeln "> 6. representativa resultat Typiska resultat för solid-state nanopores kommer att vara följande. Den öppna porerna aktuella bör vara mycket stabila, vilket kan ses i figur. 4a. I / V egenskaper nanopore bör vara mycket linjär i 1 M KCl, 10 kalium fosfat, pH 7,4, vilket kan ses i figur. 2. Lutningen på en linjär passar till I / V-kurvan kommer att ge enhetliga värmeledningsförmåga nanopore. Den konduktans har en direkt relation till nanopore diameter och bör matcha ekvation: 
, Där G är värmeledningsförmåga nanopore är d dess diameter, l dess längd, och σ är konduktiviteten av lösningen i kammaren 14. Detta värde bör matcha till inom 30%. Om den är för liten, är din pore troligen inte fuktade. Med tillsats av protein, bör snabba händelser uppstå, vilket kan ses i figur. 4b. Protein adsorption är en långlivad nuvarande nedgång som visas i bild. 4c. Vissa proteiner är labil mycket och genomgår strukturomvandling i porerna interiör. I detta fall kommer de långlivade spänningsfall åtföljas av snabba svängningar.
Figur 1. Solid-state nanopore fabricerade med hjälp av en Tecnai F20 S / TEM. Pore borrades STEM läge till en diameter på 20 nm. Bilden togs i ljusa fält TEM-läge. Nitrid var 30 nm tjockt.
Figur 2. Avdelningen används för bostäder en solid-state nanopore i resistiv-puls mätning. A) avdelningen och en kisel-chip med fristående nitrid fönster (TEM galler). Den nanopore borras in i nitrid före lastning. Röd O-ringar används för att bilda en bra sEAL om chip, som separerar två bad i joniska lösning. B) Schematisk bild av kammaren visar placering av lösningen bad och elektroder med avseende på nanopore.
Figur 3. Typiska I / V-spår för solid-state nanopores med olika diameter. Singel-kanalen elektriska spår togs i en 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8,5. Nanopores borrades i 30 nm tjockt kiselnitrid. Notera nitrid tjocklek kommer att påverka den enhetliga värmeledningsförmåga nanopore.
Figur 4. Mätt med en kanal nuvarande spår och upptäckt av protein adsorption.) Ett enda-kanals el-spår som visar öppna aktuell för en 10 nm diameter nanopore. B) Nuvarande omläggningar representerar uppdelning av bovint serumalbumin (BSA) i blandIOR av nanopore. C) Adsorption av BSA på nitride ytan. Alla spår är från samma nanopore i en 1 M KCl, 10 mm kaliumfosfat, pH 7,4. Den tillämpade transmembrana potential 40 mV och BSA lades till det jordade kammaren bad vid en koncentration av 120 Nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spontan adsorption av proteiner på solid-state ytor 27-29 är av grundläggande betydelse på en rad områden, såsom biochip applikationer och design av en ny klass av funktionella hybrid biomaterial. Tidigare studier har visat att protein adsorberas till solid-state ytor inte visar lateral rörlighet eller signifikant desorption, och därför proteinadsorption anses allmänt en oåterkallelig och icke-specifik process 30-32. Protein adsorption på fasta tillståndets ytor tros bero på flera faktorer, inklusive elektrostatiska och hydrofoba krafter bland de sidokedjor av de proteiner och den reaktiva grupper på fast-vätska gränssnitt 13.
Processen av protein adsorption har undersökts av flera metoder, såsom Quartz Crystal Microbalance 28,29, elektronmikroskopi, 33,34 ellipsometri, 35 fluorescerande märkning, 36 och Planar polarisering interferometri (PPI). 37 Däremot bygger det enda nanopore och nanopore rad metoder för att upptäcka en kanal aktuella ändringarna som produceras av samspelet mellan single-protein analyter och nanopore interiör.
Det mest kritiska steget för att uppnå positiva resultat är rätt vätning av nanopore interiören. Om pore egenskaper som inte uppfyller specifikationerna diskuteras i resultatavsnittet kan flera felsökning metoder användas. Övergående nuvarande blockader som sker utan några proteiner i lösning kan tyda på att kammaren är förorenad. Teflon kammare kan tvättas med piraya. PDMS kammare bör göras direkt från rena formar för varje experiment. Nanopores med mindre än väntat konduktans eller icke-linjära I / V-egenskaper kan tyda på att blöta misslyckas. En kort tillämpning av hög spänning (~ 5V) kan förbättra elektriska egenskaper nanopore.I annat fall skall nanopore tvättas igen med piraya lösningen. Även i de bästa förhållanden, vissa nanopores inte blöt ordentligt. Förmågan att blöta en nanopore beror på dess dimensioner. Båda tunnare bornitrid nanopores och större nanopores diameter är lättare att blöta än tjockare bornitrid nanopores eller mindre nanopores diameter. För 20 nm tjockt nanopores med en radie på 5 nm chansen att lyckas är cirka 70% efter första tvätt. Försiktighet bör iakttas i valet av en nanopore storlek för din analyt, eftersom nanopores måste vara tillräckligt stor för att rymma protein.
Protokollet diskuteras här bara gäller adsorption till en kiselnitrid yta. Andra ytor, som t.ex. kiseloxid 9 eller aluminiumoxid 23 också kan borras med hjälp av denna teknik, men antalet tunna filmer lämpade för denna teknik är begränsat till dem som kan tillverkas så att de är fristående, tunna och utan hål . För att lösa detta problemet, chemical beläggning av nanopore kan användas 23,38-40. En annan avvägning av den inre nanopore tekniken är att den bara kan titta på en molekyl åt gången. För att övervinna denna begränsning, erbjöd vi ett alternativ att använda parallella arrayer av solid-state nanopores 41. Aktuella mätningar med nanopore matriser ger en möjlighet att få makroskopiska kinetiska parametrar, exempelvis den uppenbara första ordningens konstanter reaktion absorptionshastigheten och desorption. Dessutom skulle denna strategi att bestämning av Langmuir adsorptionen konstant. En omedelbar begränsning av denna teknik är dess oförmåga att samla in information om platt och brett underlag. Mätningarna kommer bara sond proteinadsorption i trånga utrymmen i det inre av fabricerade solid-state nanopores. I många fall är det utmanande ganska få exakt information om geometri och insidan av nanopore. Förr i tiden var proteinadsorption undersöka utförligtd med Quartz Crystal Microbalance 28,29. Det protein adsorption på kristallen yta åtföljs av en dämpning av den införda oscillerande rörelse kristall mikrovåg, som producerar en minskning i resonansfrekvens. En ändring av det kopplade totala massan på grund av protein adsorption inducerar en frekvens förskjutning av kvartskristall mikrovåg. Den totala adsorberade proteinmassa är linjärt relaterad till frekvensen skift. Detta är den underliggande principen för denna teknik, vilket indirekt sonder protein adsorption på en väl definierad plan yta. Däremot sysselsätter användningen av nanopore matriser den resistiva-puls teknik som är nära liknar Coulter motverka tillvägagångssätt 42. Återigen kan nanopore teknik skalas ned till ett begränsat antal nanopores i ett membran, så enskilda adsorptions kan ses i realtid. I motsats till kvartskristall mikrovåg, nanopore mätningar kan inte bedöma adsorption processen på en storskalig ochplan yta, i vilken ytterligare händelser kan inträffa (dvs lateral spridning av adsorberat proteiner), som producerar därmed förändringar i Langmuir adsorptionsisotermerna. Naturligtvis är det önskvärt att dessa metoder ägnas åt proteinadsorption bör användas i kombination med varandra, eftersom de sond endast några aspekter av adsorption processen. Till exempel Brewer och kollegor anställt en kombination av kvartskristall mikrovåg och ζ potential tekniker för att visa att BSA bindande på guld nanopartiklar och ytor guld sker via en elektrostatisk mekanism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka John Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia i Vancouver) och Vincent Tabard-Cossa (The University of Ottawa) för sina råd. Detta arbete finansieras delvis genom bidrag från US National Science Foundation (DMR-0.706.517 och DMR-1.006.332) och National Institutes of Health (R01-GM088403). Den nanopore borrning utfördes vid elektronmikroskopi Facility av Cornell Centrum för Materials Research (CCMR) med stöd från National Science Foundation - Materials Research Science and Engineering Center (MRSEC) program (DMR 0.520.404). Beredningen av kiselnitrid membran utfördes vid Cornell nanoskala Facility, en medlem av National Nanotechnology Infrastructure Network, som stöds av National Science Foundation (Grant ECS-0.335.765).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
| 20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI Supplies | 4163SN-BA | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
| silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
| SPC Technology, D sub contact, pin | Newark Inc | 9K4978 | For electrodes |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
| hot plate | Fisher Scientific | ||
| Faraday cage |
References
- Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
- Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
- Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).
- Branton, D. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).
- Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).
- Peng, H., Ling, X. S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).
- Zhao, Q. Detecting SNPs using a synthetic nanopore. Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).
- Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).
- Sexton, L. T. Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor. J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).
- Martin, C. R., Siwy, Z. S. Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores. Science. 317, 331-332 (2007).
- Sexton, L. T. An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing. J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).
- Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface. J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).
- Han, A. Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores. Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).
- Han, A. Sensing protein molecules using nanofabricated pores. Appl. Phys. Lett. 88, (2006).
- Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore. Appl. Phys. Lett. 91, (2007).
- Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis. Nano. Lett. , (2010).
- Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. Data analysis of translocation events in nanopore experiments. Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).
- Oukhaled, A. Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force. ACS. Nano.. , (2011).
- Yusko, E. C. Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls. Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).
- Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).
- Wanunu, M., Meller, A. Chemically modified solid-state nanopores. Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).
- Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore. Biophys. J. 85, 897-910 (2003).
- Aksimentiev, A. Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore. Nanoscale. 2, 468-483 (2010).
- Timp, W. Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life. IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).
- Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry. J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).
- Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes. J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).
- Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).
- Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy. Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).
- Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events. J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).
- Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin. Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).
- Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips. Scanning. 21, 394-397 (1999).
- Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures. Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).
- Giannoulis, C. S., Desai, T. A. Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films. J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).
- Gustavsson, J. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications. J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).
- Shirshov, Y. M. Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface. Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).
- Chen, P. Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores. Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).
- Siwy, Z. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).
- Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore. Anal. Chem. , (2009).
- Kim, M. -J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).
- Bezrukov, S. M. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).
