Summary
Une préparation hautement purifiée de cellules de souris pulmonaires dendritiques est décrite. Un accent particulier est donné à l'isolement de sous-ensemble de cellules dendritiques conventionnelles.
Abstract
Cellules dendritiques pulmonaires (DC) jouent un rôle fondamental dans la détection des pathogènes envahisseurs 1,2 ainsi que dans le contrôle des réponses tolérogènes 3 dans les voies respiratoires. Au moins trois sous-ensembles principaux de cellules dendritiques pulmonaires ont été décrites chez la souris: DC conventionnelles (CDC) 4, DC plasmacytoïdes (pDC) 5 et le tueur de l'IFN-production DC (IKDC) 6,7. Le sous-ensemble CDC est le sous-ensemble DC les plus éminents dans les poumons 8.
Le marqueur commun connus pour identifier des sous-DC est CD11c, un type que je transmembranaire intégrines (β2) qui est également exprimé sur les monocytes, les macrophages, les neutrophiles et des cellules B 9. Dans certains tissus, en utilisant comme marqueur CD11c pour identifier la souris DC est valable, comme dans la rate, où la plupart des cellules CD11c + représentent le sous-ensemble des CDC, qui exprime des niveaux élevés de l'complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II). Toutefois, le poumon est un tissu plus hétérogène, où secôté des sous-ensembles DC, il ya un pourcentage élevé d'une population de cellules distinctes qui exprime des niveaux élevés de CD11c bout de faibles niveaux de CMH-II. Basé sur sa caractérisation et surtout sur l'expression de ses F4/80, un marqueur des macrophages spléniques, le CD11c Salut CMH-II de la population lo cellules du poumon a été identifié comme les macrophages pulmonaires 10 et plus récemment, comme un précurseur potentiel DC 11.
Contrairement à la souris PDC, l'étude du rôle spécifique de la CDC dans la réponse immunitaire pulmonaire a été limitée en raison de l'absence d'un marqueur spécifique qui pourrait aider dans l'isolement de ces cellules. Par conséquent, dans ce travail, nous décrivons une procédure pour isoler hautement purifiée de souris pulmonaires CDC. L'isolement des sous-ensembles DC pulmonaires représente un outil très utile afin de mieux connaître la fonction de ces cellules en réponse à des agents pathogènes des voies respiratoires ainsi que les facteurs environnementaux qui peuvent déclencher la réponse immunitaire de l'hôte dans les poumons.
Protocol
1. Perfusion pulmonaire et la suspension seule cellule
- Euthanasier la souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine / xylazine mélange anesthésique (en mg / souris kétamine 1.8, xylazine 0,19) et une exsanguination par la veine fémorale
- Exposer la cavité thoracique en coupant et en tirant doucement en arrière la peau externe du péritoine. Procéder à l'ouverture du diaphragme par la coupe de la cage thoracique afin d'exposer à la fois le cœur et les poumons.
- Perfuser délicatement les poumons en utilisant une seringue de 5 ml remplie avec de l'EDTA-HBSS (1mM EDTA en calcium / magnésium sans HBSS). Connecter une aiguille de 25 G et insérer l'aiguille dans le ventricule droit. Pour éviter les fuites lors de l'injection, sécuriser le tissu myocardique autour de l'aiguille en utilisant une pince. Doucement injecter la solution, tout en maintenant une pression constante. Perfusion précis se traduira par l'inflation du poumon et un changement de couleur rose / blanc.
- Retirer les ganglions lymphatiques drainant à écarter toute contamination éventuelle de ce tissu.
- Recueillirtissu pulmonaire, transfert à une boîte de Pétri sur la glace, et le hacher en petits morceaux à l'aide d'une lame de rasoir.
- Transfert des tissus à la terre dans un tube gentleMACS C contenant 5 ml / poumon de la solution de digestion par la collagénase (collagénase de type 1A 0,5 mg / ml, plus de type IV pancréatique bovine DNase 20 ug / ml dans du HBSS contenant 5% de FBS, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug ml de streptomycine /).
- Utilisez le dissociateur gentleMACS pour obtenir une suspension cellulaire unique. Choisissez le programme: m_lung_01. Incuber l'échantillon à 37 ° C pendant 30 minutes. Agiter le tube toutes les 5 minutes pour remettre les fragments de tissus. Procéder à m_lung_02 programme.
- Transférer l'échantillon dans un tube de 15 ml conique et centrifuger pendant 10 minutes à 335 x g à 4 ° C. Après cette étape, gardez tous les réactifs et centrifugations à 4 ° C pour empêcher la réduction de la viabilité cellulaire.
- Rejeter le surnageant et lyser les globules rouges restants en ajoutant 2 ml de tampon de lyse ACK pendant 1 minute à température ambiante. Laver les cellules avec 13ml de BSA PBS/0.5% froid et centrifuger pendant 10 minutes à 335 x g à 4 ° C.
- Rejeter le surnageant, resuspendre nombre total de cellules dans 5 ml de BSA PBS/0.5% froid et passer un maillage complet 100 um en nylon.
- Déterminer le nombre total de cellules en utilisant colorant exclusion du bleu trypan.
2. Isolation magnétique et CD11c + cellules d'enrichissement
- Centrifuger la suspension seule cellule pendant 10 minutes à 200 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant.
- Resuspendre le culot cellulaire dans 400 pl de tampon de séparation (PBS, BSA 0,5%, et 2 mM d'EDTA) par 10 8 cellules totales. Bloc-Fc des anticorps médiée imprécise de liaison en utilisant des anticorps anti-CD16/CD32 (0.5μg / 10 6 cellules) pendant 30 minutes à 4 ° C.
- Laver les cellules avec 10 ml de tampon de séparation à froid et centrifuger pendant 10 minutes à 200 x g à 4 ° C. Resuspendre les cellules dans 400 ul de tampon de séparation.
- Ajouter 100 ul de microbilles CD11c par 10 8
- Laver les cellules avec 10 ml de tampon de séparation à froid et centrifuger pendant 10 minutes à 200 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant.
- Reprendre le culot cellulaire dans 3 ml de tampon de séparation à froid.
- Effectuer la séparation magnétique à l'aide de la autoMACS Pro TM Séparateur en sélectionnant le posseld programme. Recueillir la fraction positive (0,5 ml).
3. Cellules dendritiques classiques (CDC) d'isolation
- Incuber enrichi CD11c suspension cellulaire positifs avec des anti-CD11c PE-Cy7 et anti-IA/IE (CMH-II)-FITC anticorps pendant 30 minutes à 4 ° C. La concentration d'anticorps est optimisée 0,5 pg / 10 6 de cellules.
- Laver les cellules avec de la BSA PBS/0.5% froid et centrifuger pendant 10 minutes à 335 x g à 4 ° C. Resuspendre les cellules dans 0,5 ml de BSA PBS/0.5% et les faire passer à travers une maille de 40 um de nylon.
- Passez àtrier les cellules en utilisant le trieur FACS Aria cellulaire dans le mode de pureté. Ajouter 100 ul de BSA PBS/0.5% sur les tubes de collecte afin de prévenir tout dommage des cellules purifiées. Gardez vos cellules à une température réfrigérée au long du processus de tri cellulaire.
4. Protocole alternatif pour l'obtention d'une suspension cellulaire unique et CD11c + cellules d'enrichissement
- En remplacement de la dissociateur gentleMACS, le tissu pulmonaire à la terre de l'étape 1.5 peut être transféré à un tube de 15 ml conique contenant 5 ml de solution de collagénase par poumon et incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Vortex cellules toutes les 15 minutes afin de remettre en suspension des fragments de tissus. Perturber le tissu en passant l'échantillon 6-8 fois dans et à travers une seringue de 3 ml connecté à une aiguille 20 G. Évitez de faire des bulles pendant le processus, sinon la viabilité des cellules sera compromise. Une fois la suspension cellulaire unique est obtenue, passez à l'étape 1.8.
- En remplacement de la séparation AutoMACSPro MCTor, isolation magnétique pour l'enrichissement des cellules CD11c, peut également être effectuée par le passage de la suspension cellulaire manuelle à travers des colonnes MACS deux. La sélection des colonnes appropriées varieront en fonction de la taille de l'échantillon.
5. Les résultats représentatifs:
Lung CDC sont identifiés comme CD11c Salut / CMH-II population de cellules Salut. Comme indiqué dans la Fig. 1, CDC représentent un pourcentage inférieur de 1,4% par rapport à certains autres tissus tels que la rate (4,8%). Cependant, contrairement à la rate, les poumons des cellules CD11c positifs d'exprimer des quantités différentes de CMH-II, y compris une population cellulaire différent de celui des CDC. Après la préparation à cellule unique, le rendement cellulaire des cellules pulmonaire totale était d'environ 3,0 à 3,8 x 10 7 cellules / poumon avec une viabilité de 60-70% à partir de laquelle un peu plus de 1% a représenté sous la CDC. Ce pourcentage a augmenté après l'isolement CD11c magnétique où le poumon totale CDC a été incrémenté environ 10 tIMES (> 16%) de la préparation originale (figure 2A). Cependant, les cellules CD11c exprimer de faibles quantités de CMH-II (CD11c Salut / CMH-II lo, les macrophages) représentent une population de cellules contaminantes haute (> 70%) qui a été mélangé avec le sous-ensemble des poumons CDC. Comme indiqué dans la Fig. 2B, ces cellules ont été éliminées après l'étape de tri cellulaire lorsque la pureté CDC atteint> 96%. Le rendement habituel de la CDC, après toute la procédure était de 5 x 10 4 cellules / poumon. Microphotographies montrent des caractéristiques morphologiques de la CDC comme des cellules arrondies avec les dendrites typiques (panneau supérieur). D'autre part, CD11c Salut / CMH-II lo représenté un sous-ensemble morphologiquement différentes qui montre protubérances cellulaires qui sont typiques des macrophages (MΦ, panneau inférieur) 12.
Figure 1. Différentiel DC fréquence des poumons de souris et la rate. Lung unetissu splénique ND de souris C57BL / 6 ont été collectées et traitées avec de la collagénase. Après digestion à la collagénase, les cellules ont été colorées avec anti-souris CD11c-PE-Cy7 et anti-souris IA / IE-FITC. Parcelles représentant de cytométrie en flux montrent des pourcentages de la CDC (CD11c Salut / CMH-II Salut) dans les poumons et la rate.
Figure 2. Isolement de la CDC à partir des poumons de souris. Poumons de souris des cellules de suspension unique a été étiqueté avec des anti-CD11c microbilles et passé à travers un séparateur de cellules automatique. A) Un graphique représentatif montre les pourcentages de la CDC (CD11c Salut / CMH-II Salut) et Les macrophages (MΦ, CD11c Salut / CMH-II LO) des populations après enrichissement CD11c. Coloration plus de la fraction enrichie en utilisant suivi anti-souris CD11c-PE-Cy7 et anti-souris IA / IE-FITC. Double cellules positives ont été triées et analysées par cytométrie en flux. Pourd'identifier leur morphologie, les cellules ont été cytospun et colorées avec une modification Wright-Giemsa coloration. B) parcelles représentant montrent des pourcentages de la CDC et MΦ après tri cellulaire. Microphotographies montrent une image représentative du poumon et de la CDC MΦ poumon. Barre d'échelle = 20 um.
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Discussion
L'isolement de la souris pulmonaires DC est une technique importante pour l'étude d'un large éventail de stimuli respiratoires. Le processus d'obtention de ces cellules comprend des étapes critiques qui empêchent la perte de cellules ainsi que la viabilité des cellules et la pureté. Perfusant le poumon avant la collecte aidera à éliminer toutes les cellules périphériques ainsi que de réduire les érythrocytes contaminant. L'utilisation de la dissociation peut être automatisé advanteogus quand un grand nombre de poumons sont manipulés, sinon vous pouvez opter pour le protocole alternatif, en gardant à l'esprit que la dispersion du tissu après digestion par la collagénase devrait être fait en douceur lorsque vous avez terminé manuellement. La période d'incubation du tissu pulmonaire tandis solution de collagénase ne devrait pas être prolongé au-delà du temps d'incubation indiqué. Après cette étape, le processus reste doit être fait en utilisant glacée tampons et centrifugeuses réfrigérées pour réduire la mort cellulaire. La lyse des globules rouges contaminant est une étape qui ne devrait pas être répété plus de tHan deux fois pendant tout le processus. Passant de la suspension cellulaire à travers une maille de nylon, les étapes indiquées, est essentielle pour éviter le colmatage de la trieuse de cellules ainsi que pour réduire les agrégats de cellules qui compromettent la pureté des cellules. Si la culture d'autres in vitro de cellules isolées est impliqué, toutes les étapes doivent être réalisées sous une enceinte de biosécurité afin de prévenir toute contamination. Il n'est pas prévu que l'étape de tri cellulaire sera compromettre la stérilité de l'échantillon.
Les cellules dendritiques sont essentielles pour les études sur les interactions immunitaire innée et adaptative. La procédure décrite a le potentiel pour être appliqué pour l'isolement des sous-ensembles DC d'autres si les anticorps appropriés sont utilisés pendant l'isolement magnétique et le tri cellulaire 8. De plus, les macrophages pulmonaires (CD11c Salut / CMH-II LO) peut également être purifiée à partir de la préparation même cellule. Malgré le nombre limité de DC pulmonaire qui peut être isolé par animal bY en utilisant cette procédure, cette technique fournit le système le plus précis pour étudier DC du poumon. Toutefois, avant l'isolement DC, les souris pourraient être traitées avec fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3-) Ligand, un agent qui augmente le nombre DC 13. Bien que DC rate peut être plus facile et plus rapide pour isoler, les différences dans l'état de maturation de la DC dans les poumons et la rate doit être pris en considération. Contrairement à la rate DC, DC pulmonaires exprimer un phénotype immature qui est passé à une maturité après une infection virale par exemple 8,14.
En résumé, l'isolement des sous-ensembles spécifiques de cancer du poumon continue à travers le protocole décrit, fournit un outil unique qui peut aider à déterminer le rôle spécifique et / ou la contribution de DC pulmonaires dans les réponses immunitaires de l'hôte et peut être appliqué à n'importe quel modèle expérimental chez la souris qui implique l'étude des voies respiratoires.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Dietrich à Marilyn à l'installation de débit de base UGB Cytométrie pour son aide avec le tri cellulaire et Peter Mottram pour son aide avec les microphotographies. Ce travail a été financé par le Flight Attendant Institut de recherche médicale, le Prix du LSU-concurrentiel du Programme de recherche et les subventions du NIH / NIAID P20 RR020159 et R03AI081171.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
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