Summary
Ein hoch gereinigte Präparation von Mauslunge dendritischen Zellen beschrieben wird. Besonderer Nachdruck wird auf die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen Teilmenge gegeben.
Abstract
Lung dendritische Zellen (DC) spielen eine fundamentale Rolle in der Sensorik eindringende Krankheitserreger 1,2 sowie in der Kontrolle von tolerogenen Antworten 3 in die Atemwege. Mindestens drei Teilmengen von Lungen-dendritische Zellen in Mäusen beschrieben worden: konventionelle DC (CDC) 4, plasmazytoide DC (pDC) 5 und die IFN-Produktion Killer DC (IKDC) 6,7. Die CDC Subset ist das prominenteste DC Teilmenge in der Lunge 8.
Die gemeinsame Marker bekannt, DC Teilmengen zu identifizieren ist CD11c, eine Typ-I-Transmembran-Integrin (β2), die auch auf Monozyten, Makrophagen, Neutrophilen und einigen B-Zellen 9 ist zum Ausdruck gebracht. In einigen Geweben, mit CD11c als Marker zur Maus DC identifizieren gilt, wie in der Milz, wo die meisten CD11c + Zellen stellen die CDC Subset, das hohe Niveau des Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II (MHC-II) zum Ausdruck bringt. Allerdings ist die Lunge ein heterogenes Gewebe, wo seinSeite DC Teilmengen gibt es einen hohen Prozentsatz von einer deutlichen Zellpopulation, die ein hohes Maß an CD11c drückt Kampf geringe MHC-II. Basierend auf der Charakterisierung und vor allem auf seinen Ausdruck F4/80, eine Milz-Makrophagen-Marker, die CD11c hallo MHC-II lo Lunge Zellpopulation Lungenmakrophagen 10 und in jüngerer Zeit identifiziert worden, wie ein potenzieller DC Vorstufe 11.
Im Gegensatz zu Maus pDC, hat das Studium der spezifischen Rolle der CDC in den pulmonalen Immunantwort wurde durch das Fehlen einer spezifischen Markierung, die in die Isolation dieser Zellen helfen könnte begrenzt. Daher wird in dieser Arbeit beschreiben wir ein Verfahren zu hoch gereinigten Mauslunge cDC isolieren. Die Isolierung der pulmonalen DC Teilmengen stellt ein sehr nützliches Werkzeug, um Einblicke in die Funktion dieser Zellen in Reaktion auf die Erreger respiratorischer Erkrankungen sowie Umwelt-Faktoren, die die Immunantwort des Wirtes in der Lunge auslösen kann gewinnen.
Protocol
1. Lung Perfusion und einzigen Zellsuspension
- Euthanize die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin / Xylazin Narkose-Gemisch (in mg / Maus Ketamin 1,8, Xylazin 0,19) und Ausbluten über die Vena femoralis
- Expose der Brusthöhle durch Schneiden und vorsichtig wieder die Außenhaut des Bauchfells. Fahren Sie mit dem Zwerchfell, indem die Rippen, um sowohl die Herz und Lunge aussetzen zu öffnen.
- Perfundieren sanft die Lungen mit einer 5 ml Spritze mit EDTA-HBSS (1mM EDTA in Calcium / Magnesium-freien HBSS) gefüllt. Schließen Sie eine 25 G Nadel und legen Nadel in die rechte Herzkammer. Zur Vermeidung von Leckagen während der Injektion, sichern Sie die myokardiale Gewebe um die Nadel mit einer Pinzette. Vorsichtig injizieren Lösung bei konstantem Druck. Genaue Perfusion wird in Lunge Inflation und ein Farbumschlag nach rosa / weiß Ergebnis.
- Entfernen Lymphknoten um eine mögliche Verunreinigung von diesem Gewebe zu verwerfen.
- SammelnLungengewebe, in eine Petrischale übertragen auf Eis, und hacken sie in kleine Stücke mit einer Rasierklinge.
- Transfer geerdet Gewebe in eine gentleMACS C Rohr mit 5 ml / Lunge Kollagenaseverdau Lösung (Kollagenase Typ 1A 0,5 mg / ml plus Typ IV Rinderpankreas DNase 20 pg / ml in HBSS mit 5% FBS, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin).
- Verwenden Sie die gentleMACS dissociator auf eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Wählen Sie Programm: m_lung_01. Inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C für 30 Minuten. Schütteln Rohr alle 5 Minuten, um Gewebeteile zu resuspendieren. Fahren Sie mit dem Programm m_lung_02.
- Transfer-Probe auf eine 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie für 10 Minuten bei 335 x g bei 4 ° C. Nach diesem Schritt zu halten alle Reagenzien und Zentrifugation bei 4 ° C zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen zu verhindern.
- Überstand verwerfen und zu lysieren restlichen roten Blutkörperchen durch Zugabe von 2 ml ACK Lysepuffer für 1 Minute bei Raumtemperatur. Wash-Zellen mit 13ml kaltem PBS/0.5% BSA und Zentrifuge für 10 Minuten bei 335 x g bei 4 ° C.
- Überstand resuspendieren gesamten Zellen in 5 ml kaltem PBS/0.5% BSA und pass gründliche einer 100 um Nylon-Mesh.
- Bestimmen Sie die gesamte Zellzahl durch Trypanblau-Ausschluss-Farbstoff.
2. Magnetische Trennung und CD11c + Zellen Bereicherung
- Centrifuge einzigen Zellsuspension für 10 Minuten bei 200 x g bei 4 ° C und Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Zellpellet in 400 ul der Trennung Puffer (PBS, 0,5% BSA und 2 mM EDTA) pro 10 8 insgesamt Zellen. Block Fc-vermittelte unspezifische Antikörper-Bindung durch anti-CD16/CD32 Antikörper (0.5μg / 10 6 Zellen) für 30 Minuten bei 4 ° C.
- Wash-Zellen mit 10 ml kaltem Trennpuffers und Zentrifuge für 10 Minuten bei 200 x g bei 4 ° C. Die Zellen in 400 ul der Trennung Puffer.
- 100 l von CD11c MicroBeads pro 10 8
- Wash-Zellen mit 10 ml kaltem Trennpuffers und Zentrifuge für 10 Minuten bei 200 x g bei 4 ° C und Überstand verwerfen.
- Zellpellet in 3 ml kaltem Trennpuffers.
- Führen magnetische Trennung mit dem autoMACS Pro TM Separator, indem Sie das Programm posseld. Sammeln Sie die positiven Fraktion (0,5 ml).
3. Konventionelle dendritischen Zellen (CDC) Isolierung
- Inkubieren bereichert CD11c positive Zellsuspension mit anti-CD11c PE-Cy7 und anti-IA/IE (MHC-II)-FITC-Antikörper für 30 Minuten bei 4 ° C. Optimierte Konzentration von Antikörpern liegt bei 0,5 pg / 10 6 Zellen.
- Wash-Zellen mit kaltem PBS/0.5% BSA und Zentrifuge für 10 Minuten bei 335 x g bei 4 ° C. Die Zellen in 0,5 ml PBS/0.5% BSA und leiten sie durch ein 40 um Nylon-Mesh.
- Gehen Sie zurArt der Zellen mit Hilfe der FACS Aria Zellsortierer in der Reinheit Modus. 100 l des PBS/0.5% BSA, um die Sammlung Röhren, um eine Beschädigung der gereinigten Zellen verhindern. Halten Sie Ihre Zellen bei einer Kühltemperatur in der Zelle Sortierung.
4. Alternate-Protokoll für den Erhalt einer Zellsuspension und CD11c + Zellen Bereicherung
- Als Ersatz für die gentleMACS dissociator kann geerdet Lungengewebe aus Schritt 1.5 in ein 15 ml konischen Röhrchen mit 5 ml Kollagenase-Lösung pro Lunge und inkubieren für 1 Stunde bei 37 ° C übertragen werden Vortex-Zellen alle 15 Minuten, um Gewebeteile zu resuspendieren. Stören des Gewebes, indem die Probe 6-8 mal in und durch eine 3 ml Spritze verbunden, um eine 20 G Nadel. Vermeiden Sie Luftblasen während des Prozesses, da sonst die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt wird. Sobald einzelne Zelle Suspension erhalten wird, weiter auf 1,8 Schritt.
- Als Ersatz für die AutoMACSPro TM Trennungtor, magnetische Trennung für die Anreicherung der CD11c Zellen, kann auch durch das Bestehen der Zellsuspension manuell durch zwei MACS Säulen durchgeführt werden. Die Auswahl der entsprechenden Spalten ist abhängig von der Stichprobengröße.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Lung CDC als CD11c hallo / MHC-II hallo Zellpopulation identifiziert. Wie in Abb.. 1, vertreten cDC einen kleineren Prozentsatz von 1,4%, wenn zu einigen anderen Geweben wie Milz (4,8%) verglichen. Doch im Gegensatz zu Milz-, Express-Lungen-CD11c positive Zellen unterschiedliche Mengen an MHC-II, einschließlich einer Zellpopulation, anders als das der CDC. Nach der Single-Cell-Vorbereitung, wurde die Zelle Ausbeute von insgesamt Lungenzellen etwa 3,0 bis 3,8 x 10 7 Zellen / Lunge mit einer Tragfähigkeit von 60-70% aus, die ein wenig mehr als 1% cDC Teilmenge vertreten. Dieser Prozentsatz wurde nach der CD11c magnetische Trennung, wo die gesamte Lunge cDC ca. 10 t erhöht wurde erhöhtimes (> 16%) aus dem ursprünglichen Präparat (Abb. 2A). Allerdings vertreten CD11c exprimieren geringe Mengen an MHC-II (CD11c hallo / MHC-II lo, Makrophagen) eine hohe Kontamination Zellpopulation (> 70%), die mit der Lunge cDC Teilmenge gemischt wurde. Wie in Abb.. 2B, wurden diese Zellen nach der Zellsortierung Schritt bei der CDC Reinheit> 96% erreicht eliminiert. Die übliche Rendite von CDC nach dem ganzen Verfahren wurde 5 x 10 4 Zellen / Lunge. Mikrophotographien zeigen morphologische Merkmale der CDC als abgerundete Zellen mit den typischen Dendriten (oberes Bild). Auf der anderen Seite, vertreten CD11c hallo / MHC-II lo eine morphologisch unterschiedliche Teilmenge, dass zelluläre Ausstülpungen, die typisch für Makrophagen (MΦ, unten) 12 sind zeigt.
Abbildung 1. Differential DC Frequenz in Maus Lunge und Milz. Lunge einend Milzgewebe von C57BL / 6 Mäuse wurden gesammelt und mit Kollagenase behandelt. Nach Kollagenaseverdau wurden die Zellen mit anti-Maus-CD11c-PE-Cy7 und anti-Maus-IA / IE-FITC gefärbt. Vertreter der Durchflusszytometrie Plots zeigen Prozentsätze der CDC (CD11c hallo / MHC-II hallo) in Lunge und Milz.
Abbildung 2. Isolation von CDC aus Mauslunge. Mauslunge einzigen Zellsuspension wurde mit anti-CD11c Mikroperlen gekennzeichnet und durch eine automatische Zellseparator. A) Eine repräsentative Darstellung zeigt die Prozentsätze der CDC (CD11c hallo / MHC-II hallo) und Makrophagen (MΦ, CD11c hallo / MHC-II lo) Bevölkerung nach CD11c Bereicherung. Weitere Färbung der angereicherten Fraktion folgte mit Anti-Maus-CD11c-PE-Cy7 und anti-Maus-IA / IE-FITC. Doppel-positive Zellen wurden sortiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. ZuIdentifizierung ihrer Morphologie, Zellen wurden cytospun und mit einem modifizierten Wright-Giemsa-Färbung gefärbt. B) Repräsentative Plots zeigen Prozentsätze von CDC und MΦ nach cell sorting. Mikrofotografien zeigen ein repräsentatives Bild der Lunge cDC und Lunge MΦ. Balken = 20 um.
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Discussion
Isolation der pulmonalen Maus DC ist eine wichtige Technik für die Untersuchung einer breiten Palette von Atemwegs-Reize. Das Verfahren zur Erlangung dieser Zellen enthält kritische Schritte, dass der Verlust von Zellen sowie die Lebensfähigkeit der Zellen und Reinheit zu verhindern. Perfusion der Lunge vor der Abholung wird dazu beitragen, die peripheren Zellen zu eliminieren, sowie verringern Verunreinigungen Erythrozyten. Der Einsatz der automatisierten Dissoziation kann advanteogus werden, wenn eine große Zahl von Lungen behandelt werden, sonst kann man für die alternative Protokoll entscheiden, wenn man bedenkt, dass die Verteilung der Gewebe nach Kollagenaseverdau vorsichtig getan werden sollte, wenn manuell durchgeführt. Die Inkubationszeit des Lungengewebes, während in Kollagenase-Lösung sollte nicht über die angegebene Inkubationszeit verlängert werden. Nach diesem Schritt müssen die verbleibenden Verfahren erfolgt mit eiskaltem Puffer und Kühlzentrifugen zum Zelltod zu reduzieren. Die Lyse kontaminierender Erythrozyten ist ein Schritt, der nicht wiederholt werden mehr t werdenhan zweimal während des gesamten Prozesses. Vorbei an der Zellsuspension durch ein Nylonnetz, bei der angegebenen Schritte, ist entscheidend für die Verstopfung der Zell-Sorter sowie Zellaggregate, die die Reinheit der Zellen beeinträchtigen reduzieren zu verhindern. Wenn eine weitere Kultur in vitro der isolierten Zellen beteiligt ist, müssen alle Schritte unter einem Biosicherheitswerkbank, um eine Kontamination zu verhindern durchgeführt werden. Es wird nicht erwartet, dass die Zell-Sortierung Schritt wird die Sterilität der Probe Kompromiss.
Dendritische Zellen sind von entscheidender Bedeutung für das Studium des angeborenen und adaptiven Immunsystems Wechselwirkungen. Das beschriebene Verfahren hat das Potenzial, für die Isolierung von anderen DC Teilmengen angewendet werden, wenn entsprechende Antikörper während der magnetische Isolation und die Zellsortierung 8 verwendet. Darüber hinaus können pulmonale Makrophagen (CD11c hallo / MHC-II lo) auch aus der gleichen Zelle Vorbereitung gereinigt werden. Trotz der begrenzten Zahl von Lungen-DC, dass pro Tier b isoliert werden könneny mit diesem Verfahren, bietet diese Technik die genaueste System zur Lunge DC studieren. Doch vor DC Isolation konnte Mäusen mit fms-like Tyrosinkinase 3 (FLT3-) Ligand, ein Agent, der DC-Nummern erhöht 13 behandelt werden. Obwohl Milz DC kann einfacher und schneller zu isolieren, müssen die Unterschiede in der Reifung Zustand des DC in Lunge und Milz in Betracht gezogen werden. Im Gegensatz zu Milz DC-, Lungen-DC Ausdruck einer unreifen Phänotyp, die zu einer reifen nacheinander z. B. eine Virusinfektion 8,14 eingeschaltet ist.
Zusammenfassend die Isolierung der spezifische Teilmengen von Lungen-DC durch die beschriebenen Protokoll, bietet ein einzigartiges Werkzeug, das dazu beitragen, die spezifische Rolle und / oder Beitrag der pulmonalen DC in der Host-Immunantworten zu bestimmen und kann zu jeder experimentellen Mausmodell angewandt werden können Dazu gehört die Untersuchung der Atemwege.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten sich an Marilyn Dietrich an der LSU Durchflusszytometrie Core Facility danken für ihre Hilfe bei der Zellsortierung und Peter Mottram für seine Unterstützung bei der Mikrophotographien. Diese Arbeit wurde von der Flight Attendant Medical Research Institute, die LSU-Competitive Research Program Award und den NIH / NIAID Grants P20 RR020159 und R03AI081171 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
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