Summary
マウス肺樹状細胞の高度に精製された調製物が記載されている。特定の重点は、従来の樹状細胞サブセットの分離に与えられます。
Abstract
肺の樹状細胞（DC）は、侵入病原体の1,2と同様に気道の免疫寛容の回答3の制御でのセンシングにおいて重要な役割を果たします。肺の樹状細胞の少なくとも3つの主要なサブセットは、マウスで記載されている：従来のDC（CDC）4、形質DC（PDC）5とIFN -産生キラーDC（IKDC）6,7。 CDCのサブセットは、肺8で最も顕著なDCのサブセットです。
DCサブセットを識別するために知られている一般的なマーカーは、CD11cは、I型も単球、マクロファージ、好中球およびいくつかのB細胞9上に発現される膜貫通インテグリン（β2）です。一部の組織では、マウスDCを識別するマーカーとして樹状細胞を使用すると、ほとんどのCD11c +細胞は主要組織適合遺伝子複合体クラスII（MHC - II）の高レベルを表すCDCのサブセットを表す脾臓、のように、有効です。しかし、肺はものより異質な組織であるサイドDCサブセットは、MHC - IIの低レベルの試合CD11cは高レベルの表現の異なる細胞集団の割合が高いがあります。その特性上、ほとんどがF4/80、脾臓マクロファージのマーカーのその式に基づいて、CD11cはハイ MHC - II LOの肺の細胞集団は、潜在的なDC前駆11として、肺のマクロファージ、最近10として同定されている。
マウスPDCには対照的に、肺の免疫応答におけるCDCの特定の役割の研究は、これらの細胞の分離に役立つ可能性が特異的なマーカーの不足により制限されている。したがって、この作品では、我々は高度に精製されたマウスの肺CDCを分離する手順を説明します。肺DCサブセットの分離は、呼吸器病原体だけでなく、肺の宿主免疫応答を誘発する環境要因に応答してこれらの細胞の機能に関する洞察を得るために非常に便利なツールを表します。
Protocol
1。肺血流と、単一の細胞懸濁液
- 大腿静脈を経由してケタミン/キシラジン麻酔の混合物（1mg /マウスケタミン1.8では、キシラジン0.19）と放血の腹腔内注射したマウスを安楽死させる
- カットと軽く腹膜の外側の皮を引き戻すことによって胸腔を公開。心臓と肺の両方を公開するために、胸郭を切断してダイアフラムを開くに進みます。
- EDTA - HBSS（カルシウム/マグネシウムを含まないHBSSで1mMのEDTA）を充填した5mlの注射器を使って静かに肺を灌流。 25 Gの針を接続し、右心室に針を挿入する。注入時の漏れを防ぐために、鉗子を使用して針の周囲心筋組織を固定します。一定の圧力を維持しながらゆっくりとソリューションを注入する。正確な血流は肺の膨張とピンク/白への色の変化になります。
- この組織からの潜在的な汚染を破棄するように所属リンパ節を削除します。
- 収集肺組織では、氷の上でペトリ皿に移し、カミソリの刃を使用して、小さな断片に切り刻む。
- を5 ml /コラゲナーゼ消化液の肺を含むgentleMACS C管に接地された組織を転送する（コラゲナーゼタイプ1Aは0.5 mg / mlのプラスIV型ウシ膵臓のDNase 20 5％FBS、100 U / mlペニシリンおよび100μg/mlを含むHBSSでμg/ mlの/ mlのストレプトマイシン）。
- 単一の細胞懸濁液を得るためにgentleMACSのdissociatorを使用してください。 m_lung_01：プログラムを選択してください。 30分間37℃でサンプルをインキュベートする。組織片を懸濁するためにチューブを5分ごとに振る。プログラムm_lung_02に進みます。
- 4で335 x gで10分間、15mlコニカルチューブと遠心分離機にサンプルを移す℃にこのステップの後、4で全ての試薬と遠心分離を維持° Cは、細胞の生存率の低下を防止する。
- 上清を捨て、室温で1分間ACK溶解緩衝液2 mlを加え、残りの赤血球を溶解する。 13で細胞を洗浄4で335 x gで10分間、冷たいPBS/0.5％BSAおよび遠心℃のミリリットル
- コールドPBS/0.5％のBSAの5mlに上清、再懸合計セルを廃棄し、100μmのナイロンメッシュを徹底的に渡します。
- トリパンブルー排除色素を使用して、総細胞数を決定します。
2。磁気分離とCD11c +細胞の濃縮
- 4℃で200 × gで10分間、単一の細胞懸濁液を遠心し、上清を捨てる。
- 10 8合計のセルごとに分離バッファー400μlの再懸濁し細胞ペレット（PBS、0.5％BSA、および2mM EDTA）。 4℃で30分間anti-CD16/CD32抗体（0.5μg/ 10 6細胞）を使用して、結合ブロックのFcを介する非特異的抗体℃に
- 4で200 × gで10分間冷分離バッファと遠心を10ml℃で細胞を洗浄分離バッファー400μlで細胞を再懸濁します。
- 10 8あたりのCD11cマイクロビーズを100μlを加え
- 4℃で200 × gで10分間冷分離バッファと遠心の10mlで細胞を洗浄し、上清を捨てる。
- 冷分離緩衝液3mlで細胞ペレットを再懸濁します。
- プログラムのposseldを選択することにより、autoMACS ProのTMのセパレータを使用して磁気分離を実行します。陽性画分（0.5 ml）を収集する。
3。従来の樹状細胞（CDC）の分離
- 抗CD11c PE - Cy7とanti-IA/IE（MHC - II）- FITC抗体で30分間、4℃でインキュベートし、濃縮CD11c陽性細胞懸濁液抗体の最適化された濃度は、細胞の0.5μg/ 10 6です。
- 4で335 x gで10分間、冷たいPBS/0.5％BSAおよび遠心℃で細胞を洗浄再懸PBS/0.5％BSAを0.5mlの中の細胞と40μmのナイロンメッシュを介してそれらを渡す。
- に進んでください純度のモードでFACSのアリアのセルソーターを使用してセルを並べ替える。精製された細胞の損傷を防止するためにコレクションチューブにPBS/0.5％BSAを100μlのを追加。細胞選別のプロセスを通して冷蔵温度であなたの細胞を保つ。
4。単一の細胞懸濁液およびCD11c +細胞の濃縮を取得するための代替プロトコル
- gentleMACSのdissociatorの交換では、ステップ1.5から接地肺組織は、37℃で1時間肺とインキュベートあたりのコラゲナーゼ溶液5 mlを入れた15 mlコニカルチューブに移すことができる渦は、細胞が15分ごとに組織断片を再懸濁するため。 inとout 20 Gの針に接続して、3 mlの注射器を介してサンプルを6-8回を渡すことによって、組織を混乱させる。プロセス中に泡を避ける、特に細胞の生存率が低下します。単一の細胞懸濁液が得られれば、1.8に進みます。
- AutoMACSPro TM separaの交換でTorは、樹状細胞の細胞の濃縮のための磁気分離は、また、2つのMACSカラムを介して手動で細胞懸濁液を渡すことで実行できます。適切な列の選択は、サンプルサイズが異なります。
5。代表的な結果：
肺CDCは、CD11cはハイ / MHC - II ハイの細胞集団として同定されています。図に示す。 1は、CDCは、脾臓（4.8％）などのいくつかの他の組織に比べて1.4％の小さな割合を表しています。しかし、脾臓とは対照的に、肺のCD11c陽性細胞は、CDCとは異なる細胞集団を含む、MHC - IIの異なる量を表現する。単一細胞調製後、全肺の細胞の細胞収率はわずか1％以上がCDCのサブセットを表す、そこから60〜70パーセントの生存率と3.8から3.0程度× 10 7細胞/肺であった。この割合は、総肺CDCは約10 tをインクリメントされた樹状細胞の磁気分離後に増加したオリジナルの準備（図2A）からのIME（> 16％）。しかし、MHC - II（CD11cはHI / MHC - II LO、マクロファージ）の少量を表現するCD11cは細胞が肺CDCのサブセットと混合され、高汚染の細胞集団（> 70％）を表す。図に示す。 2B、それらの細胞は、CDCの純度は> 96％に達した細胞選別工程後に除去した。全体の手順の後にCDCの通常の収率は5 × 10 4細胞/肺であった。顕微鏡写真は、代表的な樹状突起（上のパネル）と丸い細胞としてCDCの形態的特徴を示す。一方、CD11cはハイ / MHC - II LOは、マクロファージ（Mφ、下のパネル）12の典型的な細胞の突起を示す形態学的に異なるサブセットを表す。
マウスの肺及び脾臓で図1の差動DC周波数 。肺C57BL / 6マウスからNDの脾臓組織をコラゲナーゼで収集し、処理した。コラゲナーゼ消化後、細胞を抗マウスCD11cは- PE - Cy7および抗マウスIA / IE - FITCで染色した。代表的なフローサイトメトリープロットでは、肺と脾臓におけるCDCの割合（CD11cはHI / MHC - II ハイ ） を示す。
（2）マウスの肺からCDCの分離。マウスの肺の単一細胞の懸濁液を抗CD11cマイクロビーズで標識し、自動細胞分離装置を通過した。）代表的なプロットは、CDCの割合を示す図 （樹状細胞ハイ / MHC - II HI）とマクロファージ（Mφ、CD11cはハイ / MHC - II LO）CD11cは濃縮後の集団。濃縮分画のさらなる染色は、抗マウスCD11cは- PE - Cy7および抗マウスIA / IE - FITCを使用して続く。二重陽性細胞をソートし、フローサイトメトリーによって分析した。へのその形態を特定する、セルが変更されたライト-ギムザ染色でサイトスピンし、染色した。B）代表プロットは、細胞選別後のCDCおよびMφの割合を示す。顕微鏡写真では肺CDCと肺のMφの代表画像を示す。バー=20μmのスケール。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
肺マウスDCの分離は、呼吸器の刺激の広い範囲の研究のための重要なテクニックです。これらの細胞を得る工程は、細胞の喪失だけでなく、細胞の生存と純度を防ぐための重要な手順が含まれています。コレクションの前に肺を灌流しても、末梢細胞を排除するだけでなく、汚染物質の赤血球を削減することができます。肺の多数が処理されるときに自動化された解離の使用はadvanteogusことができる、そうでなければ、手動で行う際にコラゲナーゼ消化後の組織の分散が優しく実行されるべきであることを念頭に置きつつ、別のプロトコルを選ぶことができます。肺組織の潜伏期間は、コラゲナーゼ溶液中に指示されたインキュベーション時間を超えて拡張されるべきではない。このステップの後、残りのプロセスは、細胞死を減らすために氷冷緩衝液と冷凍遠心機を使用して行う必要があります。混入赤血球の溶血は、よりトン繰り返されるべきではないステップです全体のプロセス中にハン倍。ナイロンメッシュを通して細胞懸濁液を渡し、指示された手順で、セルソーターの目詰まりだけでなく、細胞の純度が損なわれる細胞凝集体を減少させるのを防ぐために重要です。単離された細胞のin vitroでのさらなる文化が関与している場合、すべてのステップは任意の汚染を防止するために生物学的安全キャビネットの下で実行する必要があります。それは、細胞選別の段階ではサンプルの無菌性を損なうことが期待されていません。
樹状細胞は自然免疫と獲得免疫の相互作用の研究に不可欠です。説明する手順は、適切な抗体を磁気分離と8をソート、セルの間に使用されている場合、他のDCサブセットの分離に適用される可能性があります。さらに、肺マクロファージ（CD11cはHI / MHC - II LO）も、同じ細胞調製物から精製することができる。動物Bごとに単離することができる肺DCの限られた数にもかかわらずyはこの手順を使用して、このテクニックは、肺のDCを研究する最も正確なシステムを提供します。しかし、従来のDCアイソレーションに、マウスはfms様チロシンキナーゼ3（FLT3 -）リガンド、DC番号13を増加させる剤で処理することができます。脾臓のDCを分離した方が容易かつ迅速になるかもしれないが、肺および脾臓におけるDCの成熟状態の違いを考慮する必要があります。脾臓DC、肺DC急行などのウイルス感染8,14後に成熟したものに切り替えられる未熟な表現型とは対照的に。
要約すると、肺DCの特定のサブセットを分離するには、記述されたプロトコルを介して、宿主の免疫応答における特定の役割および/または肺DCの寄与を決定するために、任意の実験的マウスモデルに適用することができます助けることができるユニークなツールを提供していますそれは、気道の研究を含む。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
著者らは、顕微鏡との彼の援助のための細胞選別とピーターモットラムと彼女の助けのためにLSUのフローサイトメトリーコアファシリティーでマリリンディートリッヒに感謝したいと思います。この作品は、フライトアテンダント医学研究所、LSU -競争的研究プログラム賞、およびNIH / NIAID助成金P20 RR020159とR03AI081171によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
