Summary
Et høyt renset utarbeidelse av mus lunge dendrittiske celler er beskrevet. Spesifikk vekt er gitt til isolering av konvensjonelle dendrittiske celle delmengden.
Abstract
Lung dendrittiske celler (DC) spiller en fundamental rolle i sensing invaderende patogener 1,2 samt kontroll av tolerogenic responser 3 i luftveiene. Minst tre undergrupper av lunge dendrittiske celler har blitt beskrevet i mus: konvensjonelle DC (CDC) 4, plasmacytoid DC (PDC) 5 og IFN-produserende drapsmann DC (IKDC) 6,7. CDC undergruppe er det mest fremtredende DC undergruppe i lungene 8.
Den vanlige markør kjent for å identifisere DC undergrupper er CD11c, en type jeg transmembrane integrin (β2) som også er uttrykt på monocytter, makrofager, nøytrofile granulocytter og enkelte B-celler 9. I noen vev, ved hjelp CD11c som en markør for å identifisere mus DC er gyldig, som i milten, der de fleste CD11c + celler representere CDC undergruppe som uttrykker høye nivåer av de store histocompatibility komplekse klasse II (MHC-II). Imidlertid er lunge et mer heterogent vev der væreside DC undergrupper, det er en høy prosentandel av en tydelig celle befolkning som uttrykker høye nivåer av CD11c bout lave nivåer av MHC-II. Basert på karakterisering sin og det meste på sin uttrykk av F4/80, en milten macrophage markør har CD11c hi MHC-II lo lunge celle befolkningen blitt identifisert som lunge makrofager 10 og mer nylig, som en potensiell DC forløper 11.
I motsetning til mus PDC, har studiet av den spesifikke rolle CDC i lungene immunresponsen vært begrenset på grunn av mangel på en bestemt markør som kan hjelpe i isolering av disse cellene. Derfor, i dette arbeidet, beskriver vi en prosedyre for å isolere svært renset mus lunge CDC. Isolering av pulmonale DC undergrupper representerer et meget nyttig verktøy for å få innsikt inn i funksjonen av disse cellene som svar på respiratoriske patogener samt miljøfaktorer som kan utløse vertens immunrespons i lungene.
Protocol
1. Lung perfusjon og single cellesuspensjon
- Avlive musen med en intraperitoneal injeksjon av ketamin / xylazin anestesiblanding (i mg / mus 1,8 ketamin, 0,19 xylazin) og exsanguination via femoral vein
- Avdekk brysthula ved å klippe og forsiktig trekke tilbake den ytre huden av peritoneum. Fortsett å åpne membranen ved å kutte brystkassen å eksponere både hjertet og lungene.
- Perfuse forsiktig lungene med en 5 ml sprøyte fylt med EDTA-HBSS (1mm EDTA i kalsium / magnesium-free HBSS). Koble til en 25 G nål og stikk nål inn i høyre ventrikkel. For å hindre lekkasje under injeksjon, sikre myocardiac vevet rundt nålen ved hjelp av tang. Forsiktig injisere løsningen og samtidig opprettholde et konstant press. Nøyaktig perfusjon vil resultere i lunge inflasjon og en fargeendring til rosa / hvit.
- Fjern drenerende lymfeknuter å forkaste enhver potensiell forurensning fra dette vevet.
- Samlelungevev, overfør til en petriskål på is, og hogge det til små biter med et barberblad.
- Overfør jordet vevet inn i et gentleMACS C tube inneholder 5 ml / lunge av collagenase fordøyelsen løsning (collagenase typen 1A 0,5 mg / ml pluss type IV storfe bukspyttkjertelen DNase 20 mikrogram / ml i HBSS inneholder 5% FBS, 100 U / ml penicillin og 100 mikrogram / ml streptomycin).
- Bruk gentleMACS dissociator å få en enkelt celle suspensjon. Velg program: m_lung_01. Inkuber prøve ved 37 ° C i 30 minutter. Rist tube hvert 5. minutt til resuspendere vev fragmenter. Fortsett med programmet m_lung_02.
- Overfør prøven til en 15 ml konisk rør og sentrifuger i 10 minutter ved 335 x g ved 4 ° C. Etter dette trinnet, holde alle reagenser og centrifugations ved 4 ° C for å hindre reduksjon i celle levedyktighet.
- Kast supernatanten og lyse gjenværende røde blodceller ved å tilsette 2 ml av ACK Lysing buffer i 1 minutt ved romtemperatur. Vask celler med 13ml kaldt PBS/0.5% BSA og sentrifuger i 10 minutter ved 335 x g ved 4 ° C.
- Kast supernatant, resuspender total cellene i 5 ml kaldt PBS/0.5% BSA og bestå grundig en 100 mikrometer nylon mesh.
- Bestem det totale celle nummer ved å bruke trypan blå utestenging fargestoff.
2. Magnetic isolasjon og CD11c + celler berikelse
- Sentrifuger enkelt celle suspensjon i 10 minutter ved 200 x g ved 4 ° C og kast supernatanten.
- Resuspender celle pellet i 400 mL av separasjon buffer (PBS, 0,5% BSA, og 2 mM EDTA) per 10 8 total celler. Block Fc-mediert uspesifikk antistoff binding ved bruk anti-CD16/CD32 antistoff (0.5μg / 10 6 celler) i 30 minutter ved 4 ° C.
- Vask cellene med 10 ml kaldt separasjon buffer og sentrifuger i 10 minutter ved 200 x g ved 4 ° C. Resuspender celler i 400 mL av separasjon buffer.
- Tilsett 100 mL av CD11c MicroBeads per 10 8
- Vask cellene med 10 ml kaldt separasjon buffer og sentrifuger i 10 minutter ved 200 x g ved 4 ° C og kast supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 3 ml kaldt separasjon buffer.
- Utfør magnetisk separasjon bruker autoMACS Pro TM Separator ved å velge programmet posseld. Samle positive brøkdel (0,5 ml).
3. Konvensjonelle dendrittiske celle (CDC) isolasjon
- Inkuber beriket CD11c positive cellesuspensjon med anti-CD11c PE-Cy7 og anti-IA/IE (MHC-II)-FITC antistoffer i 30 minutter ved 4 ° C. Optimalisert konsentrasjon av antistoffer er 0,5 mikrogram / 10 6 celler.
- Vask celler med kaldt PBS/0.5% BSA og sentrifuger i 10 minutter ved 335 x g ved 4 ° C. Resuspender cellene i 0,5 ml PBS/0.5% BSA og passerer dem gjennom en 40 mikrometer nylon mesh.
- Fortsett tilsortere celler ved hjelp av FACS Aria celle sorter i renhet modus. Tilsett 100 mL av PBS/0.5% BSA til samlingen rørene for å hindre skade av renset celler. Hold cellene på en nedkjølt temperatur i hele cellen sortering prosessen.
Fire. Alternative protokoll for å få en enkelt celle suspensjon og CD11c + celler berikelse
- I utskifting av gentleMACS dissociator kan jordet lungevev fra trinn 1,5 bli overført til en 15 ml konisk rør som inneholder 5 ml collagenase løsning per lunge og inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Vortex celler hvert 15. minutt for å resuspendere vev fragmenter. Forstyrre vevet ved å bestå prøven 6-8 ganger inn og ut gjennom en 3 ml sprøyte koblet til en 20 G nål. Unngå å lage bobler under prosessen, ellers celleviabilitet vil bli kompromittert. Når enkelt celle suspensjon er oppnådd, fortsett til trinn 1.8.
- I utskifting av AutoMACSPro TM separasjontor, magnetisk isolering for berikelse av CD11c cellene, kan også utføres ved å sende cellesuspensjonen manuelt gjennom to MACS kolonner. Valget av de aktuelle kolonnene vil variere avhengig av størrelsen på utvalget.
5. Representant Resultater:
Lung CDC er identifisert som CD11c hi / MHC-II hi celle befolkningen. Som vist i fig. 1, CDC representerer en mindre andel på 1,4% sammenlignet med enkelte andre vev som milt (4,8%). Men i motsetning til milten, lungene CD11c positive celler uttrykker ulike mengder av MHC-II, inkludert en celle befolkning annerledes enn CDC. Etter encellede forberedelse, var cellen utbytte av total lungeceller ca 3,0 til 3,8 x 10 7 celler / lunge med en levedyktighet på 60-70% som en litt over 1% representert CDC delmengden. Denne andelen var økt etter CD11c magnetisk isolering der den totale lunge CDC var økes ca 10 tIME (> 16%) fra den opprinnelige forberedelse (Fig. 2A). Men representert CD11c celler uttrykker lave mengder av MHC-II (CD11c hi / MHC-II lo, makrofager) en høy forurensende celle befolkning (> 70%) som var blandet med lungene CDC delmengden. Som vist i fig. 2B, var disse cellene eliminert etter celle sortering trinnet når CDC renhet nådd> 96%. Den vanlige utbytte av CDC etter at hele prosedyren var 5 x 10 4 celler / lunge. Microphotographs viser morfologiske kjennetegn ved CDC som avrundet celler med den typiske dendritter (øvre panel). På den annen side, representert CD11c hi / MHC-II lo en morfologisk annen undergruppe som viser cellular protuberances som er typisk for makrofager (MΦ, nedre panel) 12.
Figur 1. Differential DC frekvens i mus lunge og milt. Lung ennd milt vev fra C57BL / 6 mus ble samlet inn og behandlet med collagenase. Etter collagenase fordøyelsen, ble cellene farget med anti-mus CD11c-PE-Cy7 og anti-mus IA / IE-FITC. Representant flowcytometri tomter viser prosenter av CDC (CD11c hi / MHC-II hi) i lunge og milt.
Figur 2. Isolering av CDC fra mus lunge. Mouse lunge singel cellesuspensjon var merket med anti-CD11c microbeads og gikk gjennom en automatisk celle separator. A) En representant Plottet viser prosenter av CDC (CD11c hi / MHC-II hi) og makrofager (MΦ, CD11c hi / MHC-II lo) populasjoner etter CD11c berikelse. Videre farging av beriket brøkdel fulgt med anti-mus CD11c-PE-Cy7 og anti-mus IA / IE-FITC. Double positive celler ble sortert og analysert av flowcytometri. Tilidentifisere deres morfologi, ble cellene cytospun og farget med en modifisert Wright-Giemsa flekker. B) Representative tomter viser prosentandeler av CDC og MΦ etter celle sortering. Microphotographs vise et representativt bilde av lunge CDC og lunge MΦ. Scale bar = 20 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering av lunge mus DC er en viktig teknikk for studiet av et bredt spekter av luftveiene stimuli. Prosessen med å innhente disse cellene inkluderer kritiske trinnene som forhindrer tap av celler samt celleviabilitet og renhet. Perfusing lungene før samlingen vil bidra til å eliminere eventuelle perifere celler samt redusere forurensning erytrocytter. Bruk av automatiserte dissosiasjon kan advanteogus når et stort antall lungene blir håndtert, ellers kan du melde deg for alternativ protokollen, husk at spredningen av vevet etter collagenase fordøyelsen bør gjøres forsiktig når det gjøres manuelt. Inkubasjonstiden av lungevevet, mens i collagenase løsningen ikke bør utvides utover angitt inkubasjonstiden. Etter dette trinnet, må de gjenværende prosessen gjøres ved hjelp iskald buffere og nedkjølt sentrifuger for å redusere celledød. Den lysis av forurensende erytrocytter er et skritt som ikke bør gjentas mer tHan to ganger under hele prosessen. Bestått cellesuspensjonen gjennom en nylon mesh på angitt skritt, er avgjørende for å hindre tilstopping av cellen sorter samt å redusere celle aggregater som vil kompromittere cellen renhet. Hvis ytterligere kulturen in vitro av isolerte celler er involvert, må alle trinn utføres under en biosikkerhet kabinett for å forhindre forurensning. Det er ikke forventet at cellen sortering trinnet vil kompromittere sterilitet av utvalget.
Dendrittiske celler er avgjørende for studier av medfødte og adaptive immunsystemet interaksjoner. Prosedyren er beskrevet har potensiale til å bli brukt til isolering av andre DC undergrupper eventuelt antistoffer er brukt under magnetisk isolering og cellen sortering 8. I tillegg kan lunge makrofager (CD11c hi / MHC-II lo) også bli renset fra samme celle forberedelse. Til tross for begrenset antall lunge DC som kan isoleres per dyr by ved hjelp av denne prosedyren, gir denne teknikken den mest nøyaktige system for å studere lunge DC. Men før DC isolasjon, kunne mus behandles med FMS-Like tyrosine kinase 3 (Flt3-) Ligand, en agent som øker DC tall 13. Selv milt DC kan være lettere og raskere å isolere, må forskjellene i modning tilstand DC i lunge og milt tas i betraktning. I motsetning til milten DC, lunge DC uttrykke en umoden fenotypen som er byttet til en moden en etter for eksempel en virusinfeksjon 8,14.
I sammendraget, isolering av spesifikke undergrupper av lunge DC gjennom beskrives protokollen, gir et unikt verktøy som kan hjelpe til å bestemme spesifikke rolle og / eller bidrag av pulmonal DC i vertens immunrespons og kan brukes på alle eksperimentelle mus modell som involverer studiet av luftveiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke for Marilyn Dietrich på LSU flowcytometrisystemer kjerner Facility for hennes hjelp med celle sortering og Peter Mottram for hans hjelp med microphotographs. Dette arbeidet ble finansiert av Flight Attendant Medical Research Institute, LSU-Competitive Research Program Award, og NIH / NIAID Grants P20 RR020159 og R03AI081171.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
