Summary
A preparação altamente purificada de células dendríticas pulmonares do rato é descrito. Ênfase específica é dada para o isolamento de um subconjunto de células dendríticas convencionais.
Abstract
Células pulmonares dendríticas (DC) desempenham um papel fundamental na detecção invadindo 1,2 patógenos, bem como no controle de respostas tolerogênico 3 no trato respiratório. Pelo menos três subconjuntos principais de células dendríticas pulmonares têm sido descritas em ratos: DC convencional (CDC) 4, plasmocitóide DC (PDC) 5 e IFN-produzindo assassino DC (IKDC) 6,7. O subconjunto do CDC é o subconjunto DC mais proeminentes no pulmão 8.
O marcador comum conhecida para identificar subgrupos DC CD11c é, um tipo que eu transmembrana integrina (β2), que também é expresso em monócitos, macrófagos, neutrófilos e algumas células B 9. Em alguns tecidos, usando CD11c como um marcador para identificar rato DC é válido, como no baço, onde a maioria das células CD11c + representa o subconjunto do CDC que expressa altos níveis do complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHC-II). No entanto, o pulmão é um tecido mais heterogêneo, onde sesubconjuntos lado DC, há uma elevada percentagem de uma população de células distintas que expressa altos níveis de CD11c combate os baixos níveis de MHC-II. Com base na sua caracterização e principalmente em sua expressão de F4/80, um marcador de macrófagos do baço, o CD11c oi MHC-II eis população de células do pulmão foi identificado como macrófagos pulmonares 10 e, mais recentemente, como um precursor potencial DC 11.
Em contraste com o rato pDC, o estudo do papel específico do CDC na resposta imunológica pulmonar tem sido limitado devido à falta de um marcador específico que poderia ajudar no isolamento dessas células. Portanto, neste trabalho, descrevemos um procedimento para isolar altamente purificado do mouse pulmão CDC. O isolamento de subconjuntos pulmonar DC representa uma ferramenta muito útil para obter insights sobre a função destas células em resposta a patógenos respiratórios, bem como fatores ambientais que podem desencadear a resposta imune do hospedeiro no pulmão.
Protocol
1. Perfusão pulmonar e suspensão única célula
- Euthanize o mouse com uma injeção intraperitoneal de cetamina / xilazina mistura anestésica (em mg / mouse ketamina 1.8, xilazina 0,19) e sangria pela veia femoral
- Expor a cavidade torácica, cortando e puxando para trás a pele externa do peritônio. Proceder à abertura do diafragma, cortando a caixa torácica para expor tanto o coração e os pulmões.
- Perfundir gentilmente os pulmões com uma seringa de 5 ml preenchido com EDTA-HBSS (1mM EDTA de cálcio / magnésio livre de HBSS). Conectar uma agulha G 25 e inserir a agulha para o ventrículo direito. Para evitar fugas durante a injeção, segura o tecido ao redor da agulha myocardiac usando uma pinça. Suavemente injectar a solução, mantendo uma pressão constante. Perfusão será a precisão do resultado da inflação do pulmão e uma mudança de cor de rosa / branco.
- Remover linfonodos drenantes para descartar qualquer possível contaminação a partir deste tecido.
- Coletartecido pulmonar, a transferência para uma placa de Petri sobre gelo, e pique em pedaços pequenos usando uma lâmina de barbear.
- Transferência de tecidos fundada em um tubo C gentleMACS contendo 5 ml / pulmão de solução de digestão da colagenase (colagenase tipo 1A 0,5 mg / ml, mais tipo IV de pâncreas bovino DNase 20 mg / ml em HBSS contendo 5% de FBS, 100 U / ml de penicilina e 100 mg / estreptomicina ml).
- Use o dissociator gentleMACS para obter uma suspensão única célula. Escolha o programa: m_lung_01. Incubar amostra a 37 ° C por 30 minutos. Agite tubo a cada 5 minutos para voltar a suspender fragmentos de tecido. Prosseguir com m_lung_02 programa.
- Transferência de amostra para um tubo cônico de 15 ml e centrifugar por 10 minutos a 335 x g a 4 ° C. Após esta etapa, manter todos os reagentes e centrifugação a 4 ° C para evitar a redução da viabilidade celular.
- Elimine o sobrenadante e lise restantes células vermelhas do sangue, adicionando 2 ml de tampão de lise ACK por 1 minuto à temperatura ambiente. Lavar as células com 13ml de BSA PBS/0.5% fria e centrifugação por 10 minutos a 335 x g a 4 ° C.
- Elimine o sobrenadante, ressuspender total de células em 5 ml de BSA PBS/0.5% fria e passe completo de 100 M malha de nylon.
- Determinar o número total de células usando corante de exclusão de tripan blue.
2. Isolamento magnético e CD11c + enriquecimento de células
- Centrífuga suspensão única célula por 10 minutos a 200 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender pellet celular em 400 mL de tampão de separação (PBS, BSA 0,5%, e 2 mM de EDTA) por 10 8 células total. Bloco de anticorpos Fc mediada inespecíficos ligação usando anti-CD16/CD32 anticorpos (0.5μg / 10 6 células) por 30 minutos a 4 ° C.
- Lavar as células com 10 ml de tampão de separação fria e centrifugação por 10 minutos a 200 x g a 4 ° C. Ressuspender as células em 400 mL de tampão de separação.
- Adicione 100 ml de microesferas de CD11c por 10 8
- Lavar as células com 10 ml de tampão de separação fria e centrifugação por 10 minutos a 200 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet celular em 3 ml de tampão de separação frio.
- Realizar separação magnética usando o separador autoMACS Pro TM, selecionando o posseld programa. Recolher a fração positiva (0,5 ml).
3. Células dendríticas convencional (CDC) de isolamento
- Incubar enriquecido CD11c suspensão de células positivas com anti-CD11c-PE Cy7 e anti-IA/IE (MHC-II)-FITC anticorpos durante 30 minutos a 4 ° C. Concentração otimizada de anticorpos é de 0,5 mg / 10 6 de células.
- Lavar as células com BSA PBS/0.5% fria e centrifugação por 10 minutos a 335 x g a 4 ° C. Ressuspender as células em 0,5 ml de BSA PBS/0.5% e passá-las através de uma malha de nylon 40 mM.
- Proceder àclassificar as células usando o classificador de células FACS Aria no modo de pureza. Adicione 100 ml de BSA PBS/0.5% para os tubos de coleta, a fim de evitar danos de células purificadas. Mantenha suas células, a uma temperatura de refrigeração em todo o processo de separação de células.
4. Protocolo alternativo para a obtenção de uma suspensão única célula e CD11c + enriquecimento de células
- Em substituição do dissociator gentleMACS, tecido pulmonar fundamentada a partir do passo 1.5 pode ser transferida para um tubo cônico de 15 ml contendo 5 ml de solução de colagenase por pulmão e incubar por 1 hora a 37 ° C. Vortex células a cada 15 minutos, a fim de ressuspender fragmentos de tecido. Perturbar o tecido, passando a amostra 6-8 vezes dentro e para fora através de uma seringa de 3 ml conectada a uma agulha G 20. Evite fazer bolhas durante o processo, caso contrário, a viabilidade celular será comprometida. Uma vez que a suspensão única célula é obtida, continue para o passo 1.8.
- Em substituição do TM AutoMACSPro separaçãotor, o isolamento magnético para o enriquecimento das células CD11c, também pode ser realizada pela passagem da suspensão de células manualmente através de duas colunas MACS. A seleção das colunas apropriado irá variar dependendo do tamanho da amostra.
5. Resultados representativos:
Pulmão CDC são identificados como CD11c oi / MHC-II população de células oi. Como mostrado na figura. 1, do CDC representam uma porcentagem menor de 1,4% quando comparado a alguns outros tecidos, como baço (4,8%). No entanto, em contraste com o baço, as células do pulmão CD11c positiva expressar diferentes quantidades de MHC-II, incluindo uma população de células diferentes do que a de CDC. Após a preparação de uma única célula, o rendimento das células pulmonar total foi de cerca de 3,0-3,8 x 10 7 células / pulmão com uma viabilidade de 60-70% dos quais pouco mais de 1%, representado subconjunto CDC. Esta percentagem foi aumentada após o isolamento CD11c magnética onde o total de pulmão CDC foi incrementado cerca de 10 times (> 16%) desde a preparação original (Fig. 2A). No entanto, as células CD11c expressar baixas quantidades de MHC-II (CD11c oi / MHC-II eis que macrófagos) representou uma população de células de alta contaminação (> 70%), que foi misturado com o subconjunto CDC pulmão. Como mostrado na figura. 2B, essas células foram eliminados após a etapa de separação de células, quando a pureza do CDC chegou a> 96%. O rendimento habitual do CDC, após todo o procedimento foi de 5 x 10 4 células / pulmão. Microfotografias mostram características morfológicas do CDC como células arredondadas com as dendrites típicas (painel superior). Por outro lado, CD11c oi / MHC-II representaram um subconjunto lo morfologicamente diferentes que mostra protuberâncias celulares que são típicas de macrófagos (MΦ painel, menor) 12.
Figura 1. Diferencial de freqüência DC no pulmão do rato e do baço. Um pulmãond tecido do baço de camundongos C57BL / 6 foram coletados e tratados com colagenase. Após digestão com colagenase, as células foram marcadas com anti-mouse CD11c-PE-Cy7 e anti-mouse IA / IE-FITC. Parcelas representativas de citometria de fluxo mostram percentuais de CDC (CD11c oi / MHC-II oi) no pulmão e baço.
Figura 2. Isolamento de CDC do pulmão do rato. Rato pulmão suspensão única célula foi marcado com anti-CD11c micro e passou por um separador automático de células. A) Um representante trama mostra os percentuais de CDC (CD11c oi / MHC-II oi) e macrófagos (MΦ, CD11c oi / MHC-II lo) após o enriquecimento CD11c populações. Coloração mais da fração enriquecida seguido usando anti-mouse CD11c-PE-Cy7 e anti-mouse IA / IE-FITC. Duplo células positivas foram classificadas e analisadas por citometria de fluxo. Paraidentificar sua morfologia, as células foram cytospun e marcadas com uma coloração modificada Wright-Giemsa. B) parcelas Representante mostram percentuais de CDC e MΦ após separação de células. Microfotografias mostram uma imagem representativa do pulmão CDC e MΦ pulmão. Barra de escala = 20 mM.
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Discussion
Isolamento de pulmonar do rato DC é uma técnica importante para o estudo de uma ampla gama de estímulos respiratórios. O processo de obtenção dessas células inclui passos críticos que impedem a perda de células, bem como a viabilidade celular e pureza. Perfusão do pulmão antes da coleta ajudará a eliminar as células periféricas, bem como reduzir os eritrócitos contaminantes. O uso da dissociação automatizado pode ser advanteogus quando um grande número de pulmões são tratados, caso contrário, você pode optar pelo protocolo alternativo, tendo em mente que a dispersão do tecido após a digestão da colagenase deve ser feito com cuidado, quando feito manualmente. O período de incubação do tecido pulmonar, enquanto na solução de colagenase não deve ser prolongado para além do tempo de incubação indicado. Após esta etapa, o processo ainda deve ser feito usando gelada buffers e centrífugas de refrigeração para reduzir a morte celular. Lise de eritrócitos contaminantes é um passo que não deve ser repetido mais than duas vezes durante todo o processo. Passando a suspensão de células através de uma malha de nylon, em os passos indicados, é fundamental para evitar o entupimento do classificador de células, bem como para reduzir agregados celulares que irá comprometer a pureza da célula. Se a cultura ainda mais in vitro das células isoladas é envolvidas, todas as etapas devem ser executadas ao abrigo de um gabinete de biossegurança para prevenir qualquer contaminação. Não se espera que a etapa de classificação de células irá comprometer a esterilidade da amostra.
As células dendríticas são cruciais para os estudos das interações imune inata e adaptativa. O procedimento descrito tem o potencial de ser aplicado para o isolamento de outros subgrupos DC se os anticorpos apropriados são usados durante o isolamento magnético ea célula de classificação 8. Além disso, os macrófagos pulmonares (CD11c oi / MHC-II lo) também pode ser purificado a partir da preparação mesma célula. Apesar do número limitado de DC pulmonares que podem ser isolados por animal by usando este procedimento, esta técnica fornece o sistema mais acurado para estudar DC pulmão. No entanto, antes de isolamento DC, os ratos poderiam ser tratados com Fms-Like tirosina quinase 3 (FLT3) Ligand, um agente que aumenta números DC 13. Embora DC baço pode ser mais fácil e mais rápido para isolar, as diferenças no estado de maturação da DC no pulmão e baço devem ser levados em consideração. Em contraste com a DC baço, pulmão DC expressar um fenótipo imaturo que é comutada para um mercado maduro, após uma infecção viral, por exemplo 8,14.
Em resumo, o isolamento dos subconjuntos específicos de pulmão DC através do protocolo descrito, fornece uma ferramenta única que pode ajudar a determinar o papel específico e / ou contribuição de DC pulmonar nas respostas imune do hospedeiro e podem ser aplicadas a qualquer modelo de camundongo experimental que envolve o estudo do trato respiratório.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Marilyn Dietrich no Centro de Núcleo LSU Citometria de Fluxo por sua ajuda com a separação de células e Mottram Peter por sua ajuda com as microfotografias. Este trabalho foi financiado pela Flight Attendant Medical Research Institute, da LSU-Competitiva Prêmio Programa de Pesquisa, e os subsídios NIH / NIAID P20 RR020159 e R03AI081171.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Biosciences | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD Biosciences | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma-Aldrich | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Biosciences | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Biosciences | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD Biosciences |
References
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