Summary
쥐의 심장을 통해 두뇌의 최상의 보존을 구하려면 여기 혈관 시스템을 통해 perfused 4 % paraformaldehyde를 사용하여 낮은 비용, 빠른, 제어 및 균일한 고정 절차를 설명합니다.
Abstract
고정의 목표는 빠르고 균일하게 실제와 같은 상태로 조직을 보존하는 것입니다. 정착액은 같은 속도 5,7에서 조직의 모든 영역에 도달하지 못하기 때문에 조직의 작은 조각, 손상 뇌 침지 고정에 대한 문제 제기와 같은 큰 표본에 대해 잘 정착액 작품에서 직접 조직을 놓는 동안. 조직은 12 보존할 수 전에 종종 hypoxia에 대한 응답의 변화가 시작되었습니다. 직접 순환 시스템을 통해 정착액을 perfusing의 장점은 화학 물질을 빠르게 자연 혈관 네트워크를 사용 유기체의 모든 모서리에 도달할 수있다는 것입니다. 가장 효과적으로 순환 시스템을 활용하기 위해서는주의가 생리적 압력에게 3 일치하도록 이동해야합니다. 그것은 생리적 압력 사용한 종에 의존 점에 유의하는 것이 중요합니다. 관류 고정을위한 기술은 고정되는 조직에 따라 다릅니다 방법과 조직은 다음과 같은 고정가 처리됩니다. 이 동영상에서쥐의 심장을 통해 immunohistochemistry에 대한 뇌의 최상의 보존을 구하려면, 우리는 혈관 시스템을 통해 perfused 4 % paraformaldehyde를 사용하여 낮은 비용, 빠른, 제어 및 균일한 고정 절차를 설명합니다. 이 기법의 가장 큰 장점 (대 무게로 자란 시스템) 순환 시스템이 가장 효과적으로 활용되고있다는 것입니다.
Protocol
1. 정착액 준비
(테이블 정착액 및 버퍼를 참조하십시오.)
2. 재관류 버퍼를 준비합니다
(테이블 정착액 및 버퍼를 참조하십시오.)
3. 장치 및 마취 준비
- 37에 물 목욕, 따뜻한 재관류 버퍼를 사용 ° C. 버퍼로 가득 비커에서 개최 출구 밸브. 버퍼와 50 ML의 주사기를 입력하고 고정력있는 튜브에 첨부합니다. 추방과 버퍼를 철수하여 반복적으로 튜브를 플러시.
- 튜빙의 모든 공기 방울을 제거 때까지 버퍼와 선을 지웁니다. 그것은 라인의에 공기 방울을하지 않는 관류의 성공을 위해 매우 중요합니다.
- 주사기를 제거하고 4 % paraformaldehyde의 정착액 (실내 온도) 컨테이너를 연결합니다. 용기에 튜브를 배치한 상태에서 튜브 끝에 공기 방울을 피하기 위해 튜브를 당겨 그래야 최종 t에서 버퍼 protrudes 한 방울용기 내의 액체 표면에 문의 O.
- 아울렛 포트 (바늘 끝)를 닫습니다. 정착액 밸브 (흰색)와 동일한 위치에 버퍼 밸브 (파란색)을 돌립니다. 이것은 버퍼 라인에서만의 흐름을 수 있습니다.
- 아울렛 포트를 열고 버퍼 라인 작성을위한 대답을 통해 A1 단계를 반복합니다. 모든 공기 방울이 가까운 아울렛 포트를 제거 후, 주사기를 제거하고 버퍼 컨테이너를 연결한 튜브에 공기 방울을 소개하지 않도록 관리 하는것.
- 고무 혈압계의 blub를 주입하여 압력을 보유 능력을위한 테스트 시스템입니다. 시스템의 공기 압축으로 인해 일부 저항은 일반적으로있다.
- 접근의 용이 위해서는 수술 도구를 설치합니다. 공기 거품의 가능성을 제거하기 위해 버퍼로 관류 바늘을 채웁니다.
- 이전 수술에, xylazine / 마취제 혼합물은 (최대 80 밀리그램 / kg 체중의 마취제 및 10 밀리그램 / kg 체중의 xylazine) intraperitoneal 주사 (27 게이지 바늘과 1 CC의 주사기)를 통해 관리합니다. 마취의 추가 관리는 마취의 수술 비행기를 유지하기 위해 각 작업 과정 중에 필요에 따라 수행됩니다.
4. 재관류 수술
- 동물 마취의 수술 비행기에 도달되면 얼음 조각으로 가득 얕은 쟁반에 배치하십시오. (마취의 깊이를 결정하는 핀치 - 응답 방식 발가락을 사용합니다. 동물 계속하기 전에 응답해야합니다.)
- 그냥 흉곽 아래 외피와 복벽을 통해 5-6cm 측면 절개를합니다. 피임기구로부터 간을 조심스럽게 분리.
- 곡선, 무딘 가위를 사용하여 다이어프램의 작은 절개를합니다. 손가락의 위치와 압력은 다이어프램자를 수있는 능력을 도울 수 있습니다.
- 흉막 캐비티를 노출하는 흉곽의 전체 길이를 따라 격막 절개를 계속합니다.
- 신중하게 폐가 생기죠, 갈비뼈 한쪽을 따라 곡선, 무딘 가위를 삽입하고, 세제곱하다최대 쇄골까지 갈빗대를 통해 t. contralateral 측면에서 유사한 몫을합니다.
- 멀리 흉골을 리프팅하는 것은 마음에 그것을 연결하는 모든 조직을 조심스럽게 잘라. hemostat과 흉골의 끝부분을 고정하고 머리 hemostat를 놓습니다. 정상적으로 완료되면, thymus는 주요 혈관의 명확한 전망을 제공 흉골과 함께 마음에서 떨어져 올렸으니까요.
- 홍채 가위를 사용하여 좌심실 후부 끝에 작은 절개를합니다.
- 오름차순 대동맥에 상처 뇌실을 통해 15 게이지 무딘 또는 올리브-스쳐 재관류 바늘을 전달합니다. 팁이 대동맥의 벽을 통해 볼 수 있어야하고, 상완과 경동맥 동맥이 갈리는 대동맥 아치에 도달해서는 안됩니다.
- 마음을 클램프하는 hemostat를 사용하여,이 바늘을 확보하고 유출을 방지합니다. 원하는 경우 수정한 hemostat가 (이 hemostats은 절개가 시작하기 전까지 자리에 남아 있지만, 지혜로움에 대해 미래의 그림에서 생략) 바늘 끝 주위 대동맥 클램프하는 데 사용할 수 있습니다.
- 마지막으로, 하강 대동맥을 손상시키지 않고 가능한 한 대형 할인 매장을 만들 홍채 가위를 사용하여 동물의 권리 아트리움에 절개를합니다. 이 시점에서 동물 perfused받을 준비가되어 있습니다.
5. 관류
- 열고있는 공기 방울을 소개하지 돌보는 바늘 기지로 아울렛 포트를 연결합니다.
- 신속 & 고르게 80mm의 HG의 압력에 혈압계 벌브 속도를 높여. 버퍼 주입 기간에 걸쳐이 압력을 유지한다. 타이머를 시작합니다.
- 바늘 각도를 조정하십시오. 바늘의 각도가 최대 유량 (각도 조정 기능과 흐름의 변화에 유의)의 성과에 중요합니다.
- 광 스위치어 밸브 (파란색) 버퍼가 거의 완료되면 (200 ML). 액체는 분명 실행해야합니다. 간장의 개간은 좋은 재관류의 지표입니다. 간은이 시점에서 명확해야합니다. 기록 시간을 나타냅니다.
- 고정 떨림은 초 내에 관찰해야합니다, 이것은 고정의 진정한 시간을 고려해야합니다. 기록 시간을 나타냅니다.
- 압력은 점차 안정된 유량을 유지하기 위해 130mm HG 2의 최대까지 늘릴 수 있습니다.
- 정착액가 거의 완료되면 배출구 밸브를 닫습니다. 기록 시간이 종료되었음을 나타냅니다.
- 쥐이 단계에서 치열한 여야합니다.
- 사용 paraformaldehyde는 기관의 규정에 따라 처리를 위해 수집하여 저장해야합니다.
6. 해부 4,11
- 가위를 사용하여 머리를 제거합니다.
- 목에 코로 외피를 따라 중간선 절개를 만들어 노출두개골.
- 두개골의 바닥이 노출되어 있도록 남은 목 근육을 손질, 가위 또는 rongeurs를 사용하여 잔류 근육을 제거합니다.
- 신중하게 두개골의 안쪽 표면을 따라 가위 슬라이딩, 한쪽에 구멍 매그넘으로 홍채 가위의 날카로운 끝을 놓으십시오.
- 다음, 상처 후부 두개골 표면의 말초 가장자리로 연장합니다. contralateral 측면에 동일한 몫을합니다. 소뇌 주위 두개골을 멀리 취소 rongeurs을 사용합니다.
- 끝 당신이 뇌에 손상을 방지하기 위해 절단되면서 칼날에 리프팅, 지느러미 말초 후부 코너에서 두개골의 말초 전두엽 가장자리에 여행으로 조심스럽게 두개골의 안쪽 표면을 따라 가위를 끼웁니다. 반대편에 대해 반복합니다.
- 두뇌에서 떨어져 두개골 등 부분의 표면을 보지 rongeurs 사용하기. rongeurs을뿐만 아니라 사용하는 두개골의 측면을 떠나 트림.
- 주걱 사용하여 후각 구근과 불안 connec를 끊다두뇌의 복부 표면에 따라 tions.
- 부드럽게 아직도 홍채 가위를 사용하여 두개골에 두뇌를 연결하는 경질을 트리밍, 멀리 머리에서 머리를 조르다.
- 두뇌를 제거하고 정착액 함유 유체 뇌 자체의 볼륨이 최소 10X의 유리병에 넣습니다. 유리병 가끔 소용돌이.
7. 이후 고정 및 보관
- 가끔 소용돌이, 4 ° C에서 24 시간 동안 정착액의 뇌는 보관하십시오.
- 24 시간 이내에, 인산과 뇌를 씻어 것은 언론 3 회 교환하고 각 시간을 소용돌이에 의한 염분 버퍼.
- 머리가 그때 인산에 저장될 수있는 건 나트륨 azide와 염분이나 HBHS 버퍼와 4에서 보관 ° C.
8. 대표 결과
관류의 성공의 초기 지표는 코와 같은 사지, 귀 및 발냄새와 같은 thymus 글랜드 및 간장 (IHC 세계)와 같은 내부 장기의 개간이다.두뇌의 그로스 검사는 혈액 (연한 노란색 외관 흰색)의 혈관 무효를 보여준다. 이 염색법과 immunohistochemistry를위한 예정해 두다 조직 섹션 내에 사실이기도합니다. 관류의 결과의 마지막 지표는 조직의 ultrastructure의 조건이다. 1,6,7,8
| 정착액 준비 : |
| 8 % Paraformaldehyde 주식 준비 |
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| 0.2 M의 인산 나트륨 버퍼, 산도 7.4을 준비한다 |
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| 4 % Paraformaldehyde의 정착액을 준비 |
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| 관류 및 스토리지 버퍼를 준비합니다 : |
| 인산 준비는 식염, 산도 7.4 버퍼 |
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| HEPES는 나트륨 Azide의 산도 7.4으로 행크스 솔루션 (HBHS)를 버퍼 |
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표 1. 정착액 및 버퍼의 작성.
1 그림.
그림 2. 관류 장치 전의 준비 고정력있는 라인으로 시작. 공기 거품의 튜브를 플러시하고 빠르게 추방과 주사기로 및 회선을 통해 버퍼를 철수하여 버퍼에 기입하십시오. 바늘 끝에 밸브를 닫아. 공기 방울을 도입하지 않고 정착액 병에 정착액 라인을 놓습니다.
그림 3. 관류 장치 II의 준비. 1. 바늘 끝에 밸브를 엽니다. 2. 흐름을 위해 자리를 버퍼 밸브 (파란색)을 돌립니다. 3. 공기 거품의 튜브를 플러시하고 빠르게 추방과 주사기로 버퍼를 철수하여 버퍼에 기입하십시오. 4. 바늘 끝에 밸브를 닫습니다. 버퍼 병 속으로 튜브를 놓습니다. 시스템이 올바른 밀폐되고 있는지 확인하는 시험 압력혈압계 벌브를 펌핑하고 게이지를 보면서 요. 장치는 이제 재관류 절차에 대한 준비가되었습니다.
그림 4. 버퍼 제공을위한 위치에 관류 장치.
그림 5. 재관류 수술 전)는 외피와 복벽을 통해 가로 절개를합니다. B) 다이어프램의 절개를 만들어 심장을 노출 다이어프램 가로질러. 최대 쇄골까지 갈비의 양쪽에 평행 상처를 확인하십시오. C) hemostat과 흉골의 팁 클램프 및 머리 hemostat를 놓습니다.
그림 6. 재관류 수술 II. ) 오름차순 대동맥으로 절단 뇌실을 통해 관류 바늘을 전달합니다. B)를 확보마음을 클램프하는 hemostats의 재관류 바늘 하나를 사용 세트. 수정된 hemostat의 두 번째 세트도 누설을 방지하기 위해 바늘 끝 주위 대동맥 클램프하는 데 사용할 수 있습니다. 홍채 가위를 사용하면 좌심실 후부 끝에 작은 절개를합니다.
그림 7. 버퍼 펌프 라인의 압력을 만듭니다 혈압계 벌브와 재관류. 밸브 (1) 최대 열고 바늘 허브에 첨부합니다. 그것은 기포가 도입되지 않도록 중요합니다. 80mm HG의 압력에 혈압계 벌브를 펌프 및 버퍼 주입 기간에 걸쳐이 압력을 유지합니다.
그림 8. 버퍼 후에는 정착액과 재관류는 거의 (200 ML)이 흐름에 정착액 수 있도록 버퍼 밸브 (1) 전환 완료됩니다. 압력이 점차까지 늘릴 수 있습니다130mm HG 최대.
그림 9. 절개의 나) 가위의 쌍을 사용하여 머리를 제거합니다. 나) 목에 코에 중간선을 따라 피부 절개를하고 두개골을 노출. 두개골의 바닥이 노출되어 있도록 C) 남아있는 목 근육을 잘라. 태아의 두개골 표면에서 대형 오프닝 (구멍의 매그넘)가 접근할 수 있도록 머리를 잡아. 조심스럽게 구멍의 매그넘으로 홍채 가위의 날카로운 끝부분을 삽입하고 몫을합니다. contralateral 측면에 대해 동일한 책략을 반복합니다. 소뇌 주위 두개골을 멀리 취소 rongeurs을 사용합니다.
10 그림. 해부 II는. ) 조심스럽게 두개골의 안쪽 표면을 따라 가위를 끼웁니다. 당신은 뇌에 손상을 방지하기 위해 절단되면서 끝에 올려요. 동일 작업을 반복반대편. 두뇌에서 떨어져 두개골 껍질 rongeurs을 사용합니다. B) 두개골 그림은 제거되고 두뇌 노출. C) 뇌의 가장 앞쪽에 위치에서 후각 전구와 신경 연결을 도려 내야 주걱을 사용합니다. 조심스럽게 제거의 용이성을 위해 연결을 끊을 수있는 뇌의 아래쪽을 따라 주걱 팁을지도. 두뇌를 제거하고 정착액의 유리병에 넣습니다.
Discussion
성공적인 수술을위한 추가 사항 :
- 다이어프램이 돌파되면 hypoxia와 hypercapnia는 후속 분석을 먹이고 있습니다 돌이킬 수없는 생리적 변화를 시작하므로 급속 앞에.
- 바늘 삽입과 장소에 채워되면 잔류 압력 바늘 (플래시백)의 기지로 혈액을 밀어 것입니다. 사실, 큰 동물은 강력하게 혈액을 퇴학 수 있습니다. 그것은 피가 적어도 재관류를 완료하려면 장애물들을 제시하고 공기 방울을 도입 피하기 위해 바늘의 기준에 도달할 것이 중요합니다. 더 피를 바늘 기지에서 관찰되지 않은 경우 재관류의 장비의 아울렛 포트를 첨부하여 버퍼와 함께 바늘과 리필을 제거하십시오. 버퍼 팁을 통해 실행되면 바늘이 심장으로 다시 삽입하실 수 있습니다.
- 대동맥 내에서 바늘의 적절한 배치가 중요하다, 그것까지 대동맥 아치 등에 도달할 수 없습니다.
- 여러 perfusions가 일어나고있다면 그것은 필요하지 않습니다처음 때마다부터 O 설정. 사용자는 각 병 (200mls 동물 / 솔루션)에서 버퍼와 정착액 모두에 적절한 볼륨을 가지고 있어야합니다. 필요한 경우 병도 리필하실 수 있습니다. 고려해야 할 가장 중요한 부분은 동물에 대한 설정 (출력 밸브)에서 실행 재관류 라인을 플러시합니다. 관류의 완료 후,이 라인은 거기에 4 % paraformaldehyde를해야합니다. 버퍼 병에서 튜브를 제거하고 정착액을 플러시 물로 채워진 50 ML의 주사기를 사용합니다. 아웃렛 밸브는 paraformaldehyde의 적절한 처리를위한 폐기물 수거 비커에 배치되어 있는지 확인하십시오. 이 세 번 반복합니다. 2.3에 표시된 동일한 방법을 사용하여 버퍼로 리필.
- 고정을위한이 방법은 실험의 요구에 따라 버퍼와 정착액 기타 fixatives (예 : EM에 사용되는 것과 같은)을 모두 변경할 수있는 능력을 갖춘 고도의 적응이다.
- 시스템은 또한 자주 살아있는 조직의 추출에 사용됩니다. 이것에 대한프로세스 하나는 단순히 버퍼의 전송을 사용하여 전용 (여전히 전체 시스템에 부착된 상태에서 버퍼 병은 아이스 버킷에 배치하고 정착액 병이 비어 있지만 밀폐된 같은 설정입니다.) 이것은 최적의 압력에 감기 버퍼 재관류를 보장합니다. 여기에서 시스템 중 (수량이 문제가 아닌 경우) 버퍼로 직접 염료를 추가하거나 버퍼 / 버퍼 사이에 염료 용액의 최소한의 금액으로 주사기를 사용하여 고칠수 염료의 주입에 적용할 수 있습니다 - 고정력있는 단계.
- 혈관 캐스팅의 경우, 압력 모니터링 버퍼 단계 50ml 주사기 하나가 (튜브, 밸브 및 유지 장치로 직접 전송하거나 일회용 보조 첨부 파일을 사용해야하지만 점도와 주조 솔루션의 본질을 응고로 인한 중요합니다 현재의 시스템과 인터페이스로 만든 컨테이너)가 사용됩니다. 저희 실험실 '혈관 캐스팅은 관류 장치의 설계 및 제조에 앞서. 따라서 우리는 일 수 없다압력 측정 배달 사이트에서 정확한 측정 될 것이라고 먹었다. 번호는 점성 유체의 성공적인 전송을 달성하기 위해 조정해야 할 수도 있습니다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 신경 통신 기술을위한 센터 (CNCT), 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 국립 연구소 (NIBIB, P41 EB002030)에 의해 재정 지원과 국립 보건원 (NIH)에서 지원하는 P41 자원 센터에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Anesthetic may vary per laboratory / institution) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | 10 mL vial |
| Surgery: | |||
| Needle tip, 27 GA x 1.25" | Materiel Services | 25251 | |
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 1 large hemostat forceps - curved or straight (~19 cm) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
| 2 standard hemostat forceps - straight serrated (14 cm) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 1 modified hemostat (with 15-gauge hole filed through the tip) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 15-gauge blunt or olive-tipped needle (perfusion needle) | Fisnar | 5601137 | |
| Perfusion: | |||
| HyPerfusion system or equivalent | |||
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| 4% Paraformaldehyde in 0.1 M Phosphate Buffer, pH 7.4 | |||
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Crushed ice | |||
| Water bath (37 °C) | |||
| Timer | |||
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (~12 cm) | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Medium curved or straight rongeurs (14-16 cm) or skull bone removal pliers | Fine Science Tools | 16020-14 | |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml glass vial | |||
| 40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) with sodium azide (90mg/l) | |||
References
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