Summary
Her beskriver vi en billig, hurtig, reguleret og ensartet fiksering under anvendelse af 4% paraformaldehyd perfuseres gennem det vaskulære system: gennem hjertet af rotte for at opnå den bedst mulige bevarelse af hjernen.
Abstract
Målet med fiksering er hurtigt og ensartet bevare væv i et liv-lignende tilstand. Mens placere væv direkte fastgørelse fungerer godt for små stykker væv, større prøver som den intakte hjerne udgør et problem for fordybelse fiksering, fordi fiksativet ikke nå ud til alle områder af vævet i samme tempo 5,7. Ofte ændringer i respons på hypoxi begynde før vævet kan bevares 12. Fordelen ved direkte perfusion af fiksativ gennem kredsløbet er, at den kemiske hurtigt kan nå ud til alle hjørner af skadegøreren ved hjælp af naturlige vaskulære netværk. For at benytte kredsløbet mest effektivt, skal der drages omsorg for at matche fysiologiske belastninger 3. Det er vigtigt at bemærke, at fysiologiske belastninger er afhængige af den anvendte art. Teknikker til perfusion fiksering varierer afhængigt af det væv, der skal fastgøres, og hvor vævet behandles efter fiksering. I denne video, Beskriver vi en billig, hurtig, reguleret og ensartet fiksering under anvendelse af 4% paraformaldehyd perfuseres gennem det vaskulære system: gennem hjertet af rotte for at opnå den bedst mulige bevarelse af hjernen for immunhistokemi. Den væsentligste fordel ved denne teknik (vs tyngdekraften fødes systemer), er, at kredsløbet anvendes mest effektivt.
Protocol
1. Forbered Fixativ
(Se tabel fiksativ og buffere).
2. Forbered perfusion Buffere
(Se tabel fiksativ og buffere).
3. Forbered Apparatur og bedøvelse
- Ved hjælp af vandbad varmt perfusionsbuffer til 37 ° C. Sted udløbsventil i et bægerglas fyldt med puffer. Fyld en 50 ml sprøjte med buffer og tillægger fiksativ slange. Skylle slangen gange ved at udstøde og tilbagetrækning puffer.
- Ryd linje med buffer, indtil alle luftbobler i slangen er elimineret. Det er afgørende for succesen af en perfusion ikke at have luftbobler i nogen af linjerne.
- Fjern sprøjten, og tilslut 4% paraformaldehyd fiksativ (stuetemperatur) beholder. For at undgå luftbobler i røret ende klemme røret, mens anbringelse af røret ind i beholderen, således at en dråbe buffer rager frem fra enden tO-kontakten væskeoverfladen inden i beholderen.
- Lukke udgangsporten (nåleenden). Drej buffer ventil (blå) til den samme position som fiksativ ventil (hvid). Dette vil tillade strømning fra bufferen linje.
- Åbne udløbsåbningen, og gentag trin A1 gennem A3 til fyldning bufferen linje. Efter at alle de luftbobler fjernes tæt udløbsporten, fjernes sprøjten og forbinde pufferen beholderen, idet man ikke at indføre luftbobler i slangerne.
- Testsystem til evnen til at holde tryk ved pumpning gummi manometer Blub. Der normalt er en vis modstand på grund af kompression af luft i systemet.
- Opsætning kirurgi værktøjer, for nem adgang. Fylde perfusion nål med puffer for at eliminere muligheden for luftbobler.
- Før kirurgi, er en ketamin / xylazin-blanding (op til 80 mg / kg legemsvægt ketamin og 10 mg / kg legemsvægt xylazin) indgives via intraperitoneal injektion (27 gauge nål og en cc sprøjte). Yderligere indgivelse af anæstetikum udføres om nødvendigt i løbet af hver operation til at opretholde en kirurgisk plan af anæstesi.
4. Perfusion Kirurgi
- Når dyret har nået en kirurgisk plan anæstesi, placere den på den lave bakke fyldt med knust is. (Brug toe knivspids-respons-metoden til at bestemme dybden af bedøvelse. Dyret skal reagerer, før du fortsætter).
- Lav en 5-6 cm lateral snit gennem integument og bugvæggen lige under brystkassen. Omhyggeligt adskille leveren fra membranen.
- Lave et lille snit i membranen ved hjælp af de krumme og stumpe saks. Position og trykket af fingeren kan hjælpe i evnen til at skære membranen.
- Fortsætte membranen snit langs hele længden af ribben bur for at blotlægge det pleurale hulrum.
- Placer buede, sløve saks langs den ene side af ribberne, omhyggeligt fortrænge lungerne, og lave en cut gennem brystkassen op til kravebenet. Foretage en tilsvarende snit på den kontralaterale side.
- Løft brystbenet væk, omhyggeligt trimme alle væv at tilslutte den til hjertet. Fastspænde brystbensspids med arterieklemme og placere hæmostat over hovedet. Når du er færdig korrekt, thymus løfter væk fra hjertet sammen med brystbenet, giver et klart billede af de store fartøjer.
- Lave et lille snit i den bageste ende af den venstre ventrikel ved anvendelse af iris saks.
Klik her for at se større figur .
- Passerer en 15-gauge stump-eller olivenolie spids perfusion nål gennem snittet ventrikel ind i aorta ascendens. Spidsen skal være synligt gennem væggen i aorta, og bør ikke være aortabuen hvor brachial og carotide arterier divergerer.
- Anvender en hæmostat at fastklemme hjertet dette sikrer nålen og forhindrer lækage. Hvis det ønskes, kan det modificerede hæmostat anvendes til at klemme aorta omkring nålens spids (disse hemostats forbliver på plads, indtil dissektion begynder, men er udeladt fra fremtidige illustrationer af hensyn til overskueligheden).
- Endelig lave et snit i dyrets højre atrium med iris saks til at skabe så stort et udløb som muligt uden at beskadige den nedadgående aorta. På dette tidspunkt dyret er parat til at blive perfunderet.
5. Perfusion
- Åbn og vedhæfte udgangsporten til p basen pas på ikke at indføre eventuelle luftbobler.
- Skru op for manometeret pære til et tryk på 80 mm Hg hurtigt og jævnt. Opretholde dette tryk i hele bufferen infusionsperioden. Start timeren.
- Juster nålen vinkel. Vinklen af nålen er afgørende for opnåelse af en maksimal flowhastighed (bemærk flow ændringen med vinkel justering).
- Skift buffER ventil (blå), når bufferen er næsten afsluttet (200 ml). Fluidet skal køre klar. Udligningen af leveren er en indikator for en god perfusion. Leveren bør være klart på dette tidspunkt. Angiv tid til dine optegnelser.
- Fiksering rystelser skal overholdes inden for få sekunder, skal dette betragtes som sande tidspunkt for fiksering. Angiv tid til dine optegnelser.
- Trykket kan efterhånden være stige op til et maksimum på 130 mm Hg 2 for at opretholde en lind strøm på.
- Lukke udløbsventilen når fiksativet er næsten færdig. Angiv sluttid for dine optegnelser.
- Rotten skal være stiv på dette tidspunkt.
- Den anvendte paraformaldehyd skal opsamles og opbevares til bortskaffelse i henhold til reglerne i din institution.
6. Dissektion 4,11
- Tag hovedet med en saks.
- Gøre en midtlinie-incision langs integument fra halsen til næsen og blotlæggekraniet.
- Skær de resterende halsmusklerne, så bunden af kraniet udsættes; fjerne enhver resterende muskler ved hjælp af saks eller rongeurs.
- Anbring den skarpe ende af et par iris sakse i foramen magnum på den ene side, forsigtigt at glide saksen langs den indre overflade af skallen.
- Dernæst lave et snit strækker sig til den distale kant af den bageste kraniet overflade. Foretage en identisk snit på den kontralaterale side. Brug rongeurs for at fjerne kraniet omkring lillehjernen.
- Omhyggeligt glide saksen langs den indre overflade af kraniet, som spidsen bevæger sig fra den dorsale distale bageste hjørne til den distale forreste kant af skallen, løfter på bladet, som man skærer at forhindre skade på hjernen. Gentag til modsatte side.
- Ved hjælp rongeurs skræl den dorsale overflade af kraniet væk fra hjernen. Trim væk siderne af skallen ved hjælp rongeurs så godt.
- Ved hjælp af en spatel, de olfaktoriske pærer og nervøs tilslutninger kappetioner langs den ventrale overflade af hjernen.
- Forsigtigt driller hjernen væk fra hovedet, trimning enhver dura, der stadig forbinder hjernen til kraniet ved iris saks.
- Fjernes hjernen og anbringes i et hætteglas af fiksativ indeholdende væske mindst 10 gange volumenet af selve hjernen. Hætteglasset lejlighedsvis.
7. Post-fiksering & Storage
- Holde hjernen i fiksativ i 24 timer ved 4 ° C, omhvirvling lejlighedsvis.
- Efter 24 timer hjernen vaskes med phosphatpufret saltvand ved udskiftning af medier 3 gange og omhvirvling hver gang.
- Hjerner kan derefter opbevares i phosphatbufret saltvand eller HBHS med natriumazid og opbevaret ved 4 ° C.
8. Repræsentative resultater
En første indikator for succes perfusionen er clearing af ekstremiteterne såsom næse, ører og ben og indre organer såsom thymus og lever (IHC Verden).Gross inspektion af hjernen afslører blodkar tomrum af blod (hvid til lysegul udseende). Det vil også være sandt i vævssnit afsætte for farvning og immunhistokemi. Den endelige indikator resultat af perfusionen er tilstanden af ultrastruktur i vævet. 1,6,7,8
| Forbered Fixativ: |
| Forberede 8% paraformaldehyd lager |
|
| Fremstille 0,2 M natriumphosphatbuffer, pH 7,4 |
|
| Fremstilling af 4% paraformaldehyd Fixative |
|
| Forbered Perfusion og opbevaring Buffere: |
| Forberede phosphatpufret saltopløsning, pH 7,4 |
|
| HEPES-bufret Hanks opløsning (HBHS) med natriumazid, pH 7,4 |
|
Tabel 1. Fremstilling af fiksativ og buffere.
Figur 1.
Figur 2. Udarbejdelse af Perfusion Apparatur I. Begynd med fiksativ linje. Skylle slangen luftbobler og fyldes med buffer ved hurtigt udstøde og tilbagetrækning puffer ind i sprøjten, og gennem ledningen. Lukke ventilen på nåleenden af. Placere fiksativet linje i fikseringsmiddelsammensætningen flasken uden at indføre luftbobler.
Figur 3. Fremstilling af Perfusion Apparatus II. 1. Åbne ventilen på nåleenden. 2. Drej buffer ventil (blå) til position for flow. 3. Skyl slangen af luftbobler og fyld med buffer ved hurtigt at udstøde og fratagelse af buffer med sprøjten. 4. Lukker ventil nåleenden. Anbring slangen i bufferen flasken. Test pres for at sikre, at systemet er forseglet korrektly ved at pumpe op manometer pære og se måleren. Apparatet er nu klar til perfusion procedure.
Figur 4. Perfusion Apparat position buffer levering.
Figur 5. Perfusion Kirurgi I. a) Lav en lateral snit gennem integument og bugvæggen. b) Lav en incision i membranen og skæres på tværs af membranen udsættes hjertet. Gør parallelle snit på hver side af ribberne op til nøglebenet. c) klemme brystbensspids med arterieklemme og placere hæmostat over hovedet.
Figur 6. Perfusion Surgery II. a) Før perfusion nål gennem snittet ventrikel ind i aorta ascendens. b) Fastgørperfusion nål bruge ét sæt af hemostats at gribe kraftigt ind i hjertet. Et andet sæt af en modificeret hæmostat kan også anvendes til at klemme aorta omkring nålens spids til forhindrer lækage. Ved hjælp af iris saks lave et lille snit i den bageste ende af den venstre ventrikel.
Figur 7. Perfusion med puffer Pump manometeret pæren at skabe tryk i ledningen. Åbn ventilen (1) og tillægger nålehubben. Det er vigtigt at sikre, at ingen luftbobler er indført. Pumpe op på manometeret pære til et tryk på 80 mm Hg og opretholde dette tryk i hele bufferen infusionsperioden.
Figur 8. Perfusion med Fixative Når bufferen er næsten færdig (200 ml) skifte pufferen ventilen (1) for at muliggøre fiksativ til at flyde. Trykket kan gradvist øges op tilmaksimalt 130 mm Hg.
Figur 9. Dissektion I. a) at fjerne hovedet ved hjælp af et par saks. b) lave et snit i huden langs midterlinien fra halsen til næsen og blotlægge kraniet. c) trimme den resterende halsmusklen således at bunden af kraniet er blotlagt. Hold hovedet, således at den store åbning i kraniet overfladen (foramen magnum) er tilgængelig. Forsigtigt indsætte den skarpe ende af et par iris sakse i foramen magnum og lave et snit. Gentag den samme manøvre for den kontralaterale side. Brug rongeurs for at fjerne kraniet omkring lillehjernen.
Figur 10. Dissection II. a) forsigtigt glide saksen langs den indre overflade af skallen. Løft op på spidsen, som du skærer for at forhindre skader på hjernen. Gentage den samme formodsatte side. Anvende rongeurs peel kraniet væk fra hjernen. b) illustration med kraniet fjernet, og hjernen blotlagt. c) anvendelse af en spatel til at adskille de olfaktoriske pærer og nerveforbindelser ved den forreste position af hjernen. Omhyggeligt styre spatelspids langs undersiden af hjernen for at adskille forbindelser for let fjernes. Tag hjerne og placere den i et hætteglas med fiksativ.
Discussion
Supplerende noter for en vellykket operation:
- Når membranen er brudt, før hurtigt som hypoxi og hyperkapni vil igangsætte irreversible fysiologiske ændringer, der kan kobling af efterfølgende analyse.
- Når nålen er indsat og fastspændt på plads, vil resttryk skubbe blod til bunden af nålen (flashback). Faktisk kan større dyr kraftigt udvise blod. Det er vigtigt, at blod i det mindste når bunden af nålen for at undgå indføring af luftbobler, der udgør en hindring for at fuldføre perfusion. Hvis der ikke blod er observeret ved nålen base, fjernes kanylen, og fyld med buffer ved at knytte det til afgangsporten af perfusion riggen. Når bufferen er blevet kørt igennem spidsen, kan nålen blive genindsat ind i hjertet.
- Korrekt placering af nålen i aorta er kritisk, bør det ikke nå så langt som aortabuen.
- Hvis flere perfusioner finder sted er det ikke nødvendigt to setup fra starten hver gang. Brugeren skal have den korrekte mængde til både buffer og fikseringsmiddel i hver flaske (200 ml dyr / opløsning). Flaskerne kan også fyldes efter behov. Det vigtigste aspekt at overveje, er skylle ud perfusionen linje, der løber fra opsætningen på dyret (output ventil). Efter afslutningen af en perfusion, vil denne linie har 4% paraformaldehyd i den. Fjerne røret fra bufferen flasken og anvende en 50 ml sprøjte fyldt med vand til udskylning af fiksativ. Sørg for, at udløbsventilen er placeret i en indsamling af affald bægerglas for korrekt bortskaffelse af paraformaldehyd. Gentag dette tre gange. Refill med puffer under anvendelse af samme metode er vist i 2.3.
- Denne fremgangsmåde til fastgørelse, er meget fleksibel med evnen til at ændre både buffer og fastgørelse andre fikseringsmidler (såsom dem, der anvendes til EM) ifølge krav eksperimentet.
- Systemet er også ofte anvendes til ekstraktion af levende væv. Til detteProcessen man simpelthen anvendes til levering af puffer alene (bufferen flasken, medens stadig fastgjort til hele systemet anbragt i et is spanden og fiksativ flasken er sat som tom, men tætnet). Dette sikrer en kold buffer perfusion ved det optimale tryk. Herfra kan systemet tilpasses til infusion af kan begrænses farvestoffer enten med farvestoffet direkte til bufferen (hvis den mængde, der ikke er et problem), eller anvende en sprøjte med en minimal mængde af puffer / farvestofopløsning mellem bufferen - fiksativ trin.
- I tilfælde af vaskulær støbning er trykovervågning pufferen trin afgørende imidlertid på grund af viskositeten og størkning art støbeopløsning enten en 50 ml sprøjte skal anvendes til direkte levering, eller en engangs sekundært fastgørelse til apparatet (slange, ventil og holde container) til interface med det nuværende system skal bruges. Vores laboratoriers vaskulær casting forud for design og fremstilling af perfusion apparatet. Derfor kan vi ikke stspiste at trykmålinger vil være en nøjagtig måling på indgiftsstedet. Numrene kan være nødvendigt at justere for at opnå en vellykket levering af viskose fluider.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Center for Neural kommunikationsteknologi (CNCT), en P41 Resource Center finansieret af National Institute of Biomedical Imaging og Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) og støttet af National Institutes of Health (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Anesthetic may vary per laboratory / institution) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | 10 mL vial |
| Surgery: | |||
| Needle tip, 27 GA x 1.25" | Materiel Services | 25251 | |
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 1 large hemostat forceps - curved or straight (~19 cm) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
| 2 standard hemostat forceps - straight serrated (14 cm) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 1 modified hemostat (with 15-gauge hole filed through the tip) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 15-gauge blunt or olive-tipped needle (perfusion needle) | Fisnar | 5601137 | |
| Perfusion: | |||
| HyPerfusion system or equivalent | |||
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| 4% Paraformaldehyde in 0.1 M Phosphate Buffer, pH 7.4 | |||
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Crushed ice | |||
| Water bath (37 °C) | |||
| Timer | |||
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (~12 cm) | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Medium curved or straight rongeurs (14-16 cm) or skull bone removal pliers | Fine Science Tools | 16020-14 | |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml glass vial | |||
| 40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) with sodium azide (90mg/l) | |||
References
- Cinar, O., Semiz, O., Can, A. A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections. Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).
- Fritz, M., Rinaldi, G. Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).
- Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats. Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).
- Jacobowitz, D. M. Removal of discrete fresh regions of rat brain. Brain Res. 80, 111-115 (1974).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).
- Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).
- Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration. J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).
- Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).
- Ramos-Vara, J. A. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues. J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).
- Walker, W. F. Vertebrate dissection. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).
- Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. J. Neurotrauma. Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).
