Summary
Hier beschrijven goedkope, snelle, beheerste en gelijkmatige fixatie procedure met 4% paraformaldehyde geperfuseerd via het vasculaire systeem: door het hart van de rat de best mogelijke bescherming van de hersenen te verkrijgen.
Abstract
Het doel van fixatie is om snel en gelijkmatig weefsel te bewaren in een leven-achtige toestand. Terwijl het plaatsen van weefsel direct in fixatief werkt goed voor kleine stukjes weefsel, grotere exemplaren, zoals de intacte hersenen vormen een probleem voor onderdompeling fixatie, omdat de fixeermiddel niet alle regio's van het weefsel te bereiken met dezelfde snelheid 5,7. Vaak als reactie op hypoxie beginnen vóór het weefsel kan worden bewaard 12. Het voordeel van direct perfuseren fixatief door het vaatstelsel is dat de chemische snel kan bereiken elke hoek van het organisme met behulp van de natuurlijke vasculaire netwerk. Om de bloedsomloop te gebruiken het meest effectief, moet erop worden gelet te evenaren fysiologische druk 3. Het is belangrijk op te merken dat fysiologische druk afhankelijk van de gebruikte soort. Technieken voor perfusie fixatie variëren, afhankelijk van het weefsel vast te stellen en hoe het weefsel zullen worden verwerkt volgende fixatie. In deze videoBeschrijven we een goedkope, snelle, beheerste en gelijkmatige fixatie procedure met behulp van 4% paraformaldehyde doorbloed via het vasculaire systeem: door het hart van de rat om de best mogelijke bescherming van de hersenen voor immunohistochemie te verkrijgen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek (versus zwaartekracht gevoerde systemen) is het circulatiesysteem is het meest effectief benut.
Protocol
1. Bereid Fixatief
(Zie tabel Fixatief en buffers.)
2. Bereid Perfusie Buffers
(Zie tabel Fixatief en buffers.)
3. Bereid Apparaten en Anesthesie
- Met behulp van het waterbad, warme perfusie buffer tot 37 ° C. Plaats uitlaatklep in een bekerglas gevuld met buffer. Vul een 50 ml spuit met buffer en hechten aan fixeermiddel buizen. Herhaaldelijk Spoel slang door verdrijven of intrekking van de buffer.
- Maak de lijn met buffer totdat alle luchtbellen in de slang worden geëlimineerd. Het is cruciaal voor het succes van een perfusie niet om luchtbellen te hebben in een van de lijnen.
- Verwijder de spuit en sluit de 4% paraformaldehyde fixatief (kamertemperatuur) container. Om luchtbellen in de slang einde te vermijden, knijp de buis, terwijl het plaatsen van de buis in de container zodat er een druppel buffer steekt vanaf het einde to contact opnemen met de vloeistof oppervlak in de container.
- Sluit de uitlaatpoort (naald einde). Draai buffer afsluiter (blauw) om dezelfde positie als het fixeermiddel klep (wit). Hierdoor kunnen vloeien voort uit de buffer lijn alleen.
- Open de uitlaatpoort en herhaal stap A1 tot en met A3 voor het vullen van de buffer lijn. Nadat alle luchtbellen dicht geëlimineerd de uitlaatpoort, verwijder de spuit en sluit de buffer container, waarbij zorg niet om luchtbellen te introduceren in de slang.
- Test systeem voor het vermogen om onder druk te houden door het pompen van het rubber manometer blub. Er is doorgaans enige weerstand vanwege de compressie van de lucht in het systeem.
- Stel een operatie tools om voor eenvoudige toegang. Vul perfusie naald met buffer de mogelijkheid luchtbellen te verwijderen.
- Voorafgaand aan chirurgie, wordt een ketamine / xylazine mengsel (tot 80 mg / kg lichaamsgewicht ketamine en 10 mg / kg lichaamsgewicht xylazine) toegediend intraperitoneale injectie (27 gauge naald en 1 cc spuit). Extra toediening verdoving wordt uitgevoerd als nodig tijdens elke bewerking een chirurgische vlak van anesthesie handhaven.
4. Perfusie Chirurgie
- Als het dier eenmaal heeft bereikt een chirurgische vlak van anesthesie, plaats het op de ondiepe bak gevuld met crushed ijs. (Gebruik teen pinch-reactie methode om de diepte van anesthesie te bepalen. Dieren moeten niet reageren voordat u verder gaat).
- Maak een 5-6 cm laterale incisie door de omhulling en buikwand net onder de ribbenkast. Haal voorzichtig de lever van het middenrif.
- Maak een kleine incisie in het membraan met behulp van de gebogen, stompe schaar. De positie en de druk van de vinger kan helpen bij het vermogen om het membraan te snijden.
- Verdere membraan incisie langs de gehele lengte van de ribbenkast van de pleura-holte bloot te leggen.
- Plaats gebogen, stompe schaar langs een zijde van de ribben zorgvuldig verplaatsen van de longen en een cut door de ribbenkast tot aan het sleutelbeen. Maak een vergelijkbare snee in de contralaterale zijde.
- Het opheffen van de borstbeen weg, knip zorgvuldig elk weefsel aan te sluiten op het hart. Klem de punt van het borstbeen met de hemostat en plaats de hemostaat over het hoofd. Wanneer goed uitgevoerd, de thymus tilt uit de buurt van het hart, samen met het borstbeen, die een duidelijk beeld van de grote schepen.
- Maak een kleine incisie aan de achterste eind van de linker ventrikel met behulp van iris schaar.
Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
- Laat een 15-gauge bot-of olijf-tip perfusie naald door de snede hartkamer in de aorta ascendens. De tip moet zichtbaar zijn door de wand van de aorta, en mag niet bij de aortaboog waar de arm en de halsslagaders uiteen.
- Gebruik een hemostaat naar het hart vast te klemmen, dit stelt de naald en voorkomt lekkage. Desgewenst kan de gemodificeerde hemostat worden gebruikt om de aorta klemmen rond de naald (deze hemostats blijven totdat ontleding begint, maar weggelaten toekomstige illustraties voor de duidelijkheid).
- Tot slot maken een incisie het recht van het dier atrium met iris een schaar om zo groot op een stopcontact mogelijk te maken zonder beschadiging van de dalende aorta. Op dit punt is het dier klaar om te worden doorbloed is.
5. Perfusie
- Open en sluit uitlaatpoort om de naald basis zorg ervoor dat u eventuele luchtbellen te introduceren.
- Pomp de manometer lamp een druk van 80 mm Hg snel en gelijkmatig. Houd deze druk in de buffer infusie periode. Start de timer.
- Pas de naald hoek. De hoek van de naald is cruciaal voor het bereiken van een maximaal debiet (let op de stroom veranderen met instelbare hoek).
- Schakel de buffre afsluiter (blauw) als buffer is bijna klaar (200 ml). De vloeistof moet worden uitgevoerd duidelijk. De verrekening van de lever is een indicator van een goede doorbloeding. De lever moet duidelijk zijn op dit punt. Geef de tijd voor uw administratie.
- Fixatie bevingen in acht worden genomen binnen een paar seconden: dit moet worden beschouwd als de ware tijd van fixatie. Geef de tijd voor uw administratie.
- De druk kan geleidelijk te verhogen tot maximaal 130 mm Hg 2 een constante stroom te behouden.
- Sluit de uitlaatklep zodra de fixatief is bijna klaar. Geef eindtijd voor uw administratie.
- De rat moet stijf zijn in dit stadium.
- De gebruikte paraformaldehyde moet worden verzameld en opgeslagen voor verwijdering volgens de voorschriften van uw instelling.
6. Dissection 4,11
- Verwijder de kop met een schaar.
- Maak een middellijn incisie langs de integument van de nek naar de neus en blootschedel.
- Snij de resterende nekspier, zodat de basis van de schedel wordt blootgesteld, verwijder eventueel resterende spieren met behulp van schaar of rongeurs.
- Plaats het scherpe uiteinde van een paar iris schaar in de foramen magnum enerzijds goed glijdende de schaar langs het binnenoppervlak van de schedel.
- Maak vervolgens een snede uit te breiden tot de verste rand van de achterste schedel oppervlak. Maak een identieke snee in de contralaterale zijde. Gebruik de rongeurs op te ruimen de schedel rond de kleine hersenen.
- Schuif de schaar langs het binnenoppervlak van de schedel de tip loopt van de dorsale distale achterste hoek van de distale frontale rand van de schedel, op te tillen het mes u snijden van hersenbeschadiging voorkomen. Herhaal aan de andere kant.
- Met behulp van rongeurs schil de dorsale zijde van de schedel uit de buurt van de hersenen. Snij de zijkanten van de schedel met rongeurs ook.
- Met behulp van een spatel, verbreken de olfactorische bollen en nerveus aansluitinggen langs het ventrale oppervlak van de hersenen.
- Voorzichtig te plagen de hersenen uit de buurt van het hoofd, trimmen elke dura die nog steeds de hersenen verbindt met de schedel met behulp van iris schaar.
- Verwijder de hersenen en plaats het in een flesje fixatief bevattende vloeistof minstens 10x het volume van de hersenen zelf. Zwenk de flacon af en toe.
7. Post-fixatie & Opslag
- Houd de hersenen in fixeermiddel voor 24 uur bij 4 ° C, wervelende af en toe.
- Na 24 uur was de hersenen met fosfaat gebufferde zoutoplossing door uitwisseling van het medium 3 keer en wervelende telkens.
- Hersenen kan vervolgens worden opgeslagen in fosfaat gebufferde zoutoplossing of HBHS met natriumazide en bewaard bij 4 ° C.
8. Representatieve resultaten
Een eerste indicator van het succes van de perfusie is de clearing van de extremiteiten, zoals de neus, oren en poten en interne organen zoals de thymus en de lever (IHC World).Bruto inspectie van de hersenen toont het bloedvat leegte van bloed (wit tot lichtgeel uiterlijk). Dit zal ook het geval in weefselcoupes bestemmen voor de kleuring en immunohistochemie. De laatste indicator van het resultaat van de perfusie is de toestand van de ultrastructuur in het weefsel. 1,6,7,8
| Bereid Fixatief: |
| Bereid 8% paraformaldehyde voorraad |
|
| Bereid 0,2 M natriumfosfaat buffer, pH 7,4 |
|
| Bereid 4% paraformaldehyde Fixatief |
|
| Bereid Perfusie en opslag Buffers: |
| Bereid fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing, pH 7,4 |
|
| HEPES gebufferde Hanks Solution (HBHS) met natriumazide pH 7,4 |
|
Tabel 1. Voorbereiding van Fixatief en buffers.
Figuur 1.
Figuur 2. Voorbereiding van de perfusie Apparatuur I. Begin met het fixeermiddel lijn. Spoel de slang van luchtbellen en vul met buffer door snel verdrijven of intrekking van de buffer in de spuit en door de lijn. Sluit de afsluiter op de naald einde uit. Plaats de fixatief lijn in het fixeermiddel fles zonder dat er luchtbellen.
Figuur 3. Voorbereiding van de perfusie Apparatuur II. 1. Open klep op de naald eind. 2. Draai buffer afsluiter (blauw) in de stand voor flow. 3. Spoel de slang van luchtbellen en vul met buffer door snel verdrijven of intrekking van de buffer met de spuit. 4. Sluit klep op de naald eind. Plaats slang in de buffer fles. Test de druk om te controleren of het systeem correct verzegeldly door het oppompen van de manometer lamp en het kijken naar de meter. Het apparaat is nu klaar voor de perfusie procedure.
Figuur 4. Perfusie Apparatuur positie voor buffer levering.
Figuur 5. Perfusie Chirurgie I. a) Maak een laterale incisie door de omhulling en buikwand. b) Maak een insnijding in het middenrif en dwars door het membraan het blootstellen van het hart. Merk evenwijdige sneden aan weerszijden van de ribben aan het sleutelbeen. c) klem de punt van het borstbeen met de hemostat en plaats de hemostaat over het hoofd.
Figuur 6. Perfusie Chirurgie II. a) Voer de perfusie naald door de snede hartkamer in de aorta ascendens. b) Bevestig deperfusie naald gebruik een set hemostats naar het hart vast te klemmen. Een tweede set van gewijzigde hemostaat kan ook worden gebruikt om de aorta klemmen rond de naaldpunt te voorkomen lekkage. Met behulp van iris schaar een kleine incisie aan het achterste eind van de linker hartkamer.
Figuur 7. Perfusie met Buffer Pomp de manometer lamp om de druk in de regel te maken. Open de klep (1) en bevestig deze aan de naald hub. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd. Pomp de manometer lamp een druk van 80 mm Hg en houden deze druk gedurende de buffer infusie.
Figuur 8. Perfusie met een fixatief Als buffer is bijna klaar (200 ml) schakelt de buffer ventiel (1), zodat voor het fixeermiddel te stromen. De druk kan geleidelijk worden verhoogd tot eenmaximaal 130 mm Hg.
Figuur 9. Dissection I. a) verwijderen van de kop met een paar schaar. b) maakt een sneetje in de huid langs de middellijn van de nek naar de neus en bloot de schedel. c) gekozen uit de resterende nekspier zodat de basis van de schedel blootgesteld. Houd het hoofd, zodat de grote opening in de schedel oppervlak (foramen magnum) toegankelijk is. Steek de scherpe punt van een paar van iris schaar in het foramen magnum en maak een snede. Herhaal deze manoeuvre voor de contralaterale zijde. Gebruik de rongeurs op te ruimen de schedel rond de kleine hersenen.
Figuur 10. Dissection II. a) de schuif schaar langs het binnenoppervlak van de schedel. Til op de punt als u snijden om schade aan de hersenen te voorkomen. Herhaal hetzelfde voorandere kant. Weg Gebruik rongeurs schil de schedel van de hersenen. b) illustratie met de schedel verwijderd en de hersenen blootgesteld. c) het gebruik een spatel om de olfactorische bollen en zenuwverbindingen te verbreken op de meest voorste locatie van de hersenen. Leid de spatel te breken langs de onderkant van de hersenen om verbindingen te verbreken voor het gemak van verwijderen. Verwijder de hersenen en plaats het in een flesje fixatief.
Discussion
Aanvullende opmerkingen voor een succesvolle operatie:
- Zodra het membraan wordt overtreden, voorafgaan snel hypoxie en hypercapnie zal onomkeerbare fysiologische veranderingen die verdere analyse kunnen beïnvloeden te starten.
- Wanneer de naald en vastgeklemd wordt de restdruk druk bloed naar de bodem van de naald (Flashback). In feite kan grotere dieren krachtig te verdrijven bloed. Het is essentieel dat tenminste bloed de basis van de naald bereiken voorkomen dat er luchtbellen dat een obstakel voor perfusie zal vullen. Als er geen bloed wordt waargenomen op de naald basis, verwijder de naald en opnieuw vullen met buffer door het aanbrengen van het aan de uitlaatpoort van de perfusie rig. Als buffer is uitgevoerd door de tip, kan de naald worden teruggeplaatst in het hart.
- Juiste plaatsing van de naald in de aorta kritisch is, dient het niet doorlopen tot aan de aorta-boog.
- Als er meerdere perfusies vinden plaats is het niet nodig to setup vanaf het begin elke keer. De gebruiker dient te beschikken over de juiste volume voor zowel de buffer en fixatief in elke fles (200mls dier / oplossing). De flessen worden gevuld indien nodig. Het belangrijkste aspect om te overwegen is het verwijderen van de perfusie lijn die loopt van de setup om het dier (output klep). Na de voltooiing van een perfusie, deze lijn zal 4% paraformaldehyde in hebben. Verwijder de slang uit de buffer fles en gebruik maken van een 50 ml injectiespuit gevuld met water te spoelen het fixeermiddel. Zorg ervoor dat de uitlaatklep wordt geplaatst in een inzameling van afval beker voor goede afvoer van het paraformaldehyde. Herhaal dit drie keer. Vul met buffer met behulp van dezelfde methode als beschreven in 2.3.
- Deze methode voor bevestiging zeer flexibel met de mogelijkheid om zowel buffer en fixeermiddel andere fixeermiddelen (zoals die voor EM) wijzigen volgens de vereisten van het experiment.
- Het systeem wordt ook vaak gebruikt voor de extractie van levend weefsel. Hiervoorwerkwijze gebruikt men slechts de levering van buffer alleen (de buffer fles terwijl aan hele systeem wordt in een ijs emmer en het fixeermiddel fles is ingesteld als leeg maar gesloten). Dit verzekert een koude buffer perfusie de optimale druk. Vanuit het systeem kan worden aangepast aan de infusie van fixeerbaar kleurstoffen door het toevoegen van de kleurstof rechtstreeks aan de buffer (indien de hoeveelheid geen probleem is) of een spuit met een minimale hoeveelheid buffer / kleurstofoplossing tussen de buffer - fixatief stap.
- Bij gieten vasculaire de drukcontrole buffer stap is cruciaal maar door de viscositeit en stollen aard van de gietoplossing hetzij een 50 ml spuit worden gebruikt voor directe steun of een wegwerp secundaire bevestiging aan de inrichting (slang, klep en vasthouden container) aan interface met het huidige systeem gebruikt worden. Onze laboratoria 'vasculaire casting ging vooraf aan het ontwerp en de productie van de perfusie apparaat. Daarom kunnen we geen STaten dat de druk metingen zullen een nauwkeurige meting bij de levering site. De nummers kunnen worden aangepast om een succesvolle aflevering van viskeuze vloeistoffen te bereiken.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het Centrum voor Neurale Communicatie Technologie (CNCT), een P41 Resource Center gefinancierd door het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) en ondersteund door de National Institutes of Health (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Anesthetic may vary per laboratory / institution) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | 10 mL vial |
| Surgery: | |||
| Needle tip, 27 GA x 1.25" | Materiel Services | 25251 | |
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 1 large hemostat forceps - curved or straight (~19 cm) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
| 2 standard hemostat forceps - straight serrated (14 cm) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 1 modified hemostat (with 15-gauge hole filed through the tip) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 15-gauge blunt or olive-tipped needle (perfusion needle) | Fisnar | 5601137 | |
| Perfusion: | |||
| HyPerfusion system or equivalent | |||
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| 4% Paraformaldehyde in 0.1 M Phosphate Buffer, pH 7.4 | |||
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Crushed ice | |||
| Water bath (37 °C) | |||
| Timer | |||
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (~12 cm) | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Medium curved or straight rongeurs (14-16 cm) or skull bone removal pliers | Fine Science Tools | 16020-14 | |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml glass vial | |||
| 40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) with sodium azide (90mg/l) | |||
References
- Cinar, O., Semiz, O., Can, A. A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections. Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).
- Fritz, M., Rinaldi, G. Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).
- Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats. Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).
- Jacobowitz, D. M. Removal of discrete fresh regions of rat brain. Brain Res. 80, 111-115 (1974).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).
- Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).
- Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration. J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).
- Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).
- Ramos-Vara, J. A. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues. J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).
- Walker, W. F. Vertebrate dissection. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).
- Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. J. Neurotrauma. Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).
