Summary
Här beskriver vi en låg kostnad, snabb, kontrollerad och enhetlig fixering proceduren med 4% paraformaldehyd perfusion via kärlsystemet: genom hjärtat av råttan för att få bästa möjliga bevarande av hjärnan.
Abstract
Målet med fixeringen är att snabbt och jämnt bevara vävnad i ett liv-liknande tillstånd. Medan placera vävnaden direkt i fixativ fungerar bra för små bitar av vävnad, större exemplar som den intakta hjärnan utgör ett problem för nedsänkning fixering eftersom fixativet inte når alla regioner av vävnaden i samma takt 5,7. Ofta, ändras som svar på hypoxi börja innan vävnaden kan bevaras 12. Fördelen med direkt perfusion fixativ genom cirkulationssystemet är att den kemiska snabbt kan nå alla hörn av organismen med hjälp av naturliga vaskulära nätverket. För att utnyttja det cirkulatoriska systemet mest effektivt, måste försiktighet iakttas för att matcha fysiologiska tryck 3. Det är viktigt att notera att fysiologiska tryck är beroende av den art som används. Tekniker för perfusion fixering varierar beroende på vävnaden som skall fastställas och hur vävnaden kommer att behandlas efter fixering. I den här videonBeskriver vi en låg kostnad, snabb, kontrollerad och enhetlig fixering proceduren med 4% paraformaldehyd perfusion via kärlsystemet: genom hjärtat av råttan för att få bästa möjliga bevarandet av hjärnan för immunohistokemi. Den huvudsakliga fördelen med denna teknik (vs tyngdkraften system) är att det cirkulatoriska systemet utnyttjas mest effektivt.
Protocol
1. Framställ Fixativ
(Se tabell fixativ och buffertar.)
2. Framställ Perfusion Buffertar
(Se tabell fixativ och buffertar.)
3. Förbered Apparater och anestesi
- Med användning av vattenbad, varm perfusionsbuffert till 37 ° C. Plats utloppsventil i en bägare fylld med buffert. Fyll en 50 ml spruta med buffert och fäster fixativ slang. Spola slangen upprepade gånger genom att utvisa och återkalla buffert.
- Rensa linje med buffert tills samtliga luftbubblor i slangen elimineras. Det är avgörande för framgången för en perfusion inte att ha luftbubblor i någon av raderna.
- Avlägsna sprutan och ansluter 4% paraformaldehyd fixativ (rumstemperatur) behållare. För att undvika luftbubblor vid slangänden, pressa röret medan positionering av röret in i behållaren, så att en droppe av buffert skjuter ut från änden to kontakta vätskan ytan inuti behållaren.
- Stänga utloppsporten (nåländen). Vrid buffert ventil (blå) i samma position som fixativ ventilen (vit). Detta kommer att tillåta flöde från bufferten ledningar.
- Öppna utloppsporten och upprepar steg A1 till A3 för att fylla bufferten linjen. Efter alla luftbubblorna elimineras nära utloppet, ta bort sprutan och anslut bufferten behållaren noga med att inte införa luftbubblor i slangen.
- Testsystem för förmågan att hålla trycket genom att pumpa blub gummit manometer. Det finns normalt ett visst motstånd på grund av kompressionen av luft i systemet.
- Setup kirurgi verktyg för att enkelt tillgång. Fylla perfusion nål med buffert för att eliminera möjligheten av luftbubblor.
- Före kirurgi, är en ketamin / xylazin-blandning (upp till 80 mg / kg kroppsvikt ketamin och 10 mg / kg kroppsvikt xylazin) administrerades via intraperitoneal injektion (27 gauge nål och 1 cc spruta). Ytterligare administrering av anestetikum kommer att utföras som nödvändigt under loppet av varje operation för att bibehålla en kirurgisk anestesidjup.
4. Perfusion kirurgi
- När djuret har nått en kirurgisk plan av anestesi, placera den på grunt brickan fylld med krossad is. (Använd toe nypa-svar för att bestämma djupet av anestesi. Djur måste vara svara innan du fortsätter).
- Gör en 5-6 cm i sidled snitt genom utrustningen och bukväggen precis under bröstkorgen. Försiktigt separera levern från membranet.
- Göra en liten incision i membranet med användning av de krökta, trubbiga sax. Positionen och trycket med fingret kan hjälpa i förmågan att skära membranet.
- Fortsätta membranet snitt längs hela längden av bröstkorgen för att exponera den pleurala kaviteten.
- Placera böjda, trubbiga saxen längs ena sidan av revbenen, försiktigt undan lungorna, och göra en Cut genom bröstkorgen upp till nyckelbenet. Göra en liknande snitt på den kontralaterala sidan.
- Lyft bröstbenet bort noggrant trimma alla vävnader att ansluta den till hjärtat. Kläm spetsen av bröstbenet med hemostat och placera hemostat över huvudet. När den görs rätt, lyfter bräss bort från hjärtat tillsammans med bröstbenet, vilket ger en tydlig bild av de stora fartygen.
- Gör ett litet snitt i den bakre änden av vänster kammare med iris sax.
Klicka här för att visa en större bild .
- Pass ett 15-gauge trubbig eller oliv-spets perfusion nål genom snittet kammaren i aorta ascendens. Spetsen ska vara synliga genom väggen i aorta, och bör inte nå aortabågen där brachial och halspulsåder isär.
- Använd en hemostat att klämma hjärtat, säkrar detta nålen och förhindrar läckage. Om så önskas kan den modifierade hemostat användas för att klämma aortan runt nålspetsen (dessa peanger kvar på plats tills dissektion börjar, men är utelämnade från framtida illustrationer för tydlighetens skull).
- Slutligen gör ett snitt i djurets högra förmak med iris sax för att skapa så stor utlopp som möjligt utan att skada fallande aorta. Vid denna punkt djuret är klar att perfusion.
5. Perfusion
- Öppna och fäst utloppet till nålen basen noga med att inte införa några luftbubblor.
- Pumpa upp manometer lampan till ett tryck på 80 mm Hg snabbt och jämnt. Bibehålla detta tryck i hela bufferten infusionsperioden. Starta timern.
- Justera nålen vinkel. Vinkeln på nålen är avgörande för att uppnå en maximal flödeshastighet (observera flödet förändras med vinkel justering).
- Växla buffER ventil (blå) när bufferten är nästan klar (200 ml). Vätskan ska vara igång klar. Clearing av levern är en indikator på en god perfusion. Levern bör vara uppenbart vid denna punkt. Ange tid för din bokföring.
- Fixering skalv bör iakttas inom några sekunder, vilket bör anses vara det äkta tid fixering. Ange tid för din bokföring.
- Trycket gradvis kan öka upp till maximalt 130 mm Hg 2 för att bibehålla en jämn flöde.
- Stänga utloppsventilen när fixativ är nästan avslutad. Ange sluttid för din bokföring.
- Råttan ska vara hård i detta skede.
- Den använda paraformaldehyd måste samlas in och lagras för omhändertagande enligt reglerna i din institution.
6. Dissektion 4,11
- Ta bort huvudet med hjälp av en sax.
- Göra en mittlinjesincision längs integument från halsen till näsan och exponeraskalle.
- Trimma bort de återstående halsen muskeln så att skallbasen exponeras, ta bort eventuella muskler med sax eller gougetänger.
- Placera den vassa änden av ett par av iris sax till nackhålet på ena sidan, försiktigt skjuta de sax längs den inre ytan av skallen.
- Därefter gör ett snitt som sträcker sig till den distala kanten av den bakre skallytan. Gör en identisk snitt på den kontralaterala sidan. Använd gougetänger att rensa bort skallen runt lillhjärnan.
- Skjut försiktigt saxen längs den inre ytan av skallen när spetsen rör sig från den dorsala distala bakre hörnet för att den distala främre kanten av skallen, lyfta upp bladet som du skär för att förhindra skador på hjärnan. Upprepa motsatta sidan.
- Användning gougetänger skal den dorsala ytan av skallen bort från hjärnan. Trimma bort sidorna av skallen med gougetänger också.
- Med hjälp av en spatel, kapa lukt glödlampor och nervös anslutningartioner längs den ventrala ytan av hjärnan.
- Försiktigt reta hjärnan bort från huvudet, trimma alla dura som fortfarande förbinder hjärnan till skallen med iris sax.
- Ta bort hjärnan och placera den i en flaska med fixativ som innehåller vätska minst 10 gånger volymen av hjärnan själv. Snurra flaskan då och då.
7. Post-fixering och förvaring
- Hålla hjärnan i fixativ under 24 timmar vid 4 ° C, virvling då och då.
- Efter 24 timmar, tvätta hjärnan med fosfatbuffrad saltlösning genom utbyte av media 3 gånger och virvling varje gång.
- Hjärnorna kan sedan lagras i fosfatbuffrad saltlösning eller HBHS med natriumazid och hölls vid 4 ° C.
8. Representativa resultat
En första indikator på framgång perfusionen är clearing av extremiteter såsom näsa, öron och tassar och inre organ som tymus och lever (IHC World).Gross inspektion av hjärnan avslöjar tomrummet blodkärl av blod (vit till svagt gul utseende). Detta kommer också sant i vävnadssnitt Destine för färgning och immunhistokemi. Den slutliga indikator resultatet av perfusionen är tillståndet av ultrastrukturen i vävnaden. 1,6,7,8
| Framställ Fixativ: |
| Förbered 8% Paraformaldehyd lager |
|
| Framställa 0,2 M natriumfosfatbuffert, pH 7,4 |
|
| Förbered 4% Paraformaldehyd Fixative |
|
| Förbered Perfusion och buffertar lagring: |
| Framställ Fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,4 |
|
| HEPES-buffrad Hanks lösning (HBHS) med natriumazid pH 7,4 |
|
Tabell 1. Framställning av fixativ och buffertar.
Figur 1.
Figur 2. Beredning av perfusionsapparaten I. Börja med fixativ linjen. Spola slangen av luftbubblor och fyll med buffert genom att snabbt utvisa och återkalla buffert in i sprutan och genom linjen. Stäng ventilen på nåländen av. Placera fixativ linje i fixativ flaskan utan att införa luftbubblor.
Figur 3. Beredning av perfusionsapparat II. 1. Öppna ventilen på nålspetsen. 2. Vrid buffert ventil (blå) i läge för flöde. 3. Spola slangen av luftbubblor och fyll med buffert genom att snabbt utvisa och återkalla buffert med sprutan. 4. Stäng ventilen på nålspetsen. Placera slang in i bufferten flaskan. Provtryck för att säkerställa att systemet tätas riktigtly genom att pumpa upp manometern lampan och titta på mätaren. Anordningen är nu klar för perfusion.
Figur 4. Perfusionsapparat i läge för bufferten leverans.
Figur 5. Perfusion Kirurgi I. a) Gör en lateral incision genom utrustningen och bukväggen. b) Gör en incision i membranet och skär igenom membranet exponera hjärtat. Göra parallella snitt på vardera sidan av ribborna upp till nyckelbenet. c) spänner fast bröstbensspets med hemostat och placera det blodstillande medlet över huvudet.
Figur 6. Perfusion Kirurgi II. a) Dra perfusion nålen genom snittet kammaren i aorta ascendens. b) Säkraperfusion nålen Använd en uppsättning peanger att klämma hjärtat. En andra uppsättning av en modifierad hemostat kan också användas för att klämma aortan cirka nålspetsen till förhindrar läckage. Använda iris sax gör ett litet snitt i den bakre änden av vänster kammare.
Figur 7. Perfusion med buffert Pump manometern lampan för att skapa tryck i ledningen. Öppna ventilen (1) och fäst till nålen navet. Det är kritiskt att kontrollera så att inga luftbubblor tillförs. Pumpa upp manometer lampan till ett tryck på 80 mm Hg och bibehålla detta tryck under hela bufferten infusionsperioden.
Figur 8. Perfusion med fixermedel När bufferten är nästan klar (200 ml) byta buffert ventilen (1) för att tillåta fixativ att flöda. Trycket kan gradvis ökas upp till enmax 130 mm Hg.
Figur 9. Dissection I. a) avlägsna huvudet hjälp av ett par sax. b) göra ett snitt i huden längs mittlinjen från halsen till näsan och exponera skallen. c) trimma bort den återstående halsmuskeln så att basen av skallen är exponerad. Håll huvudet så att den stora öppningen i kraniet ytan (foramen magnum) är tillgänglig. Försiktigt in den vassa änden av ett par iris sax i foramen magnum och gör ett snitt. Upprepa samma manöver för den kontralaterala sidan. Använd gougetänger att rensa bort skallen runt lillhjärnan.
Figur 10. Dissektion II. a) Skjut försiktigt saxen längs den inre ytan av skallen. Lyft upp spetsen som du skär för att förhindra skador på hjärnan. Upprepa samma sak förmotsatta sidan. Använda gougetänger skal skallen bort från hjärnan. b) illustration med skallen bort och hjärnan utsätts för. c) använder en spatel för att avskilja lukt lökar och anslutningar nerv på den mest främre läge hjärnan. Noggrant styra spatelspets längs undersidan av hjärnan för att avskilja anslutningar för att underlätta borttagning. Ta bort hjärnan och placera den i en flaska med fixativ.
Discussion
Ytterligare anmärkningar för en lyckad operation:
- När membranet bryts, före snabbt hypoxi och hyperkapni kommer att inleda irreversibla fysiologiska förändringar som kan förbrylla efterföljande analys.
- När nålen är insatt och fastklämd på plats, kommer den kvarvarande trycket tryck blod till basen av nålen (flashback). I själva verket kan större djur utvisa kraftigt blod. Det är kritiskt att blod åtminstone når basen av nålen för att undvika att införa luftbubblor som kommer att utgöra ett hinder för att fullborda perfusion. Om ingen blod observeras vid nålen basen, ta ut nålen och fyll på med buffert genom att fästa den till utloppet av perfusionen riggen. När bufferten har körts genom spetsen, kan nålen återinföras in i hjärtat.
- Korrekt placering av nålen inuti aortan är kritisk, bör det inte nå så långt som till aortabågen.
- Om flera perfusioner sker det inte är nödvändigt to inställningar från början varje gång. Användaren måste ha tillräcklig mängd för både buffert och fixativet i varje flaska (200 ml djur / lösning). Flaskorna kan också fyllas på vid behov. Den viktigaste aspekten att tänka på är att spola ut perfusionen linje som går från setup för att djuret (output ventil). Efter fullbordandet av en perfusion, kommer denna linje har 4% paraformaldehyd i den. Avlägsna röret från bufferten flaskan och använda en 50 ml spruta fylld med vatten för att spola ut fixativ. Se till att utloppsventilen är placerad i en avfallsinsamling bägare för korrekt bortskaffande av paraformaldehyd. Upprepa detta tre gånger. Påfyllning med buffert med användning av samma metod som visas i 2,3.
- Denna metod för fixering är mycket anpassningsbar med förmågan att ändra både buffert och fästande andra fixeringsmedel (som de som används för EM) enligt kraven i försöket.
- Systemet är också ofta används för extraktion av levande vävnad. För dettaProcessen använder man helt enkelt leverans av endast buffert (bufferten flaskan medan den fortfarande fäst till hela systemet placeras i ett is hink och fixativet flaskan är inställt lika tom men förseglat). Detta säkerställer en kall buffert perfusion vid den optimala trycket. Härifrån kan systemet anpassas till infusion av fixeras färgämnen antingen lägga färgen direkt till bufferten (om mängden är inte en fråga) eller använd en spruta med en minimal mängd buffert / färgämneslösning mellan bufferten - fixativ steg.
- I fallet med vaskulär gjutning, är det tryckövervakande buffert steg avgörande men på grund av viskositeten och stelning natur gjutlösningen antingen en 50 ml spruta måste användas för direkt leverans eller en engångs sekundär bindning till anordningen (slang, ventil och hålla container) gjorde att samverka med det nuvarande systemet ska användas. Våra laboratoriernas vaskulär gjutning föregick konstruktion och tillverkning av perfusionen apparaten. Därför kan vi inte ståt att tryckmätningarna blir en noggrann mätning vid avgivningsstället. Numren kan behöva justeras för att uppnå framgångsrik leverans av viskösa fluider.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Centrum för Neural kommunikationsteknik (CNCT), en P41 Resource Center som finansieras av National Institute of Biomedical Imaging och bioteknik (NIBIB, P41 EB002030) och stöds av National Institutes of Health (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Anesthetic may vary per laboratory / institution) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | 10 mL vial |
| Surgery: | |||
| Needle tip, 27 GA x 1.25" | Materiel Services | 25251 | |
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 1 large hemostat forceps - curved or straight (~19 cm) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
| 2 standard hemostat forceps - straight serrated (14 cm) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 1 modified hemostat (with 15-gauge hole filed through the tip) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 15-gauge blunt or olive-tipped needle (perfusion needle) | Fisnar | 5601137 | |
| Perfusion: | |||
| HyPerfusion system or equivalent | |||
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| 4% Paraformaldehyde in 0.1 M Phosphate Buffer, pH 7.4 | |||
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Crushed ice | |||
| Water bath (37 °C) | |||
| Timer | |||
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (~12 cm) | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Medium curved or straight rongeurs (14-16 cm) or skull bone removal pliers | Fine Science Tools | 16020-14 | |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml glass vial | |||
| 40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) with sodium azide (90mg/l) | |||
References
- Cinar, O., Semiz, O., Can, A. A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections. Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).
- Fritz, M., Rinaldi, G. Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).
- Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats. Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).
- Jacobowitz, D. M. Removal of discrete fresh regions of rat brain. Brain Res. 80, 111-115 (1974).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).
- Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).
- Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration. J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).
- Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).
- Ramos-Vara, J. A. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues. J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).
- Walker, W. F. Vertebrate dissection. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).
- Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. J. Neurotrauma. Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).
