Summary
在这里，我们描述了一个低成本，快速，控制和统一的固定程序，用4％多聚甲醛灌注，通过血管系统：通过对大鼠的心脏，大脑获得尽可能最好的保存。
Abstract
固定的目标是迅速且均匀地保持在生命的样态组织。而直接放在组织在固定液工程小块组织，像完整的大脑，造成浸泡固定的问题更大的标本的固定液，因为没有达到该组织的所有地区在同一速率5,7。通常，在缺氧的变化开始前组织可保留12。直接通过循环系统灌注固定液的优点是化学能迅速到达使用天然的血管网的有机体的每一个角落。以最有效地利用循环系统，必须采取符合生理压力3。重要的是要注意，生理压力是依赖于所使用的物种。灌注固定的技术取决于被固定的组织，该组织将如何处理录制后。在这个视频我们描述了一个低成本，快速，控制和统一的固定程序，用4％多聚甲醛灌注，通过血管系统：通过对大鼠的心脏，以取得最好的免疫组织化学脑可能保存。这项技术的主要优点（与地心吸力系统）是最有效地利用循环系统。
Protocol
1。准备固定液
（请参阅表定影液和缓冲器 ）。
2。准备灌注缓冲器
（请参阅表定影液和缓冲器 ）。
3。准备仪器和麻醉
- 使用的水洗澡，温暖灌注缓冲至37°C。充满缓冲液的烧杯放置在出口阀。一个缓冲区填充50毫升注射器和重视固定液油管。冲洗管道多次被驱逐和撤出缓冲区。
- 清除缓冲区的行，直到所有气泡在油管被淘汰。这是不能有气泡中的任何行灌注成功的关键。
- 取下注射器和连接的4％多聚甲醛固定液（室温）容器。在管端，以避免气泡，同时定位到容器管，挤压管，所以，从笔底下降缓冲区突出O触点的容器内的液体表面。
- 关闭出油口（针的末端）。将缓冲阀（蓝色）作为固定液阀的（白）相同的位置。这将允许只从缓冲区行流。
- 打开出气口，通过A1 A3填充缓冲区行重复步骤。所有的气泡被淘汰后关闭出气口，取出注射器和连接的缓冲容器，照顾油管引入气泡。
- 测试系统的能力举行抽水橡胶压力计blub的压力。通常是由于空气压缩系统中的一些阻力。
- 设置在交通便利的秩序的手术工具。填充缓冲区灌注针，以消除气泡的可能性。
- 手术前，氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物（高达80毫克/公斤体重氯胺酮和10毫克/公斤体重甲苯噻嗪）管理，通过腹腔注射（27号针头注射器和1毫升）。必要时将执行麻醉额外的管理，在每个操作的过程中保持麻醉的手术平面。
4。灌注术
- 一旦动物已经达到了手术的麻醉平面，把它洋溢着碎冰的浅盘上。 （用脚趾捏反应的方法来判断麻醉深度。动物必须是反应迟钝，然后再继续）。
- 通过体壁和腹壁下方的肋骨外侧切口5-6厘米。仔细分离膈肌肝脏。
- 在使用隔膜弯曲，钝的剪刀做一个小切口。可以帮助你的手指的位置和压力的能力，以减少隔膜。
- 继续沿整个长度的肋骨暴露胸腔膈肌切口。
- 将沿肋骨一侧弯曲，钝的剪刀，仔细取代肺部，使某铜通过左肋吨上涨至锁骨。对侧上作出类似的削减。
- 起重胸骨而去，精心修剪的任何组织，将它连接到心脏。胸骨与止血钳尖端，并将其放置在头上止血。如果处理得当，胸腺升降机远离心脏与胸骨，提供了一个明确的看法的主要血管。
- 做一个小切口，使用虹膜剪左心室后端。
点击这里查看大图 。
- 截止到升主动脉心室通过15号橄榄钝或尖灌注针。小费应该是通过主动脉壁可见，不应该达到的主动脉弓，臂丛和颈动脉分歧。
- 使用止血钳，夹住心脏，这针固定，防止泄漏。如果需要，修改后的止血，可用于打击针尖周围的主动脉（这些止血留在原地，直到解剖开始，但是从未来的清晰度插图省略）。
- 最后，使动物的右心房，用虹膜剪刀创造尽可能大出口不损害降主动脉切口。在这一点上的动物是准备灌注。
5。灌注
- 打开和出气口连接针座照顾，不引入任何气泡。
- 泵的压力表灯泡到80毫米汞柱的压力，快速及均匀。维护此整个缓冲区输液期间的压力。启动定时器。
- 调整针头角。针的角度是至关重要的，以实现最大流量（注意流量的变化与角度调整）。
- 开关的buffER阀（蓝色）（200毫升），一旦缓冲区接近完成。流体应清楚。肝脏的结算是一个良好的灌注指标。肝脏应该清楚这一点。您的记录，显示时间。
- 在几秒钟内，应遵守固定震颤，这应该被视为真正的固定时间。您的记录，显示时间。
- 压力可以逐步提高到最高130毫米汞柱2，保持稳定的流量。
- 关闭出口阀，一旦接近完成固定液。您的记录显示结束时间。
- 在这个阶段应该是僵硬的大鼠。
- 使用多聚甲醛，必须收集和储存处置根据贵机构的规定。
6。解剖4,11
- 删除的头，用一把剪刀。
- 使从颈部到鼻子的包膜沿中线切口和暴露头骨。
- 剪掉剩余的颈部肌肉，使颅底暴露，除去残留的肌肉，用剪刀或rongeurs。
- 放置到一侧的枕骨大孔的虹膜剪刀对尖底，仔细沿着头骨的内表面滑动的剪刀。
- 接下来，延伸到后头骨表面的远端边缘切割。使对侧相同截。使用rongeurs扫清小脑周围的头骨。
- 小心地将沿颅骨内表面剪刀的尖背远端后角头骨远端前缘，起重在刀刃上，你切割，以防止损害大脑。对面的重复。
- 远离大脑头骨背表面剥离rongeurs。修剪掉的头骨两侧使用rongeurs以及。
- 用铲，断绝嗅球和神经连接tions沿大脑的腹面。
- 轻轻挑逗的大脑远离头部，修剪任何硬脑膜仍然连接大脑的头骨，用虹膜剪刀。
- 取出大脑，并将其放置在一小瓶至少10倍体积的大脑本身的固定液含流体。偶尔漩涡小瓶。
7。后固定及储存设备
- 保持大脑中固定液24小时在4°C，偶尔纷飞。
- 24小时后，用大脑磷酸盐缓冲生理盐水交换媒体的3倍和纷飞每次。
- 大脑可以储存在磷酸盐缓冲生理盐水或HBHS叠氮化钠，并保存在4°C。
8。代表结果
灌注成功的一个初步的指标是四肢，如鼻子，耳朵，爪子和内脏器官，如胸腺，肝化（IHC世界）结算。总值的检查结果显示大脑的血液血管（白色至淡黄色的外观）无效。这也将是真正在组织切片染色和免疫组化注定。灌注的结果最终指标是在组织超微结构的条件。1,6,7,8
| 准备固定液： |
| 准备8％多聚甲醛股票 |
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| 准备0.2 M磷酸钠缓冲液，pH值7.4 |
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| 准备4％多聚甲醛固定液 |
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| 准备灌注和存储缓冲器： |
| 准备磷酸盐缓冲生理盐水，pH值7.4 |
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| 肝素钠缓冲Hanks液（HBHS与叠氮化钠的pH值7.4） |
|
表1。制备定影液和缓冲器。
图1。
图2。制备灌流装置一开始与固定液行。气泡冲洗管，填补迅速驱逐出境，并撤回到注射器，并通过行的缓冲带缓冲。关闭阀针的末端。没有引入气泡，放入固定液瓶的的固定液线。
图3。灌流装置制备。 1。打开阀针的末端。 2。旋转缓冲区阀（蓝色）定位流。 3。冲洗管气泡迅速驱逐和注射器撤出缓冲区和缓冲区填写。 4。关闭阀针端。缓冲瓶放入油管。压力测试，以确保系统正确的密封LY所抽的的压力表灯泡和看压力表。该仪器是现在的灌注过程中的准备。
图4。灌注装置在缓冲区交货的位置。
图5。灌注外科一，一）通过体壁和腹壁外侧切口。 b）使在膜片的切口，暴露心脏隔膜的跨越。使锁骨平行削减肋骨两侧。 C）胸骨与止血钳尖端，并将其放置在头上止血。
图6。灌注外科二。一）截止到升主动脉心室穿过灌注针。 B）固定灌注针使用一组止血钳的心脏。第二套的修改后的止血，也可用于打击主动脉周围，以防止泄漏的针尖。用虹膜剪刀作一小切口到左心室后端。
图7。与缓冲区灌注泵的压力表灯泡创建线的压力。打开阀门（1）和附加针枢纽。这是关键，以确保无气泡介绍。泵压力计灯泡，到80毫米汞柱的压力，并保持这种整个缓冲区输液期间的压力。
图8。一旦缓冲固定液灌注几乎完成（200毫升）切换缓冲阀（1）允许流动的固定液。压力可以逐步上升到最大的130毫米汞柱。
图9。解剖一）使用了一双剪刀除去头。 b）使沿中线从颈部到鼻子的皮肤切口，暴露颅骨。 C）剪掉剩余的颈部肌肉，使颅底暴露。按住头大开幕（枕骨大孔）在颅骨表面，使访问。小心地插入枕骨大孔的一对虹膜剪刀的尖底，并作出削减。对侧重复同样的动作。使用rongeurs扫清小脑周围的头骨。
图10。夹层。一）仔细沿着头骨的内表面滑动的剪刀。提起小费，你切割，以防止损害大脑。重复相同的对面。使用剥离颅骨rongeurs远离大脑。 B）插图的头骨和大脑暴露出来。 c）用锅铲在最前的位置大脑的嗅球和神经连接切断。小心地铲尖沿易于删除切断连接大脑底面。取出大脑，并将其放置在固定液小瓶。
Discussion
手术成功的其他注意事项：
- 一旦违反隔膜，先迅速缺氧和高碳酸血症会引发不可逆转的生理变化，可能会混淆后续分析。
- 当针插入夹紧到位，剩余的压力将推动血针（闪回）的基础。事实上，较大的动物可能会大力驱逐血液。这是至关重要的血液至少达到针的基础，以避免引入气泡，将提出一个障碍，完成灌注。如果没有血针基地观察，与缓冲区中删除附加到灌注钻机出口端口的针和笔芯。一旦缓冲区已通过尖端运行，针可以重新插入到心脏。
- 妥善安置主动脉内针是至关重要的，它不应该达到尽可能的主动脉弓。
- 如果多个灌注正在发生，它是没有必要的ţ从一开始每次O设置。用户需要有适当量的缓冲区，并在每个瓶子的固定液（200mls动物/解决方案）。如果需要的话，瓶也可以装填。最重要的方面，要考虑的是冲洗灌注线运行，从动物的设置（输出阀）。灌注完成后，这条线将在4％多聚甲醛。从缓冲瓶油管，并用50毫升注射器装满水冲洗出来的固定液。确保在一个多聚甲醛的正确处置废物收集烧杯放在出口阀。重复了三次。笔芯用同样的方法在2.3所示的缓冲。
- 这种固定方法是高度适应的能力，改变缓冲区和固定其他固定剂（如电磁），根据实验的要求。
- 该系统还经常被用于提取活组织。对于这个过程只需使用提供缓冲（缓冲瓶，同时还连接到整个系统被放置在一个冰桶和固定液的瓶子是空，但密封的设置）。这保证了在最佳压力冷缓冲灌注。从这里，该系统可以适应要么直接加入染料缓冲（如果数量是不是一个问题），或使用少量之间的缓冲区的缓冲区/染料溶液的注射器输液可修复染料 - 固定液的一步。
- 在血管铸型的情况下，压力监测缓冲区一步是关键，然而由于铸造溶液的粘度和巩固性质无论是50ml注射器必须直接交付或一次性的二次附件仪器（油管，阀门和控股用于容器）与当前的系统接口。我们实验室的血管铸型之前灌流装置的设计和制造。因此，我们可以没有意法半导体吃，压力测量，将在交货地点的精确测量。的数字可能要进行调整，以实现粘性流体的成功交付。
Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由神经通信技术中心（CNCT），P41资源中心，由国家生物医学成像和生物工程研究所（NIBIB，P41 EB002030）和国立卫生研究院（NIH）支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Anesthetic may vary per laboratory / institution) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | 10 mL vial |
| Surgery: | |||
| Needle tip, 27 GA x 1.25" | Materiel Services | 25251 | |
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 1 large hemostat forceps - curved or straight (~19 cm) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
| 2 standard hemostat forceps - straight serrated (14 cm) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 1 modified hemostat (with 15-gauge hole filed through the tip) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 15-gauge blunt or olive-tipped needle (perfusion needle) | Fisnar | 5601137 | |
| Perfusion: | |||
| HyPerfusion system or equivalent | |||
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| 4% Paraformaldehyde in 0.1 M Phosphate Buffer, pH 7.4 | |||
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Crushed ice | |||
| Water bath (37 °C) | |||
| Timer | |||
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (~12 cm) | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Medium curved or straight rongeurs (14-16 cm) or skull bone removal pliers | Fine Science Tools | 16020-14 | |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml glass vial | |||
| 40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) with sodium azide (90mg/l) | |||
References
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