Summary
כאן אנו מתארים בעלות נמוכה, בהליך מהיר, קיבעון מבוקר ואחיד באמצעות paraformaldehyde 4% perfused דרך מערכת כלי הדם: דרך הלב של חולדה כדי לקבל את השמירה הטובה ביותר של המוח.
Abstract
המטרה של קיבעון היא במהירות אחידה לשמר רקמות במצב כמו חיים. תוך שימת רקמות ישירות בעבודות מקבע היטב חתיכות קטנות של רקמות, דגימות גדולות יותר כמו המוח ללא שינוי מהווה בעיה עבור קיבעון טבילה משום מקבע לא מגיע בכל אזורי הרקמה באותו קצב 5,7. לעתים קרובות, שינויים בתגובה היפוקסיה להתחיל לפני רקמה ניתן לשמר 12. היתרון של המרוססת מקבע ישירות דרך מערכת הדם היא כימית יכול להגיע במהירות לכל פינה של האורגניזם באמצעות רשת כלי דם טבעי. על מנת לנצל את מחזור הדם בצורה היעילה ביותר, יש להקפיד להתאים לחצים פיזיולוגיים 3. חשוב לציין כי לחצים פיזיולוגיים תלויים המינים בשימוש. טכניקות קיבוע זלוף משתנים בהתאם רקמות להיות קבוע וכיצד רקמות יעובדו קיבעון הבאה. זה וידאואנו מתארים בעלות נמוכה, בהליך מהיר, קיבעון מבוקר ואחיד באמצעות paraformaldehyde 4% perfused דרך מערכת כלי הדם: דרך הלב של חולדה כדי לקבל את השמירה הטובה ביותר של המוח עבור אימונוהיסטוכימיה. היתרון העיקרי של שיטה זו (לעומת כוח הכבידה-fed מערכות) היא מערכת הדם הוא מנוצל בצורה היעילה ביותר.
Protocol
1. הכן מקבע
(ראה מקבע שולחן Buffers).
2. הכן Buffers זלוף
(ראה מקבע שולחן Buffers).
3. להכין מנגנון הרדמה
- שימוש באמבט מים חמים זלוף חיץ עד 37 ° C. מוצא מקום השסתום בכוס מלאה למאגר. למלא מזרק 50 מ"ל עם חיץ ומתחברים צינורות מקבע. שטוף את צינור שוב ושוב על ידי גירוש ונסיגה המאגר.
- נקה בקנה אחד עם חיץ עד שכל בועות אוויר בצינור בוטלו. זה חיוני להצלחת זלוף לא לקבל בועות אוויר בכל הקווים.
- הסר את המזרק ולהתחבר מקבע paraformaldehyde 4% (בטמפרטורת החדר) מיכל. כדי למנוע בועות אוויר בסוף צינורות, לסחוט את הצינור תוך הצבת הצינור לתוך מיכל כך ירידה של בולט חיץ בין לא הסוףהו ליצור קשר עם פני הנוזל בתוך המיכל.
- לסגור את נמל היציאה (סוף מחט). הפעל שסתום חיץ (כחול) לתפקיד כמו שסתום מקבע (לבן). זה יאפשר זרימת מהקו חיץ בלבד.
- פתח את נמל היציאה וחזור על שלב A1 עד A3 למילוי שורת חיץ. אחרי כל בועות האוויר בוטלו סמוך לנמל המוצא, הסר את המזרק ולחבר את מיכל חיץ, נזהר שלא להכניס בועות אוויר לתוך צינורות.
- בדיקת המערכת על היכולת להחזיק לחץ של שאיבת ליילל מד גומי. יש בדרך כלל התנגדות מסוימת עקב דחיסה של אוויר במערכת.
- תוכנית ההתקנה של כלי ניתוח על מנת קלה של גישה. מלא מחט זלוף עם חיץ כדי לשלול את האפשרות של בועות אוויר.
- לפני הניתוח, תערובת קטמין / xylazine (עד 80 מ"ג / ק"ג משקל גוף קטמין ו - 10 מ"ג / ק"ג משקל גוף xylazine) ניתנת באמצעות זריקה intraperitoneal (27 מחט מד ו 1 מזרק סמ"ק). הממשל נוסף של הרדמה תבוצע לפי הצורך במהלך כל פעולה כדי לשמור על מטוס כירורגית של הרדמה.
4. זלוף כירורגיה
- לאחר החיה הגיע מטוס כירורגית של הרדמה, למקם אותו על מגש הרדוד מלאה קרח כתוש. (השתמשו בבוהן קמצוץ התגובה שיטה לקביעת עומק ההרדמה. בעלי חיים חייב שלא להגיב לפני שתמשיך).
- לעשות חתך לרוחב 5-6 ס"מ דרך integument ואת דופן הבטן ממש מתחת לכלוב הצלעות. להפריד בזהירות את הכבד מן הסרעפת.
- לעשות חתך קטן הסרעפת באמצעות מעוקלים, מספריים קהים. את המיקום ואת הלחץ של האצבע יכול לסייע היכולת לחתוך את הסרעפת.
- המשך החתך הסרעפת לאורך כל אורכו של כלוב הצלעות לחשוף את חלל פלאורלי.
- מניחים מעוקלים, מספריים קהים לאורך צד אחד של הצלעות, בזהירות לעקירתם הריאות, ולגרום מ"קלא באמצעות כלוב הצלעות עד עצם הבריח. לעשות חתך דומה בצד הנגדי.
- הרמת עצם החזה משם, בזהירות לקצץ בכל רקמת חיבור זה ללב. הצמד את קצה עצם החזה עם hemostat ומניחים hemostat על הראש. כאשר נעשה כראוי, התימוס מרים מן הלב יחד עם עצם החזה, מספקת תצוגה ברורה של הכלים העיקריים.
- לעשות חתך קטן לסוף האחורי של החדר השמאלי באמצעות מספריים איריס.
לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
- להעביר מחט 15-מד זלוף בוטה או זית שקצהו דרך החדר חתך לתוך אבי העורקים העולה. טיפ צריך להיות גלוי דרך הקיר של אבי העורקים, ולא צריך להגיע קשת אבי העורקים בו עורקי הזרוע ועל הראש לסטות.
- השתמש hemostat כדי לצבוט את הלב, זה שמחבר את המחט ומונע דליפה. אם תרצה, hemostat שונה ניתן להשתמש כדי לצבוט אבי העורקים סביב קצה המחט (hemostats אלה להישאר במקום עד לנתיחה מתחיל, אך הם הושמטו מן האיורים הבאים לבהירות).
- לבסוף, את החתך כדי אטריום הזכות של בעל החיים באמצעות מספריים איריס ליצור בגודל של שקע ככל האפשר מבלי לפגוע באבי העורקים היורד. בשלב זה בעל החיים הוא מוכן להיות perfused.
5. זלוף
- פתח ולצרף יציאת שקע לבסיס מחט נזהר שלא להציג את כל בועות האוויר.
- הגבר את הנורה מד הלחץ ללחץ של 80 מ"מ כספית במהירות & שווה. לשמור על לחץ לאורך כל התקופה עירוי חיץ. הפעל את שעון העצר.
- כוון את זווית המחט. הזווית של המחט הוא קריטי להשגת קצב זרימה מרבי (שימו לב לשינוי לזרום עם התאמת זווית).
- מעבר חובבאה שסתום (כחול) לאחר חיץ הוא כמעט סיים (200 מ"ל). הנוזלים צריכים לפעול ברור. ניקוי הכבד מהווה אינדיקטור זלוף טוב. הכבד צריך להיות ברור בשלב זה. ציין זמן לצורך תיעוד.
- רעידות קיבוע יש לשים לב תוך שניות, זה יש לשקול את הזמן האמיתי של קיבעון. ציין זמן לצורך תיעוד.
- הלחץ יכול להיות בהדרגה להגדיל עד למקסימום של 130 מ"מ כספית 2 כדי לשמור על קצב זרימה יציב.
- סגור את שסתום היציאה פעם מקבע נגמר כמעט. ציין סיום זמן לצורך תיעוד.
- החולדה צריכה להיות נוקשה בשלב זה.
- Paraformaldehyde שימוש יש לאסוף ולאחסן לסילוק על פי תקנות המוסד שלך.
6. דיסקציה 4,11
- הסר את הראש באמצעות מספריים.
- לעשות חתך לאורך קו האמצע integument מהצוואר אל פנים ולחשוףהגולגולת.
- חתוך את שרירי הצוואר הנותרים כך את בסיס הגולגולת חשוף, להסיר כל שריר שיורי באמצעות מספריים או rongeurs.
- מחברים את הקצה החד של זוג מספריים איריס אל מגנום foramen מצד אחד, בזהירות מחליק את המספריים על פני השטח הפנימי של הגולגולת.
- לאחר מכן, לבצע חתך המשתרע על הקצה הדיסטלי של פני הגולגולת האחורי. לעשות חתך זהה בצד הנגדי. השתמש rongeurs לפנות את הגולגולת סביב המוח הקטן.
- החלק בזהירות את המספריים על פני השטח הפנימי של הגולגולת כמו עצה נוסע מהפינה הגב האחורי דיסטלי לקצה הקדמי הדיסטלי של הגולגולת, מרימה על הלהב כפי שאתה חיתוך כדי למנוע נזק למוח. חזור על הפעולה עבור הצד השני.
- שימוש rongeurs לקלף פני השטח הגבי של הגולגולת מן המוח. לחתוך את הצדדים של הגולגולת באמצעות rongeurs גם כן.
- בעזרת מרית, לנתק את חוש הריח ואת נורות connec העצביםtions לאורך פני השטח הגחוני של המוח.
- בעדינות להקניט את המוח מן הראש, זמירה בכל דורה שעדיין מחבר את המוח לגולגולת באמצעות מספריים איריס.
- הסר את המוח ומניחים אותו בתוך בקבוק של נוזל המכיל מקבע לפחות 10x נפח המוח עצמו. מערבולת בקבוקון מדי פעם.
7. לאחר קיבוע & Storage
- שמור על המוח מקבע במשך 24 שעות ב 4 ° C, מתערבל מדי פעם.
- לאחר 24 שעות לשטוף את המוח עם פוספט שנאגרו מלוחים על ידי החלפת 3 פעמים מדיה מתערבל בכל פעם.
- המוח יכול להיות מאוחסן פוספט שנאגרו מלוחים או HBHS עם אזיד הנתרן ושמרה על 4 ° C.
8. נציג תוצאות
מדד הראשוני של ההצלחה של זלוף הוא הסליקה של הגפיים כמו האף, האוזניים, וכפות רגליים ואיברים פנימיים כגון בלוטת התימוס ועל הכבד (IHC העולם).בדיקה גסה של המוח מגלה את חלל כלי הדם של דם (לבן למראה צהוב בהיר). זה יהיה נכון גם בתוך סעיפים רקמות ליעד עבור מכתים ו אימונוהיסטוכימיה. מדד הסופי של תוצאות זלוף הוא מצב ultrastructure ברקמות. 1,6,7,8
| הכן מקבע: |
| להכין מלאי Paraformaldehyde 8% |
|
| להכין 0.2 סודיום פוספט מאגר M, pH 7.4 |
|
| הכן מקבע Paraformaldehyde 4% |
|
| הכן זלוף ו Buffers אחסון: |
| הכן בופר פוספט pH מלוחים, 7.4 |
|
| HEPES שנאגרו הנקס פתרון (HBHS) עם pH 7.4 נתרן אזיד |
|
טבלה 1. הכנת מקבע ו Buffers.
באיור 1.
איור 2. הכנת מנגנון זלוף א בגין עם קו מקבע. שטוף את צינורות של בועות אוויר וממלאים חיץ במהירות על ידי גירוש ונסיגה חיץ לתוך המזרק דרך הקו. לסגור את השסתום בקצה המחט מעל. מניחים את קו מקבע לבקבוק מקבע ללא החדרת בועות אוויר.
איור 3. הכנת מנגנון זלוף השנייה. 1. פתח את השסתום בקצה המחט. 2. הפעל שסתום חיץ (כחול) כדי למקם את הזרימה. 3. שטוף את צינורות של בועות אוויר וממלאים חיץ במהירות על ידי גירוש ונסיגה חיץ עם המזרק. 4. סגור את שסתום בקצה המחט. מניחים צינורות לתוך הבקבוק חיץ. מבחן לחץ על מנת לוודא את מערכת נחרץ הנכוןLY על ידי שאיבה את הנורה מד ומסתכל מד. המכשיר מוכן כעת הליך זלוף.
איור 4. Apparatus זלוף במצב למסירה המאגר.
איור 5. ניתוח זלוף א) לעשות חתך לרוחב דרך integument ואת דופן הבטן. ב) עושים חתך הסרעפת לחצות את הסרעפת חושפים את הלב. לבצע חתכים מקבילים משני צדי הצלעות עד עצם הבריח. ג) להדק את קצה עצם החזה עם hemostat ומניחים hemostat על הראש.
איור 6. ניתוח זלוף השנייה. א) להעביר את המחט דרך זלוף החדר חתך לתוך אבי העורקים העולה. ב) מאובטחמחט זלוף שימוש סט אחד של hemostats כדי לצבוט את הלב. קבוצה שנייה של hemostat שונה יכול לשמש גם כדי לצבוט אבי העורקים סביב קצה המחט מונע דליפה. באמצעות מספריים איריס לעשות חתך קטן לסוף האחורי של החדר השמאלי.
איור 7. זלוף עם משאבה למאגר הנורה מד ליצור לחץ על הקו. פתח את השסתום (1) ולצרף לרכזת את המחט. זה קריטי על מנת לוודא שאין בועות אוויר מוצגים. הגבר את הנורה מד הלחץ ללחץ של 80 מ"מ כספית בלחץ ולשמור על זה לאורך כל תקופת העירוי המאגר.
איור 8. זלוף עם מקבע לאחר חיץ הוא כמעט סיים (200 מ"ל) להחליף שסתום חיץ (1), כדי לאפשר מקבע לזרום. הלחץ יכול להיות גדל בהדרגה עדמרבי של 130 מ"מ כספית.
איור 9. א Dissection) להסיר את הראש בעזרת זוג מספריים. ב) לעשות חתך בעור לאורך קו האמצע של הצוואר אל פנים ולחשוף את הגולגולת. ג) לקצץ את שריר הצוואר הנותרים כך את בסיס הגולגולת חשוף. להחזיק את הראש, כך פתח גדול משטח הגולגולת (foramen magnum) נגיש. בזהירות להכניס את הקצה החד של זוג מספריים איריס אל מגנום foramen ולעשות חתך. חזור על התרגיל אותו לצד הנגדי. השתמש rongeurs לפנות את הגולגולת סביב המוח הקטן.
איור 10. Dissection השנייה. א) בזהירות להחליק את המספריים על פני השטח הפנימי של הגולגולת. להרים על קצה כמו שאתה חותך כדי למנוע נזק למוח. לחזור על אותו הדברבצד הנגדי. השתמש rongeurs קליפת הגולגולת מן המוח. ב) באיור עם הגולגולת שהוסר והמוח חשוף. ג) להשתמש במרית לנתק את נורות חוש הריח וחיבורי העצב במיקום הקדמי ביותר של המוח. בזהירות לכוון את קצה מרית לאורך החלק התחתון של המוח לנתק קשרים על מנת להקל על הסר. הסר את המוח ולמקם אותו בקבוקון של מקבע.
Discussion
הערות נוספות לניתוח מוצלח:
- לאחר הסרעפת פרוץ, להקדים במהירות היפוקסיה ו hypercapnia תיזום שינויים פיזיולוגיים בלתי הפיכים שעלולים הרודפים את הניתוח שלאחר מכן.
- כאשר המחט מוחדרת והידק במקום, הלחץ השיורי ידחוף הדם בבסיס המחט (פלאשבק). למעשה, בעלי חיים גדולים יותר עשויים במרץ לגרש דם. זה קריטי, כי דם לפחות להגיע אל הבסיס של המחט, כדי למנוע החדרת בועות אוויר אשר מכשול בפני להשלים זלוף. אם אין דם הוא ציין בבסיס המחט, הוצא את המחט ולמלא עם חיץ על ידי הצמדתו נמל יציאה של המתקן זלוף. לאחר חיץ הופעל באמצעות עצה, המחט אפשר לרחם אל לב.
- מיקום נכון של המחט בתוך אבי העורקים הוא קריטי, זה לא צריך להגיע עד קשת אבי העורקים.
- אם perfusions רבים מתקיימים אין צורך לאo הגדרת מההתחלה כל פעם. המשתמש צריך להיות נפח ראוי למאגר וגם מקבע בבקבוק אחד (200mls בעלי חיים / פתרון). הבקבוקים ניתן ומילא אם יש צורך. ההיבט החשוב ביותר שיש להביא בחשבון הוא בפלאשינג את הקו המחבר בין זלוף ההתקנה לבעל החיים (שסתום התפוקה). לאחר השלמת זלוף, קו זה יהיה paraformaldehyde 4% בה. הסר את צינורות מהבקבוק חיץ ולהשתמש מזרק 50 מ"ל מלא מים כדי לשטוף את מקבע. ודא שסתום היציאה ממוקם הגביע בזבוז אוסף לסילוק נאות של paraformaldehyde. חזור על כך שלוש פעמים. מילוי עם המאגר באמצעות אותה שיטה שמוצג 2.3.
- שיטה זו של קיבעון ניתנת להתאמה מאוד את היכולת לשנות גם חיץ fixatives מקבע אחרים (כגון אלו המשמשים EM) בהתאם לדרישות של הניסוי.
- המערכת הוא גם משמש לעתים קרובות למיצוי של רקמת חיים. לשם כך1 תהליך פשוט משתמש מסירת חיץ בלבד (בקבוק חיץ תוך עדיין מחוברת המערכת כולה מונחת בתוך דלי קרח בקבוק מקבע הוא כמו תוכנית ההתקנה ריק אבל סגור). זה מבטיח זלוף חיץ קר בלחץ האופטימלי. מכאן שהמערכת יכולה להיות מותאם עירוי של צבעים ניתן לתקן או על ידי הוספת צבע ישירות למאגר (אם הכמות היא לא בעיה) או להשתמש במזרק עם כמות מינימלית של חיץ / פתרון צבע בין למאגר - מקבע צעד.
- במקרה של יציקת כלי דם, ניטור לחץ צעד חיץ חיוני עם זאת בשל צמיגות וגיבוש אופי הפתרון הליהוק או מזרק 50 מ"ל יש להשתמש למסירה ישירה או משנית מצורף הפנויה למנגנון (שסתום בצינור והחזקה מיכל) עשה להתממשק עם המערכת הנוכחית לשמש. הליהוק של כלי הדם במעבדות שלנו שקדמה עיצוב וייצור של מכשירים זלוף. לכן אנחנו לא יכולים רחובאוכלים כי יש למדוד את הלחץ תהיה מדידה מדויקת באתר המסירה. המספרים אולי צריך להיות מותאם על מנת להשיג ההפצה המוצלחת של נוזלים צמיגה.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המרכז לטכנולוגיה ותקשורת עצבית (CNCT), מרכז P41 משאבים הממומן על ידי המכון הלאומי ביו הדמיה Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) ונתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Anesthetic may vary per laboratory / institution) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | 10 mL vial |
| Surgery: | |||
| Needle tip, 27 GA x 1.25" | Materiel Services | 25251 | |
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 1 large hemostat forceps - curved or straight (~19 cm) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
| 2 standard hemostat forceps - straight serrated (14 cm) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 1 modified hemostat (with 15-gauge hole filed through the tip) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 15-gauge blunt or olive-tipped needle (perfusion needle) | Fisnar | 5601137 | |
| Perfusion: | |||
| HyPerfusion system or equivalent | |||
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| 4% Paraformaldehyde in 0.1 M Phosphate Buffer, pH 7.4 | |||
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Crushed ice | |||
| Water bath (37 °C) | |||
| Timer | |||
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (~12 cm) | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Medium curved or straight rongeurs (14-16 cm) or skull bone removal pliers | Fine Science Tools | 16020-14 | |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml glass vial | |||
| 40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) with sodium azide (90mg/l) | |||
References
- Cinar, O., Semiz, O., Can, A. A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections. Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).
- Fritz, M., Rinaldi, G. Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).
- Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats. Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).
- Jacobowitz, D. M. Removal of discrete fresh regions of rat brain. Brain Res. 80, 111-115 (1974).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).
- Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).
- Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration. J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).
- Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).
- Ramos-Vara, J. A. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues. J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).
- Walker, W. F. Vertebrate dissection. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).
- Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. J. Neurotrauma. Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).
