Summary
Descrevemos aqui um baixo custo, rápida, o procedimento de fixação controlada e uniforme utilizando paraformaldeído a 4% perfundidos através do sistema vascular: através do coração do rato para se obter o melhor possível a preservação do cérebro.
Abstract
O objetivo da fixação é rápida e uniformemente preservar o tecido em um estado de vida semelhante. Embora a colocação do tecido directamente em obras fixadoras bem para pequenos pedaços de tecido, os espécimes maiores, como o cérebro intacto representar um problema para a fixação de imersão porque o fixador não atinge todas as regiões do tecido com a mesma taxa 5,7. Muitas vezes, muda em resposta a hipoxia começar antes do tecido pode ser preservada 12. A vantagem de perfusão fixador diretamente através do sistema circulatório é que a química pode rapidamente chegar a todos os cantos do organismo, utilizando a rede natural vascular. A fim de utilizar o sistema circulatório de forma mais eficaz, deve ser tomado cuidado para coincidir com as pressões fisiológicas 3. É importante notar que as pressões fisiológicas são dependentes das espécies utilizadas. Técnicas para a fixação de perfusão variam, dependendo do tecido a ser fixado e como o tecido será processado fixação seguinte. Neste vídeo, Nós descrevemos um baixo custo, rápida, o procedimento de fixação controlada e uniforme utilizando paraformaldeído a 4% perfundidos através do sistema vascular: através do coração do rato para se obter o melhor possível a preservação do cérebro para imuno-histoquímica. A principal vantagem desta técnica (vs. alimentado pela gravidade sistemas) é que o sistema circulatório é utilizado mais eficazmente.
Protocol
1. Preparar Fixador
(Veja tabela de Fixação e Buffers.)
2. Prepare Buffers de perfusão
(Veja tabela de Fixação e Buffers.)
3. Prepare Aparelhos e Anestesia
- Usando a água do banho, tampão de perfusão quente a 37 ° C. Válvula de saída lugar num copo cheio com tampão. Encha uma seringa de 50 ml com tampão e anexar ao tubo fixador. Lave tubulação repetidamente, expulsando e retirada do buffer.
- Limpar a linha com tampão até que todas as bolhas de ar na tubagem são eliminados. É essencial para o sucesso de um perfusão não ter bolhas de ar em qualquer das linhas.
- Retire a seringa e conecte o fixador paraformaldeído 4% (temperatura ambiente) do recipiente. Para evitar bolhas de ar na extremidade da tubagem, apertar o tubo, enquanto o posicionamento do tubo para dentro do recipiente de modo que uma gota de tampão sobressai a partir da extremidade tó contacto com a superfície do fluido no interior do recipiente.
- Feche o orifício de saída (extremidade da agulha). Coloque a válvula de tampão (azul) para a mesma posição que a válvula de fixador (branco). Isto irá permitir que o fluxo a partir da linha buffer apenas.
- Abra a porta de saída e repita o passo A1 a A3 para preencher a linha de buffer. Depois de todas as bolhas de ar são eliminados perto da porta de saída, remover a seringa e conectar o recipiente de buffer, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na tubulação.
- Sistema de teste para a capacidade de manter a pressão por bombagem do blub manómetro de borracha. Há normalmente alguma resistência, devido à compressão do ar no sistema.
- Instalação das Ferramentas de cirurgia para que de fácil acesso. Encha agulha de perfusão com tampão para eliminar a possibilidade de bolhas de ar.
- Antes da cirurgia, uma mistura de cetamina / xilazina (até 80 mg / kg de peso corporal de cetamina e 10 mg / kg de xilazina peso corporal) é administrado através de injecção intraperitoneal (27 agulha de calibre e uma seringa cc). Administração adicional de anestésico serão realizadas conforme necessário, durante o decurso de cada operação de manter um plano cirúrgico da anestesia.
4. Cirurgia de perfusão
- Uma vez que o animal tenha atingido um plano cirúrgico de anestesia, colocá-lo na bandeja rasa preenchido com gelo moído. (Use o dedo pitada resposta método para determinar a profundidade da anestesia. Animal deve ser responder antes de continuar).
- Faça uma incisão 5-6 cm lateral através do tegumento e da parede abdominal logo abaixo da caixa torácica. Cuidadosamente separar o fígado a partir do diafragma.
- Fazer uma pequena incisão no diafragma utilizando as curvas, a tesoura romba. A posição e da pressão do dedo pode auxiliar na capacidade de cortar o diafragma.
- Continuar a incisão diafragma ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural.
- Coloque curvos, tesouras cegas longo de um lado das costelas, cuidadosamente deslocando os pulmões, e fazer uma cut através da caixa torácica até a clavícula. Fazer um corte semelhante no lado contralateral.
- Elevação do esterno longe, apare cuidadosamente qualquer tecido conectando-o ao coração. Prender a extremidade do esterno com o hemostato e colocar o hemostato sobre a cabeça. Quando feito corretamente, o timo levanta longe do coração junto com o esterno, proporcionando uma visão clara dos principais vasos sanguíneos.
- Faça uma pequena incisão para a extremidade posterior do ventrículo esquerdo, com tesoura de íris.
Clique aqui para ver maior figura .
- Passa uma agulha de calibre 15-perfusão blunt-azeitona ou de ponta através do ventrículo corte na aorta ascendente. A ponta deve ser visível através da parede da aorta, e não deve atingir o arco aórtico onde as artérias carótida braquial e divergem.
- Usar uma hemostato para prender o coração, este assegura a agulha e evita o vazamento. Se desejado, o hemostato modificado pode ser utilizado para fixar a aorta em torno da ponta da agulha (estes hemostats permanecer no lugar até que começa dissecção, mas são omitidos ilustrações futuros para maior clareza).
- Finalmente, fazer uma incisão para o átrio direito do animal com uma tesoura de íris para criar uma grande tomada de uma possível sem danificar a aorta descendente. Neste ponto o animal está pronto para ser perfundido.
5. Perfusão
- Abra e anexar porta de saída para agulha de base tendo cuidado para não introduzir bolhas de ar.
- Bombear a lâmpada manómetro a uma pressão de 80 mm Hg de forma rápida e uniformemente. Manter esta pressão ao longo do período de infusão de tampão. Iniciar o temporizador.
- Ajustar o ângulo da agulha. O ângulo da agulha é crítica para a obtenção de uma taxa de fluxo máxima (note a mudança do fluxo com ajuste do ângulo).
- Mude o lustreer válvula (azul), uma vez tampão está quase terminada (200 ml). O fluido deve ser executado claro. A limpeza do fígado é um indicador de uma boa perfusão. O fígado deve ser claro neste ponto. Indique tempo para seus registros.
- Tremores de fixação devem ser observados dentro de segundos, o que deve ser considerado o tempo real de fixação. Indique tempo para seus registros.
- A pressão pode ser gradualmente aumentar até um máximo de 130 mm Hg 2 para manter uma taxa de fluxo constante.
- Feche a válvula de saída uma vez que o fixador está quase concluído. Indique terminando o tempo para seus registros.
- O rato deve ser duro nesta fase.
- O paraformaldeído usado deve ser recolhido e armazenado para eliminação de acordo com os regulamentos da sua instituição.
6. Dissecção 4,11
- Retire a cabeça, usando um par de tesouras.
- Faça uma incisão na linha média ao longo do tegumento do pescoço até o nariz e expor ocrânio.
- Aparar o músculo do pescoço restante de modo que a base do crânio é exposta; remover qualquer músculo residual usando tesoura ou fórceps.
- Coloque a extremidade afiada de um par de tesouras íris para o forame de um lado, cuidadosamente deslizando as tesouras ao longo da superfície interna do crânio.
- Em seguida, fazer um corte estendendo-se para a extremidade distai da superfície posterior do crânio. Faça um corte idêntico ao lado contralateral. Utilize os fórceps para limpar o crânio em torno do cerebelo.
- Deslize cuidadosamente a tesoura ao longo da superfície interna do crânio como a ponta viaja a partir do canto distal dorsal posterior para a extremidade distai frontal do crânio, levantando a lâmina de corte à medida que são para evitar danos para o cérebro. Repita para o lado oposto.
- Usando fórceps casca da superfície dorsal do crânio para longe do cérebro. Aparar os lados do crânio usando fórceps tão bem.
- Usando uma espátula, cortar os bulbos olfatórios e conectores nervosoções ao longo da superfície ventral do cérebro.
- Gentilmente provocar o cérebro longe da cabeça, aparando qualquer dura que ainda liga o cérebro ao crânio com uma tesoura de íris.
- Remover o cérebro e colocá-lo em um frasco de fluido contendo pelo menos fixador 10x o volume do cérebro em si. Agitar o frasco ocasionalmente.
7. Pós-fixação e armazenamento
- Manter o cérebro em fixador durante 24 horas a 4 ° C, agitando ocasionalmente.
- Após 24 horas, lavar o cérebro com salina tamponada com fosfato, trocando os meios de comunicação 3 vezes e agitando a cada vez.
- Cérebros podem então ser armazenadas em solução salina tamponada com fosfato ou HBHS com azida de sódio e mantida a 4 ° C.
8. Os resultados representativos
Um indicador do sucesso inicial da perfusão é a compensação das extremidades, como o nariz, orelhas e patas e órgãos internos, tais como a glândula timo e fígado (IHC Mundial).Inspeção bruta do cérebro revela o vazio vaso sanguíneo do sangue (branco a aparência amarelo-claro). Este será também verdade dentro das seções de tecido destinar para a coloração e imuno-histoquímica. O indicador final do resultado da perfusão é a condição de a ultraestrutura no tecido. 1,6,7,8
| Preparar Fixador: |
| Prepare estoque paraformaldeído 8% |
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| Preparar 0,2 M tampão fosfato de sódio, pH 7,4 |
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| Prepare fixadora paraformaldeído 4% |
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| Prepare Perfusão e buffers de armazenamento: |
| Preparar tampão fosfato, pH 7,4 Solução Salina |
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| HEPES Hanks Solution (HBHS) com pH 7,4 Sódio Azida |
|
Tabela 1. Preparação de fixador e tampões.
Figura 1.
Figura 2. Preparação da perfusão do Aparelho I. Comece com a linha de fixador. Lave o tubo de bolhas de ar e encha com tampão pela rápida expulsão e retirada do tampão para a seringa e através da linha. Fechar a válvula na extremidade da agulha fora. Coloque a linha fixador para a garrafa fixador sem a introdução de bolhas de ar.
Figura 3. Preparação da perfusão do Aparelho II. 1. Abrir a válvula na extremidade da agulha. 2. Gire a válvula tampão (azul) para a posição para o fluxo. 3. Lave o tubo de bolhas de ar e encha com tampão pela rápida expulsão e retirada do tampão com a seringa. 4. Fechar a válvula na extremidade da agulha. Coloque tubo dentro da garrafa buffer. Pressão de teste para garantir que o sistema é selado corretaly por bombeamento até o bulbo manômetro e observando o medidor. O aparelho está agora pronto para o procedimento de perfusão.
Figura 4. Aparelho de perfusão em posição para entrega tampão.
Figura 5. Perfusão Cirurgia I. a) Faça uma incisão lateral através do tegumento e da parede abdominal. b) Fazer uma incisão no diafragma e atravessam o diafragma expor o coração. Fazer cortes paralelos em ambos os lados das costelas até a clavícula. c) fixar a extremidade do esterno com o hemostato e colocar o hemostato sobre a cabeça.
Figura 6. Perfusion Cirurgia II. a) Passa a agulha de perfusão através do ventrículo corte na aorta ascendente. b) Assegurar operfusão agulha utilização um conjunto de hemostats para reprimir o coração. Um segundo conjunto de uma hemostato modificado pode também ser utilizado para fixar a aorta em torno da ponta da agulha para evitar fugas. Utilizando uma tesoura de íris fazer uma pequena incisão para a extremidade posterior do ventrículo esquerdo.
Figura 7. Perfusion com bomba tampão a lâmpada manómetro para criar pressão na linha. Abra a válvula (1) e anexar ao cubo da agulha. É fundamental certificar-se há bolhas de ar são introduzidas. Bombear a lâmpada manómetro para uma pressão de 80 mm Hg e manter esta pressão ao longo do período de infusão de tampão.
Figura 8. Perfusion com fixador Uma vez tampão está quase terminada (200 ml) alternar a válvula de tampão (1) para permitir o fixador de fluxo. A pressão pode ser gradualmente aumentada até ummáximo de 130 mm Hg.
Figura 9. I. Dissecção a) retirar a cabeça, usando um par de tesoura. b) fazer uma incisão na pele ao longo da linha média do pescoço para o nariz e expor o crânio. c) aparar o músculo do pescoço restante de modo que a base do crânio é exposta. Segure a cabeça para que a grande abertura na superfície do crânio (forame magno) é acessível. Introduza cuidadosamente a ponta afiada de um par de íris tesoura para o forame magno e fazer um corte. Repita a mesma manobra para o lado contralateral. Utilize os fórceps para limpar o crânio em torno do cerebelo.
Figura 10. Dissecção II. a) deslize cuidadosamente a tesoura ao longo da superfície interna do crânio. Levante a ponta como você está cortando para evitar danos ao cérebro. Repita a mesma paralado oposto. Use fórceps casca do crânio para longe do cérebro. b) ilustração com o crânio removido eo cérebro exposto. c) Utilização de uma espátula para cortar as lâmpadas olfactivas e conexões nervosas no local mais anterior do cérebro. Cuidadosamente orientar a ponta de espátula ao longo do lado de baixo do cérebro para cortar as ligações para a facilidade de remoção. Remover o cérebro e colocá-lo num frasco de fixador.
Discussion
Notas adicionais para uma cirurgia bem sucedida:
- Uma vez que o diafragma é violado, preceda rapidamente como hipóxia e hipercapnia iniciará irreversíveis mudanças fisiológicas que podem confundir a análise posterior.
- Quando a agulha é inserida e fixada no lugar, a pressão residual vai empurrar o sangue para a base da agulha (flashback). Na verdade, os animais maiores podem vigorosamente expelir sangue. É crítico que o sangue, pelo menos, alcançar a base da agulha a fim de evitar a introdução de bolhas de ar que irão apresentar um obstáculo para completar a perfusão. Se o sangue não é observado na base da agulha, retire a agulha e encha novamente com tampão, anexando-a à porta de saída do equipamento de perfusão. Uma vez tampão tem sido gerido através da ponta, a agulha pode ser reinserido no coração.
- A colocação apropriada da agulha no interior da aorta é crítica, ela não deve atingir tanto quanto o arco aórtico.
- Se perfusões múltiplas estão a ter lugar, não é necessário to configuração a partir do início de cada vez. O usuário precisa ter o volume adequado para tanto o buffer e fixador em cada garrafa (200mls animal / solução). Os frascos podem também ser recarregados, se necessário. O aspecto mais importante a considerar é nivelar para fora da linha de perfusão que é executado a partir da configuração para o animal (válvula de saída). Após a conclusão de um perfusão, esta linha terá paraformaldeído a 4% na mesma. Remova o tubo do frasco de tampão e usar uma seringa de 50 ml com água para lavar o fixador. Assegure-se a válvula de saída é colocado num copo de recolha de resíduos para a eliminação adequada do paraformaldeído. Repita isso três vezes. Encher com tampão utilizando o mesmo método mostrado na 2,3.
- Este método de fixação é altamente adaptável com a capacidade de alterar tanto tampão e fixadoras fixadores outros (tais como as utilizadas para a EM) de acordo com os requisitos da experiência.
- O sistema também é freqüentemente usado para a extração de tecido vivo. Para esteum processo de simplesmente usa a entrega de apenas tampão (tampão de a garrafa, enquanto ainda ligado a todo o sistema é colocado em um balde de gelo ea garrafa fixador está configurada como vazio, mas selado). Isto assegura uma perfusão tampão frio à pressão óptima. A partir daqui, o sistema pode ser adaptado para a infusão de corantes fixável por qualquer adição do corante directamente para o tampão (se a quantidade não é um problema) ou utilizar uma seringa com uma quantidade mínima de tampão / solução de corante entre o buffer - passo fixador.
- No caso de fundição vascular, a pressão passo tampão de monitorização é crucial no entanto, devido à viscosidade e solidificando natureza da solução de vazamento uma seringa 50 ml deve ser usado para a entrega directa ou um acessório descartável secundário para o aparelho (válvula de tubo, e segurando container) fez a interface com o sistema atual seja usado. Nossos laboratórios de fundição vascular precedeu a concepção e fabrico do aparelho de perfusão. Portanto, não podemos ªcomeu que as medições de pressão será uma medição precisa no local de entrega. Os números podem ter de ser ajustado para conseguir a entrega bem sucedida de fluidos viscosos.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Centro de Tecnologia de Comunicação Neural (CNCT), um Centro de Recursos P41 financiado pelo Instituto Nacional de Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) e apoiado pelo National Institutes of Health (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Anesthetic may vary per laboratory / institution) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | 10 mL vial |
| Surgery: | |||
| Needle tip, 27 GA x 1.25" | Materiel Services | 25251 | |
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 1 large hemostat forceps - curved or straight (~19 cm) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
| 2 standard hemostat forceps - straight serrated (14 cm) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 1 modified hemostat (with 15-gauge hole filed through the tip) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 15-gauge blunt or olive-tipped needle (perfusion needle) | Fisnar | 5601137 | |
| Perfusion: | |||
| HyPerfusion system or equivalent | |||
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| 4% Paraformaldehyde in 0.1 M Phosphate Buffer, pH 7.4 | |||
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Crushed ice | |||
| Water bath (37 °C) | |||
| Timer | |||
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (~12 cm) | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Medium curved or straight rongeurs (14-16 cm) or skull bone removal pliers | Fine Science Tools | 16020-14 | |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml glass vial | |||
| 40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) with sodium azide (90mg/l) | |||
References
- Cinar, O., Semiz, O., Can, A. A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections. Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).
- Fritz, M., Rinaldi, G. Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).
- Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats. Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).
- Jacobowitz, D. M. Removal of discrete fresh regions of rat brain. Brain Res. 80, 111-115 (1974).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).
- Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).
- Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration. J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).
- Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).
- Ramos-Vara, J. A. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues. J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).
- Walker, W. F. Vertebrate dissection. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).
- Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. J. Neurotrauma. Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).
