Summary
Здесь мы опишем недорогой, быстрый, контролируемый и равномерный фиксации процедуры с использованием 4% параформальдегид перфузии с помощью сосудистой системы: в сердце крысы для получения наилучшего возможного сохранения мозга.
Abstract
Цель фиксации быстро и равномерно сохранить ткани в жизни, как государство. При размещении ткани непосредственно в фиксатор хорошо работает для небольших кусочков ткани, крупные экземпляры, как неповрежденный мозг создаст проблему для погружения фиксации, так как фиксатор не доходит до всех регионов ткани с той же скоростью 5,7. Часто изменения в ответ на гипоксию начаться до ткань может быть сохранено 12. Преимущество непосредственно перфузии фиксатором через кровеносную систему, что химическое вещество может быстро добраться до любого уголка организма с использованием природных сосудистой сети. Для того, чтобы использовать системы кровообращения наиболее эффективно, необходимо позаботиться, чтобы соответствовать физиологическим давление 3. Важно отметить, что физиологическое давление в зависимости от используемых видов. Методы фиксации перфузии варьируются в зависимости от ткани должна быть установлена и как ткань будет обработан после записи. В этом видеоМы описываем недорогой, быстрый, контролируемый и равномерный фиксации процедуры с использованием 4% параформальдегид перфузии с помощью сосудистой системы: в сердце крысы для получения наилучшего возможного сохранения мозга для иммуногистохимии. Основным преимуществом этого метода (по сравнению с самотечных систем) является то, что кровеносная система используется наиболее эффективно.
Protocol
1. Подготовить Fixative
(См. таблицу Fixative и буферов).
2. Подготовить перфузии буферов
(См. таблицу Fixative и буферов).
3. Подготовка аппарата и анестезии
- С помощью водяной бане, теплый буфер перфузии до 37 ° C. Место выпускной клапан в стакан заполнен буфер. Наполните шприц 50 мл с буфером и приложить к фиксатора трубок. Промойте трубку неоднократно исключения и изъятия буфера.
- Снимите соответствии с буфером, пока все пузырьки воздуха в трубопроводе устранены. Это имеет решающее значение для успеха перфузии не иметь пузырьков воздуха в любой из линий.
- Удалите шприц и подключить 4% параформальдегид фиксатором (комнатной температуры) контейнер. Чтобы избежать пузырьков воздуха в конце трубы, сожмите трубки при позиционировании трубку в контейнер, так что капли буфера выступает с конца тО связаться с поверхности жидкости в контейнере.
- Закройте выходное отверстие (конец стрелки). Включите буфер клапан (синий) в том же положении, фиксатор клапана (белый). Это позволит поток из буфера строки.
- Откройте выходное отверстие и повторите шаг A1 до A3 для заполнения буфера. После того как все пузырьки воздуха удаляются близкие выходное отверстие, удалите шприц и подключить буфер контейнер, заботясь, чтобы не вводить пузырьков воздуха в трубку.
- Тест-система для способности удерживать давление на насосной реветь резиновые манометра. Существует правило некоторое сопротивление за счет сжатия воздуха в системе.
- Установка хирургии инструменты для того, чтобы легко доступа. Заполните перфузии иглы с буфером, чтобы исключить возможность пузырьков воздуха.
- До операции, кетамин / ксилазина смеси (до 80 мг / кг кетамина веса и 10 мг / кг массы тела ксилазина) осуществляется с помощью внутрибрюшинного введения (27 иглой и шприцем 1 мл). Дополнительная администрации анестезии будет осуществляться по мере необходимости в ходе каждой операции для поддержания хирургической анестезии плоскости.
4. Перфузии хирургии
- Как только животное достигло хирургической анестезии плоскость, поместите его на мелкие лоток заполнен с колотым льдом. (Используйте палец пинч-ответ метода для определения глубины наркоза. Животное должно отвечать, прежде чем продолжить).
- Сделайте 5-6 см боковой разрез через покровы и брюшную стенку прямо под грудной клеткой. Аккуратно отделить печень от диафрагмы.
- Сделайте небольшой надрез в диафрагме помощью изогнутых, тупых ножниц. Положение и давление пальца может помочь в способности сократить диафрагму.
- Продолжить диафрагмы разрез вдоль всей длины грудной клетки, чтобы разоблачить плевральной полости.
- Разместите изогнутый, тупыми ножницами вдоль одной стороны ребра, тщательно вытесняя легкие, и сделать у.е.т через грудную клетку до ключицы. Сделать подобный вырез на противоположной стороне.
- Подъем от грудины, аккуратно обрезать любой ткани, подключив его к сердцу. Зажмите кончик грудной кости с кровоостанавливающего и поместить кровоостанавливающего над головой. Если все сделано правильно, вилочковая железа поднимается от сердца вместе с грудиной, обеспечивая четкое представление о крупных сосудов.
- Сделайте небольшой надрез на заднем конце левого желудочка использование диафрагмы ножницами.
Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
- Пройдите 15 калибра тупыми или оливкового наконечником перфузии иглу через сокращение желудочков в восходящей аорте. Кончик должен быть виден через стенку аорты, и не должны достигать дуги аорты, где плечевой и сонной артерии расходятся.
- Использование кровоостанавливающего зажима на сердце, это обеспечивает иглы и предотвращает утечку. При необходимости, изменение кровоостанавливающего может быть использована для зажима аорты вокруг кончика иглы (это hemostats оставаться на месте до вскрытия начинается, но исключены из будущих иллюстраций для ясности).
- Наконец, сделать разрез на правом предсердии животных с использованием диафрагмы ножницы для создания как большой выход возможно без ущерба для нисходящей аорты. В этот момент животное готово будет озарен.
5. Перфузия
- Открыть и придаем выходное отверстие для иглы базы заботясь, чтобы не вводить никаких пузырьков воздуха.
- Pump Up The манометр лампы до давления 80 мм рт быстро и равномерно. Поддерживать это давление в течение всего периода инфузии буфера. Запустите таймер.
- Отрегулируйте угол иглы. Угол наклона иглы имеет решающее значение для достижения максимальной скорости потока (обратите внимание на изменение потока с углом регулировки).
- Включите любительэ клапан (синий), как только буфер почти закончена (200 мл). Жидкость должна быть запущена ясно. Очистки печени является показателем хорошей перфузии. Печени должно быть ясно, на данный момент. Укажите время для записи.
- Фиксация подземных толчков следует соблюдать в течение нескольких секунд, это следует рассматривать как истинное время фиксации. Укажите время для записи.
- Давление может быть постепенно увеличить до максимума 130 мм Hg 2 для поддержания постоянной скорости потока.
- Закройте выпускной клапан после фиксатор почти закончена. Укажите время окончания для своих записей.
- Крыса должна быть жесткой на этом этапе.
- Используемые параформальдегид должны быть собраны и хранятся для захоронения в соответствии с правилами вашего учреждения.
6. Вскрытие 4,11
- Снимите головку с помощью ножниц.
- Сделайте срединный разрез вдоль покровов от шеи до носа и подвергатьчереп.
- Аккуратный от оставшихся мышц шеи так, чтобы основание черепа подвергается, удалить остатки мышц использованием ножниц или rongeurs.
- Поместите острый конец пары диафрагма ножницы в большое затылочное отверстие с одной стороны, аккуратно сняв ножницы по внутренней поверхности черепа.
- Далее, сделать разрез на расширение дистального края задней поверхности черепа. Сделать идентичный вырез на противоположной стороне. Используйте rongeurs убрать черепа вокруг мозжечка.
- Аккуратно вставьте ножницы по внутренней поверхности черепа, как кончик путешествует со спинной дистальных заднем углу фронтальной дистального края черепа, поднимая на крыло, как вы резки, чтобы предотвратить повреждение головного мозга. Повторите для другой стороны.
- Использование rongeurs очистить спинной поверхности черепа от головного мозга. Обрезать стороны черепа использованием rongeurs также.
- С помощью шпателя, разорвать обонятельных луковиц и нервных соединенийTIONS вдоль вентральной поверхности мозга.
- Осторожно дразнить мозг от головы, отделка любой длительности, что до сих пор соединяет мозг с черепом использование диафрагмы ножницами.
- Удалить мозга и поместить его в сосуд с фиксатором содержащие жидкость по крайней мере в 10 раз объема самого мозга. Swirl флакон времени.
7. После фиксации и хранения
- Держите в мозге фиксатором в течение 24 часов при температуре 4 ° C, циркулируя от времени.
- После 24 часов, промыть мозг с фосфатным буферным раствором путем обмена средств массовой информации в 3 раза и каждый раз, закрученной.
- Мозг может быть сохранен в фосфатном буферном растворе или HBHS с азид натрия и хранить при температуре 4 ° C.
8. Представитель Результаты
Первоначальный показатель успеха перфузии очистки конечностей, таких как нос, уши, лапы и и внутренних органов, таких как вилочковая железа и печень (IHC World).Валовой осмотра мозга показывает пустоту кровеносных сосудов крови (белого до бледно-желтый цвет). Это будет справедливо и в срезах ткани предопределяет для окрашивания и иммуногистохимии. Окончательный показатель результатов перфузии состояние ультраструктуры ткани. 1,6,7,8
| Подготовить Fixative: |
| Подготовить 8% параформальдегид акции |
|
| Подготовить 0,2 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,4 |
|
| Подготовка 4% параформальдегид Fixative |
|
| Подготовить перфузии и хранения буфера: |
| Подготовить фосфатного буфера, рН 7,4 |
|
| HEPES буферизацией Хэнкс Решение (HBHS) азида натрия с рН 7,4 |
|
Таблица 1. Подготовка Fixative и буферов.
Рисунок 1.
Рисунок 2. Подготовка перфузии аппарата I. Начнем с фиксатором линии. Промойте трубку пузырьков воздуха и заполнить буфер быстрого исключения и изъятия буфера в шприц и по линии. Закройте клапан на конце иглы с. Поместите фиксатор линии в фиксирующий бутылку без введения пузырьков воздуха.
Рисунок 3. Подготовка перфузии аппарата II. 1. Откройте клапан на конце иглы. 2. Включите буфер клапан (синий) в положение для потока. 3. Промойте трубку пузырьков воздуха и заполнить буфер быстрого исключения и изъятия буфер со шприцем. 4. Закройте клапан на конце иглы. Положите трубку в буфер бутылку. Испытательное давление, чтобы убедиться, что система запечатан правильногоют на накачивание манометр лампы и смотреть на датчик. Аппарат готов к перфузии процедуры.
Рисунок 4. Перфузии аппарата в положение буфера доставки.
Рисунок 5. Перфузии хирургии И.) обеспечить боковой разрез через покровы и брюшной стенки. б) Сделайте разрез в диафрагме и пересекают диафрагмы подвергая сердце. Сделать параллельными разрезами по бокам ребра до ключицы. в) зажать кончик грудной кости с кровоостанавливающего и поместить кровоостанавливающего над головой.
Рисунок 6. Перфузии хирургии II. а) Передать перфузии иглу через сокращение желудочков в восходящей аорте. б) Закрепитеперфузии иглы используется один набор hemostats зажать сердце. Второй набор измененных кровоостанавливающего также может быть использована для зажима аорты вокруг иглы, чтобы предотвращает утечку. Используя ножницы ирис сделать небольшой разрез в заднем конце левого желудочка.
Рисунок 7. Перфузии с буфером насоса манометр лампы для создания давления в линии. Откройте клапан (1) и прикрепить к игле центром. Очень важно, чтобы убедиться, что нет пузырьков воздуха вводятся. Pump Up The манометр лампы до давления 80 мм рт.ст. и поддерживать это давление в течение всего периода инфузии буфера.
Рисунок 8. Перфузии с Fixative После буфер почти закончена (200 мл) переключение буфера клапан (1) для обеспечения фиксатора на поток. Давление может быть постепенно увеличена доболее 130 мм рт.
Рисунок 9. Вскрытие I.) удалите головку с помощью пары ножниц. б) сделать надрез в коже по средней линии от шеи до носа и подвергать черепа. в) обрезать оставшиеся мышцы шеи так, чтобы основание черепа подвергается. Держите голову так, чтобы большое отверстие в черепе поверхности (затылочное отверстие) доступна. Осторожно вставьте острый конец пары диафрагма ножницы в большое затылочное отверстие и сделать разрез. Повторите тот же маневр на противоположной стороне. Используйте rongeurs убрать черепа вокруг мозжечка.
Рисунок 10. Вскрытие II. а) аккуратно вставьте ножницы по внутренней поверхности черепа. Поднимите на кончике, как вы резки, чтобы предотвратить повреждение головного мозга. Повторите то же самое дляпротивоположную сторону. Используйте rongeurs очистить череп от мозгов. б) иллюстрация с черепом и удалить мозг подвергается. в) использовать лопаточку, чтобы разорвать обонятельных луковиц и нервных связей в самой передней локализации мозга. Тщательно направлять наконечник шпателя вдоль нижней части мозга разорвать соединение для удобства удалить. Удалить мозга и поместить его в сосуд с фиксатором.
Discussion
Дополнительные примечания для успешной операции:
- После того, мембрана нарушается, перед быстро, как гипоксия и гиперкапния начнет необратимые физиологические изменения, которые могут запутать последующего анализа.
- Когда игла вводится и зажимается в месте, остаточное давление будет толкать кровь к основанию иглы (воспоминание). На самом деле, крупные животные могут активно высылать крови. Очень важно, чтобы кровь по крайней мере достигают основания иглы, чтобы избежать введения пузырьки воздуха, которые будут представлять препятствие для завершения перфузии. Если кровь не наблюдается у основания иглы, удалить иглу и заполнить буфер путем присоединения его к розетке порта перфузии установки. Как только буфер был проходить через наконечник, игла может быть вставлен в сердце.
- Правильное размещение иглы в аорте является критической, она не должна достигать до дуги аорты.
- Если несколько перфузии происходят не стоит то установки с самого начала каждый раз. Пользователь должен иметь соответствующие объемы для буфера и фиксирующий в каждой бутылке (200mls животных / решения). Бутылки можно пополнить в случае необходимости. Самый важный аспект, чтобы рассмотреть вымывания перфузии линия, которая идет от установки на животных (выход клапана). После завершения перфузии, эта линия будет иметь 4% параформальдегида в нем. Снимите трубку из буфера бутылки и использовать 50 мл шприц, заполненный водой, чтобы избавиться от фиксатора. Убедитесь, что выпускной клапан помещается в стакане по сбору отходов для правильной утилизации параформальдегида. Повторите это три раза. Залейте буфера, используя тот же метод, показанный в п. 2.3.
- Этот метод для фиксации хорошо адаптируется с возможностью менять как буфер и фиксирующие другие фиксаторы (такие, как те, которые используются для EM) в соответствии с требованиями эксперимента.
- Система также часто используется для извлечения живых тканей. Для этогоПроцесс человек просто использует поставки буфер только (буфер бутылку в то же время придает всей системе находится в ведерке со льдом и фиксирующих бутылку настроен как пустой, но запечатанный). Это обеспечивает холодный перфузии буфера при оптимальном давлении. Отсюда система может быть адаптирована для вливания поправимо красителей путем добавления красителя непосредственно в буфере (если количество не является проблемой) или использовать шприц с минимальным количеством буфера / раствор красителя между буфера - фиксатором шага.
- В случае сосудистых литье, буфер контроля давления шаг является решающим однако из-за вязкости и укреплении характер литья решение или 50 мл шприц должны быть использованы для прямой доставки или одноразовые вторичных креплений для установки (трубы, клапаны и проведение контейнер) сделал для взаимодействия с существующей системе будут использоваться. Сосудистой литье Наши лаборатории "предшествовала разработка и производство перфузии аппарата. Поэтому мы не можем гоели, что измерения давления будут точные измерения на поставку сайта. Цифры могут быть скорректированы для достижения успешной реализации вязких жидкостей.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Центром нейронных коммуникационных технологий (CNCT), P41 Ресурсный Центр финансируется Национальным институтом биомедицинской визуализации и биоинженерии (NIBIB, P41 EB002030) и при поддержке Национального института здоровья (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Anesthetic may vary per laboratory / institution) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | 10 mL vial |
| Surgery: | |||
| Needle tip, 27 GA x 1.25" | Materiel Services | 25251 | |
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 1 large hemostat forceps - curved or straight (~19 cm) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
| 2 standard hemostat forceps - straight serrated (14 cm) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 1 modified hemostat (with 15-gauge hole filed through the tip) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 15-gauge blunt or olive-tipped needle (perfusion needle) | Fisnar | 5601137 | |
| Perfusion: | |||
| HyPerfusion system or equivalent | |||
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| 4% Paraformaldehyde in 0.1 M Phosphate Buffer, pH 7.4 | |||
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Crushed ice | |||
| Water bath (37 °C) | |||
| Timer | |||
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (~12 cm) | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Medium curved or straight rongeurs (14-16 cm) or skull bone removal pliers | Fine Science Tools | 16020-14 | |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml glass vial | |||
| 40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) with sodium azide (90mg/l) | |||
References
- Cinar, O., Semiz, O., Can, A. A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections. Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).
- Fritz, M., Rinaldi, G. Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).
- Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats. Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).
- Jacobowitz, D. M. Removal of discrete fresh regions of rat brain. Brain Res. 80, 111-115 (1974).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).
- Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).
- Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration. J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).
- Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).
- Ramos-Vara, J. A. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues. J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).
- Walker, W. F. Vertebrate dissection. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).
- Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. J. Neurotrauma. Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).
