Summary
Her beskriver vi en lav-kost, rask, kontrollert og ensartet fiksering prosedyren med 4% paraformaldehyde perfused via karsystemet: gjennom hjertet av rotte for å oppnå best mulig bevaring av hjernen.
Abstract
Målet med fiksering er å raskt og jevnt bevare vev i et liv-lignende tilstand. Mens plassere vev direkte i festing fungerer godt for små biter av vev, større prøver som intakt hjerne utgjøre et problem for nedsenking festing fordi fiksativ ikke når alle regioner i vevet på samme rate 5,7. Ofte endringer i respons på hypoksi begynne før vevet kan bli bevart 12. Fordelen med direkte perfusing fiksativ gjennom sirkulasjonssystemet er at stoffet kan raskt nå alle deler av organismen ved hjelp av naturlige vaskulære nettverket. For å utnytte sirkulasjonssystemet mest effektivt, må man sørge for å matche fysiologiske press 3. Det er viktig å merke seg at fysiologiske presset er avhengig av arten som brukes. Teknikker for perfusjon fiksering varierer avhengig av vev som skal festes og hvordan vevet vil bli behandlet etter fiksering. I denne videoenBeskriver vi en rimelig, rask, kontrollert og ensartet fiksering prosedyren med 4% paraformaldehyde perfused via karsystemet: gjennom hjertet av rotte for å oppnå best mulig bevaring av hjernen for immunhistokjemi. Den største fordelen med denne teknikken (vs tyngdekraft-matet systemer) er at sirkulasjonssystemet utnyttes mest effektivt.
Protocol
1. Forbered Fixative
(Se tabell Fixative og buffere.)
2. Forbered perfusjon buffere
(Se tabell Fixative og buffere.)
3. Forbered Apparatus og anestesi
- Bruke vannbad, varm perfusjons buffer til 37 ° C. Plasser Utløpsventilen i et begerglass fylt med buffer. Fyll en 50 ml sprøyte med buffer og fest fiksativ tubing. Skyll slangen gjentatte ganger ved å utvise og trekke buffer.
- Fjern linjen med buffer inntil alle luftbobler i slangen er eliminert. Det er avgjørende for suksessen til en perfusjons ikke å ha luftbobler i noen av linjene.
- Fjern sprøyten og koble 4% paraformaldehyde fiksativ (romtemperatur) beholder. For å unngå luftbobler i slangen slutt, klemme røret mens plassere slangen inn i beholderen slik at en dråpe buffer stikker fra slutten to kontakte væske overflate i beholderen.
- Lukk utblåsningsåpningen (nål slutten). Slå buffer ventil (blå) til samme posisjon som bindemiddel ventilen (hvit). Dette vil gi strøm fra buffer linje bare.
- Åpne utblåsningsåpningen og gjenta trinn A1 gjennom A3 for å fylle bufferen linjen. Etter at alle luftboblene er eliminert tett utblåsningsåpningen, fjern sprøyten og koble buffer beholderen, tar seg ikke å innføre luftbobler inn i slangen.
- Test system for evnen til å holde trykket ved å pumpe den gummi manometeret blub. Det er normalt litt motstand på grunn av kompresjon av luft i systemet.
- Oppsett kirurgi verktøy i orden for enkel tilgang. Fyll perfusjon nål med buffer for å eliminere muligheten for luftbobler.
- Før kirurgi, er en ketamin / xylazin blanding (opp til 80 mg / kg kroppsvekt ketamin og 10 mg / kg kroppsvekt xylazin) administreres via intraperitoneal injeksjon (27 gauge nål og en cc sprøyte). Ekstra tilførsel av bedøvelse vil bli utført etter behov i løpet av hver operasjon for å opprettholde en kirurgisk fly av anestesi.
4. Perfusjon Kirurgi
- Når dyret har nådd en kirurgisk flyet av anestesi, plasser den på grunt skuffen fylt med knust is. (Bruk tå klype-respons metoden for å bestemme dybde av anestesi. Dyret skal ikke svarer før du fortsetter).
- Lag en 5-6 cm lateralt snitt gjennom integument og bukveggen like under ribbeina. Forsiktig skille leveren fra mellomgulvet.
- Lag et lite snitt i mellomgulvet med de buede, butte saks. Plasseringen og trykket fingeren kan hjelpe i muligheten til å kutte mellomgulvet.
- Fortsett membranen snitt langs hele lengden av brystkassen for å avdekke pleurahulen.
- Plasser buede, butte sakser langs den ene siden av ribbeina, nøye fortrenger lungene, og lage en cut gjennom brystkassen opp til kragebeinet. Lag en lignende kutt på motsatt side.
- Løfte sternum bort, nøye trimme noe vev å koble den til hjertet. Klem brystbenspissen med hemostat og plasser hemostat over hodet. Når det gjøres riktig, løfter thymus vekk fra hjertet sammen med brystbenet, og gir et klart bilde av de store fartøyene.
- Lag et lite snitt i bakre enden av venstre ventrikkel med iris saks.
Klikk her for å se større figur .
- Pass en 15-gauge sløv-eller oliven-tipped perfusjon nålen gjennom kutt hjertekammer i aorta ascendens. Spissen skal være synlig gjennom veggen av aorta, og bør ikke nå aortabuen der brakiale og carotis divergerer.
- Bruk en hemostat å klemme hjertet, sikrer denne nålen og hindrer lekkasje. Hvis ønskelig, kan den endres hemostat brukes til å klemme aorta rundt nålespissen (disse hemostats forbli på plass til disseksjon starter, men er utelatt fra framtidige illustrasjoner for klarhet).
- Til slutt, gjør et snitt til dyrets høyre atrium med iris saks til å skape så stor en stikkontakt som mulig uten å skade synkende aorta. På dette punktet dyret er klar til å bli perfused.
5. Perfusjon
- Åpne og fest utgangsporten til p basen tar seg ikke å innføre noen luftbobler.
- Pump opp manometeret pære til et trykk på 80 mm Hg raskt og jevnt. Oppretthold dette trykket gjennom hele bufferen infusjonsperioden. Starte tidtakeren.
- Juster nålen vinkel. Vinkelen på nålen er avgjørende for oppnåelse av en maksimal strømningsrate (merk flyten endringen med justerbar vinkel).
- Slå av buffER ventil (blå) når buffer er nesten ferdig (200 ml). Væsken skal kjøre tydelig. Clearing av leveren er en indikator på en god perfusjon. Leveren skal være klar på dette punktet. Indikerer tid for dine poster.
- Fiksering rystelser bør observeres i løpet av sekunder, og dette bør vurderes den sanne tid fiksering. Indikerer tid for dine poster.
- Trykket kan gradvis bli økt opp til maksimalt 130 mm Hg 2 for å opprettholde en jevn flyt rate.
- Lukk utløpsventilen når bindemiddel er nesten ferdig. Indikere sluttidspunkt for dine poster.
- Rotta skal være stiv på dette stadiet.
- Den brukte paraformaldehyde må samles og lagres for deponering i henhold til reglene i institusjon.
6. Disseksjon 4,11
- Fjern hodet ved hjelp av en saks.
- Lag en midtlinjen snitt langs integument fra nakken til nesen og utsettskallen.
- Skjær av gjenværende hals muskelen, slik at bunnen av hodeskallen er eksponert; fjerne alle rester av muskel bruker saks eller Rongeurs.
- Plasser den skarpe enden av et par iris saks inn i foramen magnum på den ene siden, forsiktig glir saksen langs den indre overflaten av skallen.
- Neste, et snitt som strekker seg til den distale kanten av bakre skalle overflaten. Lag en identisk kutt på motsatt side. Bruk Rongeurs å rydde vekk skallen rundt lillehjernen.
- Skyv saksen langs den indre overflaten av hodeskallen som spissen reiser fra dorsal distale bakre hjørne til distale frontal kanten av skallen, løfte opp på bladet som du kutter for å hindre skade på hjernen. Gjenta for motsatt side.
- Bruke Rongeurs skrelle framsiden av hodeskallen vekk fra hjernen. Trim vekk sidene av skallen med Rongeurs også.
- Ved hjelp av en slikkepott, kutte olfactory blomsterløk og nervøs forbinsjoner langs baksiden av hjernen.
- Forsiktig erte hjernen bort fra hodet, trimming enhver dura som fortsatt forbinder hjernen til hodeskallen ved hjelp av iris saks.
- Fjern hjernen og legg den i en ampulle med bindemiddel holdig væske minst 10x volumet av hjernen selv. Swirl hetteglasset innimellom.
7. Post-fiksering og lagring
- Hold hjernen i bindemiddel i 24 timer ved 4 ° C, virvlende og til.
- Etter 24 timer, vask hjernen med fosfat saltløsning ved å utveksle media 3 ganger og virvlende hver gang.
- Hjerner kan deretter lagres i fosfatbufret saltvann eller HBHS med natriumazid og oppbevares ved 4 ° C.
8. Representative Resultater
En første indikator på suksessen til perfusjons er clearing av ekstremiteter som nese, ører og poter og indre organer som thymus kjertelen og leveren (IHC World).Brutto inspeksjon av hjernen avslører blodåre blottet for blod (hvit til blek gul utseende). Dette vil også være sant innenfor vevsdelene forutbestemme til farging og immunhistokjemi. Den endelige indikator utfallet av perfusjons er tilstanden til ultrastructure i vevet. 1,6,7,8
| Forbered Fixative: |
| Forbered 8% Paraformaldehyde lager |
|
| Forbered 0,2 M natriumfosfat Buffer, 7,4 pH |
|
| Forbered 4% Paraformaldehyde Fixative |
|
| Forbered Perfusjons og bagasje buffere: |
| Forbered Fosfatbufret Saline, pH 7,4 |
|
| HEPES Buffered Hanks Solution (HBHS) med natriumazid pH 7,4 |
|
Tabell 1. Forberedelse av Fixative og buffere.
Figur 1.
Figur 2. Forberedelse av Perfusjons Apparatus I. Begynn med fiksativ linjen. Skyll slangen av luftbobler og fyll med buffer ved raskt å utvise og uttak buffer i sprøyten og gjennom linjen. Steng ventilen på p. enden av. Plasser fiksativ linje i fiksativ flasken uten å innføre luftbobler.
Figur 3. Forberedelse av Perfusjons Apparatus II. 1. Åpne ventilen på pinnen slutten. 2. Slå buffer ventil (blå) for å posisjonere for flyt. 3. Skyll slangen av luftbobler og fyll med buffer ved raskt å utvise og uttak buffer med sprøyten. 4. Steng ventilen på pinnen slutten. Plasser slangen inn i den bufferen flasken. Test press for å sikre at systemet er tett riktigly ved å pumpe opp manometeret pære og se måleren. Apparatet er nå klar for perfusjon prosedyren.
Figur 4. Perfusjons Apparater i posisjon for buffer levering.
Figur 5. Perfusjons Kirurgi I. a) Lag en lateral snitt gjennom integument og bukveggen. b) Lag et snitt i mellomgulvet og skjær over membranen utsette hjertet. Lag parallelle kutt på hver side av ribbene opp til kragebeinet. c) klemme spissen av brystbenet med hemostat og plasser hemostat over hodet.
Figur 6. Perfusjons Kirurgi II. a) Før perfusjon nålen gjennom kutt hjertekammer i aorta ascendens. b) Sikreperfusjon nålen bruk ett sett av hemostats å klemme hjertet. Et annet sett av en modifisert hemostat kan også brukes til å klemme aorta rundt nålespissen å forhindrer lekkasje. Bruke iris saks lage et lite snitt i bakre enden av venstre ventrikkel.
Figur 7. Perfusjons med buffer Pump manometeret pære å skape trykk i linjen. Åpne opp ventilen (1) og fester seg til nålen hub. Det er avgjørende å sørge for at ingen luftbobler er innført. Pump opp manometeret pære til et trykk på 80 mm Hg og opprettholde dette trykket gjennom hele bufferen infusjonsperioden.
Figur 8. Perfusjons med Fixative Når bufferen er nesten ferdig (200 ml) slår bufferen ventilen (1) for å tillate fiksativ til å flyte. Trykket kan gradvis økes opp til enmaksimalt 130 mm Hg.
Figur 9. Dissection I. a) fjerne hodet ved hjelp av et par saks. b) gjøre et snitt i huden langs midtlinjen fra nakken til nesen og avsløre skallen. c) klippe av gjenværende hals muskelen, slik at bunnen av hodeskallen er utsatt. Hold hodet slik at den store åpningen i kraniet overflaten (foramen magnum) er tilgjengelig. Forsiktig inn den skarpe enden av et par iris saks inn i foramen magnum og gjør et kutt. Gjenta det samme manøver for motsatt side. Bruk Rongeurs å rydde vekk skallen rundt lillehjernen.
Figur 10. Dissection II. a) skyv saksen langs den indre overflaten av skallen. Løft opp på spissen når du kutter for å hindre skade på hjernen. Gjenta det samme formotsatt side. Bruk Rongeurs skrell skallen vekk fra hjernen. b) illustrasjon med skallen fjernet og hjernen utsettes. c) Bruk en slikkepott til å kutte olfactory blomsterløk og nerve tilkoblinger på det mest anterior plassering av hjernen. Forsiktig lede spatelen spissen langs undersiden av hjernen å kutte forbindelser for enkel fjerne. Fjern hjernen og legg den i en ampulle med bindemiddel.
Discussion
Flere merknader for en vellykket operasjon:
- Når membranen blir brutt, setter raskt som hypoksi og hyperkapni vil ta initiativ til irreversible fysiologiske endringer som kan forvirre påfølgende analyse.
- Når nålen er satt inn og festet på plass, vil det gjenværende trykket blodet skyves til bunnen av nålen (flashback). Faktisk kan større dyr kraftig utvise blod. Det er viktig at blod minst når bunnen av nålen for å unngå å introdusere luftbobler som vil presentere en hindring for å fullføre perfusjon. Hvis ingen blod er observert på nålen basen, fjernes kanylen og fyll på med buffer ved å feste den til utgangsporten av perfusjon riggen. Når bufferen har blitt kjørt gjennom spissen, kan kanylen settes inn i hjertet.
- Riktig plassering av nålen i aorta er kritisk, bør det ikke komme så langt som til aortabuen.
- Hvis flere perfusions foregår det ikke er nødvendig to oppsett fra begynnelsen hver gang. Brukeren må ha riktig volum for både buffer og fiksativ i hver flaske (200mls dyr / løsning). Flaskene kan også etterfylles om nødvendig. Det viktigste aspekt å vurdere er spyle ut perfusjon linjen som går fra oppsettet til dyret (output ventil). Etter gjennomføring av en perfusjon, vil denne linjen ha 4% paraformaldehyde i det. Ta slangen fra buffer flasken og bruke en 50 ml sprøyte fylt med vann for å skylle ut bindemiddel. Kontroller at utløpsventilen er plassert i en avfallsinnsamling begerglass for riktig avhending av paraformaldehyde. Gjenta dette tre ganger. Påfyll med buffer ved bruk av samme metoden vist i 2.3.
- Denne metoden for fiksering er svært tilpasningsdyktige med evnen til å endre både buffer og festing andre fiksativ (som de som brukes for EM) i henhold til kravene i forsøket.
- Systemet er også ofte brukt til utvinning av levende vev. For detteprosessen man bruker bare levering av buffer bare (buffer flasken samtidig koblet til hele systemet er plassert i en isbøtte, og fiksativ flasken er oppsett som tom, men forseglet). Dette sikrer en kald buffer perfusjon ved optimalt trykk. Herfra systemet kan tilpasses tilførsel av låses fargestoffer ved enten å legge fargestoffet direkte til buffer (hvis mengden er ikke et problem) eller bruke en sprøyte med en minimal mengde buffer / fargestoff løsning i mellom buffer - fiksativ trinn.
- Ved vaskulær casting, er trykket overvåking buffer trinnet avgjørende imidlertid på grunn av viskositet og solidifying natur casting løsningen enten en 50ml sprøyte må brukes for direkte levering eller engangsgrill sekundær tilknytning til apparatet (tubing, ventil og holder container) gjort til grensesnitt med dagens system benyttes. Våre Laboratories 'vaskulær casting forut for design og produksjon av perfusjon apparat. Derfor kan vi ikke løse mspiste at trykket målingene vil være en nøyaktig måling på mottaksplass. Tallene kan måtte justeres for å oppnå vellykket levering av viskøse væsker.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Senter for Neural kommunikasjonsteknologi (CNCT), en P41 Resource Center finansiert av National Institute of Biomedical Imaging og bioteknologi (NIBIB, P41 EB002030) og støttet av National Institutes of Health (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Anesthetic may vary per laboratory / institution) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | 10 mL vial |
| Surgery: | |||
| Needle tip, 27 GA x 1.25" | Materiel Services | 25251 | |
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 1 large hemostat forceps - curved or straight (~19 cm) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
| 2 standard hemostat forceps - straight serrated (14 cm) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 1 modified hemostat (with 15-gauge hole filed through the tip) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 15-gauge blunt or olive-tipped needle (perfusion needle) | Fisnar | 5601137 | |
| Perfusion: | |||
| HyPerfusion system or equivalent | |||
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| 4% Paraformaldehyde in 0.1 M Phosphate Buffer, pH 7.4 | |||
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Crushed ice | |||
| Water bath (37 °C) | |||
| Timer | |||
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (~12 cm) | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Medium curved or straight rongeurs (14-16 cm) or skull bone removal pliers | Fine Science Tools | 16020-14 | |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml glass vial | |||
| 40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) with sodium azide (90mg/l) | |||
References
- Cinar, O., Semiz, O., Can, A. A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections. Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).
- Fritz, M., Rinaldi, G. Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).
- Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats. Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).
- Jacobowitz, D. M. Removal of discrete fresh regions of rat brain. Brain Res. 80, 111-115 (1974).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).
- Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).
- Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration. J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).
- Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).
- Ramos-Vara, J. A. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues. J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).
- Walker, W. F. Vertebrate dissection. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).
- Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. J. Neurotrauma. Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).
