Summary
Sıçan kalp ile beyin mümkün olan en iyi koruma elde etmek için: Burada damar sistemi ile perfüze% 4 paraformaldehit kullanarak düşük maliyetli, hızlı, kontrollü ve düzgün fiksasyon prosedürü açıklar.
Abstract
Fiksasyon amacı hızlı ve düzgün bir hayat gibi devlet doku korumaktır. Sabitleştirici aynı oranda az 5,7 dokusunun tüm bölgelerde ulaşma değil küçük doku parçaları, bozulmamış beyin immersiyon fiksasyon için bir sorun teşkil gibi büyük örnekler için iyi fiksatif eserlerinde doğrudan doku yerleştirerek iken. Doku 12 korunabilir önce sık sık, hipoksiye cevap olarak değişiklikler başlar. Doğrudan dolaşım sistemine sabitleştirici perfüze avantajı kimyasal hızla doğal vasküler ağını kullanarak organizmanın her köşesine ulaşabilir olmasıdır. En etkin dolaşım sistemi kullanmak için, bakım fizyolojik baskılar 3 maç alınmalıdır. Bu fizyolojik baskılar kullanılan türlere bağlı olduğunu not etmek önemlidir. Perfüzyon fiksasyon teknikleri tespit edilecek doku bağlı olarak değişir ve nasıl doku fiksasyonu sonrasında işleme alınacaktır. Bu videodaSıçan kalbine immünhistokimya için beynin mümkün olan en iyi koruma elde etmek için: biz vasküler sistem aracılığı ile perfüze% 4 paraformaldehit kullanarak düşük maliyetli, hızlı, kontrollü ve düzgün fiksasyon prosedürü açıklar. Bu tekniğin ana avantajı (vs yerçekimi beslemeli sistemler) dolaşım sistemi en etkin şekilde kullanılmaktadır olmasıdır.
Protocol
1. Sabitleme hazırlayın
(Tablo Sabitleme ve Tamponlar bakınız.)
2. Perfüzyon Tamponlar hazırlayın
(Tablo Sabitleme ve Tamponlar bakınız.)
3. Aparat ve Anestezi hazırlayın
- 37 su banyosu, sıcak perfüzyon tampon kullanarak ° C Tamponu ile dolu bir bardak koyun çıkış vanası. Tamponu ile 50 ml'lik şırınga doldurun ve sabitleştirici tüp takmak. Kovma ve tampon çekerek tekrar tekrar tüp yıkayın.
- Boru tüm hava kabarcıkları ortadan kadar tamponu ile hat temizleyin. Bu satırların her biri hava kabarcıkları olmaması için perfüzyon başarısı için çok önemlidir.
- Şırınga çıkarın ve% 4 paraformaldehit sabitleştirici (oda sıcaklığında) konteyner bağlayın. Kabı içine yerleştirilmesi sırasında boru tüp ucunda hava kabarcıkları önlemek için, boru sıkıp böylece uç t tampon çıkıntı yapan bir damlakap içinde sıvı yüzeyi ile temas ediniz.
- Çıkış deliği (iğne ucu) kapatın. Sabitleştirici vana (beyaz) ile aynı konuma tampon vana (mavi) çevirin. Bu tampon hat sadece akış sağlayacaktır.
- Çıkış deliği açın ve tampon dolum hattı için A3 A1 ile adımı tekrarlayın. Tüm hava kabarcıkları yakın çıkış kapısı yok edilir sonra, şırınga kaldırmak ve tampon konteyner bağlamak, tüp içine hava kabarcıkları tanıtmak için özen gösterin.
- Lastik manometre Blub pompalayarak basıncı tutma olanağı için test sistemi. Sistem içinde hava sıkıştırma nedeniyle bazı direnç normal vardır.
- Erişimi kolay için sırayla cerrahi aletler Kur. Hava kabarcıklarının olasılığını ortadan kaldırmak için tamponu ile perfüzyon iğne doldurun.
- Ameliyat öncesinde, bir xylazine / ketamin karışımı (80 mg / kg vücut ağırlığı ketamin ve 10 mg / kg vücut ağırlığı xylazine) intraperitoneal (27 gauge iğne ve 1 cc şırınga) ile yönetilir. Anestezik ek yönetim anestezi cerrahi bir uçağı korumak için her operasyon sırasında gerektiğinde yapılacaktır.
4. Perfüzyon Cerrahi
- Hayvan anestezi cerrahi bir düzlem ulaştığında, ezilmiş buz dolu sığ tepsiye yerleştirin. (Anestezi derinliği belirlemek için tutam-yanıt yöntemi parmak kullanın. Hayvan devam etmeden önce tepkisiz olmalıdır).
- Sadece göğüs kafesinin altındaki kabuk ve karın duvarı üzerinden 5-6 cm lateral insizyon olun. Diyaframdan karaciğer dikkatle ayırın.
- Eğri, künt makas kullanırken diyafram küçük bir kesi olun. Parmağınızın konumu ve basınç diyaframın kesmek için yeteneği yardımcı olabilir.
- Plevra boşluğu göstermek için göğüs kafesinin tüm uzunluğu boyunca diyafram kesi devam edin.
- Dikkatli akciğerler yerinden, kaburga kemiklerinden birinin kenarı boyunca eğri, künt makas koyun ve bir cu yapmakkadar köprücük kemiği ile göğüs kafesini t. Karşı tarafta benzer bir kesim olun.
- Uzaklıkta sternum Kaldırma, kalp bağlayarak herhangi bir doku dikkatlice düzeltin. Hemostat ile sternum ucu Kelepçe ve başının üzerine hemostat yerleştirin. Düzgün yapılmazsa zaman, timus büyük damarların net bir görünüm sağlayan, sternum ile birlikte kalp uzak kaldırır.
- Iris makası kullanarak sol ventrikül posterior sonuna küçük bir kesi yapmak.
Büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
- Aorta içine kesme ventrikül yoluyla 15-gauge künt veya zeytin uçlu perfüzyon iğne geçirin. Ucu aort duvarı ile görünür olmalı ve brakial ve karotis arterler farklılaşmaya arkus ulaşması gerekir.
- Kalp bağlamak için bir hemostat kullanın, bu iğne tutan ve dışarıya sızmasını önler. Eğer istenirse, modifiye hemostat (bu hemostat Diseksiyon başlayana kadar yerinde kalması, fakat berraklığı için gelecek resimlerden atlanmıştır) iğne ucu etrafında aorta sıkıştırılması için kullanılabilir.
- Son olarak, inen aorta zarar vermeden mümkün olduğunca büyük bir çıkış oluşturmak için iris makası kullanarak hayvanın sağ atriuma bir kesi yapmak. Bu noktada, hayvan perfüze üzere hazırdır.
5.. Perfüzyon
- Açın ve herhangi bir hava kabarcığı tanıtmak için özen iğne tabanına çıkış noktası ekleyin.
- Hızlı ve eşit olarak 80 mm Hg basınç manometresi ampul kesecektir. Tampon infüzyon süresince bu basıncı koruyun. Zamanlayıcı başlatın.
- İğne açısını ayarlayın. Iğnenin açısı maksimum debisi (açı ayarlı akış değişim dikkat edin) ulaşılmasında kritik önem taşımaktadır.
- Buff geçişer vana (mavi) tampon neredeyse tamamlandıktan sonra (200 ml). Sıvı berraktı çalıştırıyor olmalıdır. Karaciğerin temizlenmesi iyi bir perfüzyon bir göstergesidir. Karaciğer bu noktada açık olmalıdır. Kayıtlarınız için zamanını gösterir.
- Fiksasyon titreme saniye içinde dikkat edilmelidir, bu tespitin doğru zamanı düşünülmelidir. Kayıtlarınız için zamanını gösterir.
- Basıncı yavaş yavaş sabit bir akış hızı korumak için 130 mm Hg maksimum 2 kadar artış olabilir.
- Sabitleştirici neredeyse tamamlandıktan sonra çıkış vanasını kapatın. Kayıtlarınız için zaman bitiş belirtiniz.
- Rat bu aşamada sert olmalıdır.
- Kullanılan paraformaldehit kurumunuzun mevzuata uygun olarak atmak için toplanan ve saklanan gerekir.
6. Diseksiyon 4,11
- Bir makas kullanarak kafasını çıkarın.
- Boyun burun kabuklarıyla birlikte orta hat kesi yapmak ve maruzkafatası.
- Kafatası tabanında maruz böylece kalan boyun kası kesip atın; makas veya rongeurs kullanarak herhangi bir kalıntı kas kaldırın.
- Dikkatli kafatasının iç yüzeyi boyunca makas kayar, bir tarafta foramen magnum içine iris bir makas keskin ucunu yerleştirin.
- Daha sonra, bir kesik posterior kafatası yüzeyinin distal kenarından uzanan edin. Karşı tarafta aynı bir kesim olun. Beyincik çevresindeki kafatası temizlemek için rongeurs kullanın.
- Ucu beyin hasarı önlemek için kesme gibi bıçak üzerinde yukarı kaldırarak, dorsal distal arka köşesine gelen kafatası distal ön kenarına gider gibi dikkatlice kafatasının iç yüzeyi boyunca makas kaydırın. Karşı taraf için tekrarlayın.
- Beyinden uzak kafatası dorsal soyma rongeurs kullanma. Rongeurs yanı kullanarak kafatasının iki uzak kesin.
- Spatula kullanarak, koku ampuller ve sinir bağlantılarının severBeynin ventral yüzeyi birlikte birtakım.
- Yavaşça hala iris makası kullanarak kafatası beyin bağlanan herhangi bir dura kırparak, uzak başından beyin kızdırmak.
- Beyin çıkarın ve fiksatif içeren sıvı, beyin kendisi hacmi en az 10x bir şişe yerleştirin. Flakon bazen girdap.
7. Post-fiksasyon ve Depolama
- Ara sıra girdapladıktan, 4 ° C'de 24 saat boyunca sabitleştirici beyin tutmak.
- 24 saat sonra, fosfat ile beyin yıkama medya 3 kez alış verişi ve her seferinde dönen tarafından tamponlu tuz.
- Beyinleri sonra fosfat saklanabilir sodyum azid ile tamponlanmış tuzlu su ya da HBHS ve 4 ° C de muhafaza
8. Temsilcisi Sonuçlar
Perfüzyon Başarının ilk göstergesi gibi burun gibi uzuvlar, kulaklar ve pençeleri ve bu timus bezi ve karaciğer (İHK Dünya) gibi iç organların temizlenmesi olduğunu.Beyin Brüt muayene kan (soluk sarı bir görünüm için beyaz) kan damarı void ortaya koymaktadır. Bu ve immunohistokimyasal boyama için kaderinde doku bölümleri içinde de geçerli olacak. Perfüzyon sonucu nihai göstergesi dokusunda ince bir durumdur. 1,6,7,8
| Sabitleme hazırlayın: |
| % 8 Paraformaldehyde stok hazırlayın |
|
| 0.2 M sodyum fosfat tamponu, pH 7.4 hazırlamak |
|
| % 4 Paraformaldehyde Sabitleme hazırlayın |
|
| Perfüzyon ve Depolama Tamponlar hazırlayın: |
| Fosfat hazırlamak Salin, pH 7.4 Tamponlu |
|
| HEPES Sodyum Azide pH 7.4 ile Hanks Çözüm (HBHS) Tamponlanmış |
|
Tablo 1. Sabitleme ve Tamponlar hazırlanması.
Şekil 1..
Şekil 2. Perfüzyon Aparatı I. hazırlanması sabitleştirici hattı ile başlayın. Hava kabarcıklarının boru yıkayın ve hızla kovma ve enjektöre ve hat üzerinden tampon çekerek tamponu ile doldurun. Iğnenin ucunda vanasını kapatın. Hava kabarcıkları tanıtımı olmadan sabitleştirici şişeye sabitleştirici yerleştirelim.
Şekil 3. Perfüzyon Apparatus II hazırlanması. 1. Iğnenin ucunda valfini açın. 2. Akışı için konumlandırmak için tampon vana (mavi) çevirin. 3. Hava kabarcıklarının boru yıkayın ve hızla kovma ve şırınga ile tampon çekerek tamponu ile doldurun. 4. Iğnenin ucunda vanayı kapatın. Tampon şişeye tüp yerleştirin. Sistem, doğru kapatılmış olduğundan emin olmak için test basıncımanometre ampul kadar pompalama ve mastar izleyerek ly. Aparat perfüzyon prosedürü için hazırdır.
Şekil 4. Tampon teslim pozisyonda Perfüzyon Aparatı.
Şekil 5. Perfüzyon Cerrahi I. a) kabuklarıyla ve karın duvarı üzerinden bir lateral insizyon olun. b) diyafram bir kesi yapın ve kalp açığa diyafram olandı. Kadar köprücük kemiği ile kaburgalar iki tarafında paralel kesimler olun. c) hemostat ile sternum ucu kelepçe ve başının üzerine hemostat yerleştirin.
Şekil 6. Perfüzyon Cerrahisi II. a) aorta içine kesme ventrikül yoluyla perfüzyon iğne geçirin. b) sabitleyinKalp bağlamak için hemostat perfüzyon iğne kullanımı bir takım. Değiştirilmiş bir hemostat bir ikinci küme de sızıntı önler için iğne ucu etrafında aorta sıkıştırılması için kullanılabilir. Iris makası kullanarak sol ventrikül posterior sonuna küçük bir kesi yapmak.
Şekil 7. Tampon Pompa hattında basınç oluşturmak için manometre ampul ile Perfüzyon. Valfi (1) açın ve iğne göbek iliştirin. Bu hava kabarcıkları tanıtıldı emin olmak önemlidir. 80 mm Hg basınç manometresi ampul pompalamak ve tampon infüzyon süresi boyunca bu baskıyı sürdürmek.
Şekil 8. Tamponu ile bir kez Sabitleme perfüzyon neredeyse (200 ml) akmasına izin vermek için sabitleştirici tampon valfi (1) geçiş bitirilir. Basıncı yavaş yavaş kadar artırılabilir130 mm Hg maksimum.
Şekil 9. Diseksiyon I. a) makas bir çift kullanarak kafasını çıkarın. b) boyun burun orta hat boyunca deride bir kesi yapmak ve kafatası maruz bırakmaktadır. kafatası tabanında maruz böylece c) Kalan boyun kası keserek. Kafatası yüzeyinde geniş açıklığı (foramen magnum) erişilebilir şekilde kafa tutun. Dikkatle foramen magnum içine iris bir makas keskin ucunu ve bir kesim yapmak. Karşı taraf için aynı manevra tekrarlayın. Beyincik çevresindeki kafatası temizlemek için rongeurs kullanın.
10 Şekil. Diseksiyon II. a) dikkatle kafatasının iç yüzeyi boyunca makas kaydırın. Eğer beyin hasarı önlemek için kesim gibi ucu yukarı kaldırın. Aynı için tekrarlayınkarşı tarafta. Beyinden uzak kafatası soyma rongeurs kullanın. b) kafatası ile resimde kaldırıldı ve beyin maruz. c) beyninin en ön yerde koku ampuller ve sinir bağlantılarını koparmak için bir spatula kullanın. Dikkatle kaldır kolaylığı için bağlantıları koparmak için beynin alt tarafı boyunca spatula ucu rehberlik. Beyin çıkarın ve sabitleştirici bir şişe yerleştirin.
Discussion
Başarılı bir ameliyat için ek notlar:
- Diyafram ihlal edildiğinde, hipoksi ve hiperkapni sonraki analiz yanıltabilecek geri dönüşümsüz fizyolojik değişiklikler başlatacaktır hızla koyun.
- İğne eklenmiş ve yerinde kelepçelenir zaman, kalan basınç iğne (flashback) tabanına kan iter. Gerçekte, daha büyük hayvanlar kuvvetli bir şekilde dışarı atılması kan olabilir. Kan, en az perfüzyon tamamlamak için bir engel teşkil edecektir hava kabarcıkları tanıtma önlemek için iğne tabanına ulaşmak önemlidir. Kan iğne üssünde görülürse, perfüzyon teçhizat çıkış portuna takarak tamponu ile iğne ve dolum çıkarın. Tampon ucu aracılığıyla çalıştırmak sonra, iğnenin kalbin içine yerleştirilemeyen olabilir.
- Aort içindeki iğnenin doğru yerleştirilmesi önemlidir, o kadar arkus olarak ulaşması gerekir.
- Birden perfüzyonsintigrafisiyle yer alıyorsanız bu t gerekli değildirBaşlangıçta her zaman o ayar. Kullanıcı her bir şişe (200ml artış hayvan / solüsyonu) tampon ve sabitleştirici her ikisi için uygun hacimde olması gerekir. Gerektiğinde ayrıca şişe doldurulmuş olabilir. Dikkate almak en önemli yönü hayvana kurulum (çıkış vanası) uzanan perfüzyon hattı dışarı kızarma edilir. Bir perfüzyon tamamlanmasından sonra, bu hattı içinde% 4 paraformaldehit sahip olacaktır. Tampon şişeden tüp çıkarın ve sabitleştirici temizlemek için su dolu bir 50 ml şırınga kullanın. Çıkış vanası paraformaldehit uygun şekilde bertaraf edilmesi için bir atık toplama kabı yerleştirilir emin olun. Bu üç kez tekrarlayın. 2,3 gösterilen aynı yöntem kullanılarak tamponu ile dolum.
- Fiksasyon için bu yöntemi deneyin ihtiyaçlarına göre tampon ve sabitleştirici diğer fiksatif (örneğin, EM için kullanılanlar gibi) hem de değiştirme yeteneği ile son derece uyumludur.
- Sistem aynı zamanda sık canlı dokuda çıkarılması için kullanılır. Bununsüreci bir sadece tampon teslim kullanır sadece (yine tüm sisteme takılıyken tampon şişe bir buz kovası yerleştirildi ve sabitleştirici şişe boş ama mühürlü olarak kurgusunda edilir). Bu, uygun basınçta soğuk bir tampon perfüzyon temin eder. Buradan sistemi ya (miktarı bir sorun değilse) tampon doğrudan boya ekleyerek veya tampon / tampon arasında boya çözümün minimal miktarda bir şırınga kullanın tarafından tamir edilebilir boyaların infüzyon adapte edilebilir - sabitleştirici adım.
- Vasküler döküm durumda, basınç kontrol tampon aşama a 50ml şırınga ya (tüp, kapak ve tutma cihazı doğrudan ya da bir teslimat atılabilir ikincil bağlanma için kullanılması gerekir ki viskozite ve döküm çözeltisi doğası katılaştırıcı nedeniyle çok önemlidir Mevcut sistem arayüzü için yapılan konteyner) kullanılmalıdır. Laboratuvarlarımız 'vasküler döküm perfüzyon cihazları tasarım ve üretim öncesinde. Bu nedenle biz st olamazbasıncı ölçümleri teslim yerinde doğru bir ölçüm olacağını yedik. Numaraları viskoz akışkanların başarılı teslim elde ayarlanması gerekiyor olabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Sinir İletişim Teknolojileri Merkezi (CNCT), Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Ulusal Enstitüsü (NIBIB, P41 EB002030) tarafından finanse edilen ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) tarafından desteklenen bir P41 Kaynak Merkezi tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Anesthetic may vary per laboratory / institution) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | 10 mL vial |
| Surgery: | |||
| Needle tip, 27 GA x 1.25" | Materiel Services | 25251 | |
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 1 large hemostat forceps - curved or straight (~19 cm) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
| 2 standard hemostat forceps - straight serrated (14 cm) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 1 modified hemostat (with 15-gauge hole filed through the tip) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 15-gauge blunt or olive-tipped needle (perfusion needle) | Fisnar | 5601137 | |
| Perfusion: | |||
| HyPerfusion system or equivalent | |||
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| 4% Paraformaldehyde in 0.1 M Phosphate Buffer, pH 7.4 | |||
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Crushed ice | |||
| Water bath (37 °C) | |||
| Timer | |||
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| Dissection: | |||
| Pair of standard sharp/blunt straight scissors (~12 cm) | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Medium curved or straight rongeurs (14-16 cm) or skull bone removal pliers | Fine Science Tools | 16020-14 | |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Post-Fixation & Storage: | |||
| 50 ml glass vial | |||
| 40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) with sodium azide (90mg/l) | |||
References
- Cinar, O., Semiz, O., Can, A. A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections. Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).
- Fritz, M., Rinaldi, G. Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).
- Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats. Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).
- Jacobowitz, D. M. Removal of discrete fresh regions of rat brain. Brain Res. 80, 111-115 (1974).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).
- Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).
- Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration. J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).
- Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).
- Ramos-Vara, J. A. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues. J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).
- Walker, W. F. Vertebrate dissection. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).
- Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. J. Neurotrauma. Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).
