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Neuroscience

Su larga scala di registrazione dei neuroni da sonde mobili in silicio Comportarsi Roditori

doi: 10.3791/3568 Published: March 4, 2012

Summary

Descriviamo i metodi per la registrazione su larga scala di più unità singole e potenziale del campo locale in roditori comportarsi con sonde di silicio. Unità di fabbricazione, l'attaccamento sonda l'unità e processi di impianto sonda sono illustrati in modo sufficientemente dettagliato per la replica facile.

Abstract

Una delle principali sfide nel campo delle neuroscienze è il collegamento comportamento per l'attività collettiva di gruppi neurali. Comprensione delle relazioni input-output dei neuroni e dei circuiti richiede metodi con la selettività spaziale e risoluzione temporale adeguata per l'analisi meccanicistica ensemble neurali del comportamento animale, la registrazione cioè di grandi campioni rappresentativo di isolati singoli neuroni. Ensemble monitoraggio dell'attività neuronale è progredita notevolmente negli ultimi dieci anni negli animali piccoli e grandi-cervello, tra cui soggetti umani 1-11. Più siti di registrazione con i dispositivi basati su silicio sono particolarmente efficaci a causa della loro scalabilità, volume piccolo e disegno geometrico.

Qui, descriviamo i metodi per la registrazione di molteplici singoli neuroni e le potenzialità in campo locale comportarsi roditori, utilizzando disponibili in commercio micro-lavorati sonde di silicio con misura componenti accessori. Ci sono due opzioni di base fo l'interfaccia sonde di silicio per preamplificatori: circuiti stampati e cavi flessibili. Le aziende fornitrici della sonda ( http://www.neuronexustech.com/ ; http://www.sbmicrosystems.com/ ; http://www.acreo.se/ ) di solito fornire il servizio di legame e fornire sonde legati ai circuiti stampati o cavi flessibili. Qui viene descritto l'impianto di un 4-gambo, 32-site sonda collegata al cavo flessibile poliimmide, e montato su un microdrive mobile. Ogni passo del preparato sonda, Microdrive costruzione e chirurgia è illustrata in modo che l'utente finale può facilmente replicare il processo.

Protocol

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1. Costruzione del Microdrive

Tutte le unità sono realizzati gli stessi elementi di base: una parte mobile, che porta l'elettrodo e una parte fissa, che viene ancorato al cranio. Un microdrive ideale permette liscia, ma abbastanza lunga corsa degli elettrodi in più a piccoli passi, è abbastanza robusto per evitare il movimento accidentale del dell'elettrodo, facile da manipolare da parte dello sperimentatore, senza interferire con il comportamento dell'animale, di piccole dimensioni e leggero nel peso. Come risultato di questi requisiti concorrenti, diversa bagno unità applicazioni diverse.

Solo 4 le parti sono necessari per costruire la nostra unità di base: un appartamento vite a testa in ottone, un dado di corrispondenza, un ponte di plastica preparato da una singola intestazione di riga e due pin personalizzato taglio tavole di bronzo.

  1. Break a 3-pin pezzi dall'intestazione
  2. Estrarre delicatamente il perno centrale.
  3. Allargare il foro di perforazione attraverso di essa con una dimensione di punta # 55.
  4. Tagliare una parolaletto utilizzando il 00-90 rubinetto.
  5. Tagliate due pezzi fuori della lastra di ottone.
  6. File i bordi delle piastre con un Dremmel.
  7. Praticare un foro nel mezzo di entrambi i pezzi con una dimensione di punta # 65.
  8. Montare i pezzi di trasmissione in modo che le tavole di bronzo sono toccare i perni. Per fare questo, inserire la vite di ottone attraverso, successivamente, la targhetta d'ottone, il foro filettato dei pin, la targhetta d'ottone secondo e il dado. Stringere la vite delicatamente in modo che il gruppo diventa stabile.
  9. Saldare il perno di estremità le tavole di bronzo.
  10. File l'estremità sporgente della vite.
  11. Saldare il dado alla vite. Fare attenzione a non saldare il dado per la targhetta d'ottone.
  12. Verificare il movimento del disco: girare la vite in senso orario per sollevare il ponte in plastica.

2. Preparazione della sonda di silicio

Prima di fissare la sonda all'unità, aggiungere isolamento supplementare per la zona di incollaggio della sonda per evitare cerebrospinal liquido (CSF) o umidità di produrre corto circuiti:

  1. Pesare e miscelare i componenti in elastomero Sylgard in un rapporto di 10:1.
  2. Usando un applicatore cotone affilata, applicare il Sylgard all'estremità superiore della sonda.
  3. Lasciare asciugare in un forno preriscaldato a 60 ° C per 2 ore.

Per garantire che i siti di registrazione sono privi di residui, le punte devono essere puliti:

  1. Preparare una diluizione del 4% di detergente Contrad.
  2. Sia la sonda immergere il detersivo a 63 ° C per almeno 2 ore.
  3. Sciacquare il detersivo off immergendo la sonda più volte in acqua distillata.

Prima di fissare la sonda per l'unità, l'impedenza di ogni sito registrazione deve essere controllato:

  1. Immergere la sonda nella soluzione salina allo 0,9%, e collegarlo a una impedenza-meter. Se i siti di registrazione troppi hanno impedenza corretta, ripetere i passaggi da 2,4-2,6 o di considerare l'utilizzo di una sonda diversa.Qui usiamo un modulo di impedenza condizionata da Federico Haer, Co. (FHC), combinato con un selettore di canale in casa. In alternativa, uno niPOD da NeuroNexus, Inc. o NanoZ da Neuralynx, Inc. permette il monitoraggio dell'impedenza di tutti i canali sonda simultaneamente.

3. Apposizione la sonda al microdrive

  1. Utilizzando una lama di rasoio, tagliato scanalature multiple nel ponte per creare una superficie ruvida.
  2. Appose la sonda per il ponte del drive. Questa procedura è fatto meglio sotto un microscopio operativo, tenendo l'azionamento con un morsetto e regolando la sonda da un micromanipolatore modo che i gambi sono perfettamente parallelo con la vite di azionamento. Questo assicura che durante l'avanzamento, il movimento della sonda gambi nel tessuto cerebrale senza 'tagliare' attraverso di essa. La profondità esatta delle punte delle sonde rispetto alla base dell'unità dovrebbe essere determinata in questa fase, prendendo in considerazione la profondità della struttura bersaglio dalla superficie dellocranio.
  3. La sonda viene poi fissato al ponte con cemento impugnatura.
  4. Opzionale: per visualizzare la traccia sonda nel cervello, soluzione DII (1-2% diluito in etanolo) può essere applicato alla parte posteriore della sonda in questa fase.

4. Preparazione del cranio

Prima dell'intervento, gli elettrodi di riferimento e di terra, e le parti della testina in gabbia di Faraday sono preparati:

  1. Tagliate due pezzi 2 "-lunghi di filo di rame, e saldare una estremità di ogni filo di rame isolato per circa 1 mm.
  2. Utilizzando un ago, raschiare la testa di uno, 00-90 1/8 "vite in acciaio inossidabile e saldare un pezzo di filo di rame ad esso. Saldatura tali viti in acciaio inossidabile a terra elettrodi richiede un flusso adeguato (per esempio, N-3 Tutte le finalità La flusso da-Co) e alte temperature punta di saldatura. accuratamente evitare saldatura di fluire nella scanalatura della vite. verrà utilizzato come elettrodo di massa. Ripetere con un'altra vite e filo di rame per prepararel'elettrodo di riferimento.
  3. Tagliare pezzi trapeziodal dalla maglia di rame. Questi pezzi da assemblare per proteggere il headstage.

Gli strumenti chirurgici e la preparazione sono gli stessi utilizzati in molti interventi di piccoli animali. L'intero intervento viene fatto in anestesia profonda isoflurano, utilizzando condizioni asettiche, secondo le linee guida approvate NIH. Si prega di notare che il (finto) Chirurgia mostrato in questo video è solo a scopo dimostrativo. Per scopi di visibilità appropriati e riprese, diverse fasi preparatorie, le precauzioni e le procedure chirurgiche postoperatorie non vengono mostrati / visibile o discusso.

Prima dell'intervento, tutti i componenti e le forniture devono essere sterilizzati, a seguito di procedure appropriate (vedi Linee guida per la chirurgia di sopravvivenza roditori; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf~~HEAD=NNS). Durante l'intervento chirurgico, un campo sterile sul cranio è preparato e isolato da teli sterili. Al termine della chirurgia, un antibiotici ad ampio spettro è unpplied a livello locale e una lunga durata d'azione analgesico è somministrato per via intramuscolare (ad esempio, buprenorfina, [Buprenex] 0.05 mg / kg). Inoltre, antidolorifico (ad esempio, ibuprofene) è fornita in acqua potabile a circa 60 mg/kg/24 ore per 5 giorni. Per le corrette procedure chirurgiche e anestesia, consultare fonti appropriate 12.

  1. Installare l'animale l'apparato stereotassico, barba e pulire il cuoio capelluto 13.
  2. Tagliare la pelle lungo la linea mediana e mettere da parte il cuoio capelluto. Rimuovere il periostio, pulire ed asciugare il cranio.
  3. Misurare la posizione e la distanza tra il bregma e lambda, e determinare le coordinate x e y del sito di impianto della sonda di conseguenza utilizzando un atlante stereotassico 14. Segna il sito raschiando una croce sul cranio con un bisturi.
  4. Forare il cranio con un rotondo punta testa (dimensioni ¼) e le viti di supporto di unità (in acciaio inox, 000-120, 1/16 ") a metà strada nell'osso, su piastre ossee diversi sulla sommità di unand sul lato del cranio. Le viti forniranno tasselli in modo sicuro bond il copricapo al cranio.
  5. Praticare dei fori al di sopra del cervelletto e inserire il suolo e elettrodi di riferimento preparate in fase 4.2. Per registrare potenziali di campo locale (LFP), la scelta del sito di riferimento è critica. Questo sito è stato scelto perché LFP cerebellare è il più piccolo di tutte le regioni corticali e degli artefatti muscolari sono minimi in questa posizione mediana.
  6. Applicare dentina attivatore (Metabond kit) utilizzando un pennello piccolo su tutta la superficie del cranio. Sciacquare con soluzione salina allo 0,9%.
  7. Applicare il cemento dentale (Metabond kit; seguire le istruzioni del produttore per la miscelazione), sul cranio, coprendo con cura le viti di ancoraggio e la terra e gli elettrodi di riferimento, ma lasciando il sito di impianto della sonda chiaro.
  8. Fissare i quattro lembi di maglia di rame (preparato nella fase 4.3) al cranio. Per questo, cementare la base ristretta di ciascuna di esse alle anteriori, i lati sinistro, destro e posteriore del cranio. Thrame e non dovrebbe mai essere in contatto diretto con l'osso, ma sempre separati da uno strato di cemento.

5. Preparazione della superficie del cervello

  1. Usando un po 'la testa rotonda trapano, praticare intorno al sito di impianto in più fasi, mentre spesso l'osso irrigazione con soluzione fisiologica.
  2. Rimuovere con attenzione il lembo osseo e irrigare la superficie del cervello.
  3. Per inserire un multiplo-codolo sonda, una striscia di grande dura viene rimosso. Due strumenti sono necessari per rimuovere la dura madre: un bisturi e un gancio preparato da un ago di insetto (in alternativa, un microelettrodo tungsteno standard). Piegare la punta dell'ago spingendo contro una superficie dura (ad esempio vetrino da microscopio vetro), e collegarlo a una maniglia (qui, un pezzo di legno, Q-tip, in alternativa, un porta-aghi microdissecting).
  4. Sollevare la dura con il gancio, e tagliare con un bisturi. Particolare cura viene posta per evitare di danneggiare la pia, le navi e la superficie della neocorteccia. Emorragia di piccole dimensioni può essere risoltodall'irrigazione soluzione salina. Se il sanguinamento maggiore si verifica o la neocorteccia è compromessa in alcun modo, si dovrebbe considerare che chiude la chirurgia e la preparazione di un altro animale.

6. Impianto la sonda

In questa fase, la densità e l'orientamento di navi superficie corticale sono attentamente valutati. Coordinate Stereotassica deve essere regolata, perché la sonda deve penetrare nel cervello in una zona libera da imbarcazioni più grandi.

Per l'impianto, il gruppo di azionamento può essere tenuto con un coccodrillo attaccato al titolare stereotassica. Visibilità senza interruzioni della superficie del cervello e le punte della sonda sono fondamentali per la penetrazione di successo.

  1. Lentamente abbassare la sonda fino a circa 1 mm al di sopra del target di riferimento, mentre costantemente irrigando la craniotomia con soluzione fisiologica. Per la registrazione neocorticale, le punte della sonda calata nella corteccia circa 0,5 mm e sollevato di nuovo vicino alla superficie. Sigillare la craniotomia applicando una miscela fusa calda di olio di paraffina e cera attraverso un ago (10-20g di cera in 10 ml di olio di paraffina, riscaldata a 65 ° C). Prima dell'applicazione, raffreddare la miscela a 30 ° C e verificare la densità. Dovrebbe essere abbastanza morbido per permettere un facile spostamento della sonda). Per facilitare la copertura completa, la miscela può essere fuso in situ avvicinando la cera indurito con la punta di un micro-cauterizer.
  2. Fissare la parte inferiore dell'unità al cranio con il cemento la presa, facendo attenzione a lasciare il dado libero di girare. È di estrema importanza per evitare accidentali "bump" dell'unità in questa fase, la sonda altrimenti danneggiare la corteccia. Dopo che l'unità è fissato al cranio, movimento regolare della sonda deve essere verificata.
  3. Cementare parte del connettore della sonda al cranio.

7. Costruire la testata on-gabbia di Faraday

  1. Tirare verso l'alto e montare le alette di rame mesh in un cilindro di protezione della sonda e DRIve. Il cilindro serve anche come uno scudo elettrico dal rumore ambientale e gli artefatti onda lenta prodotte dai baffi cariche nel comportamento degli animali.
  2. Regolare l'altezza cilindro tagliando il materiale in eccesso in modo che la rete di rame è a livello con la parte superiore del connettore della sonda.
  3. Saldare i fili di riferimento e viti di terra agli appositi contatti del connettore. Anche per saldare adiacenti lembi di maglia di rame insieme per garantire la loro continuità elettrica, e saldare il filo di terra alla maglia di rame.
  4. Applicare uno strato di cemento presa sulla maglia in rame per rinforzarlo e per evitare qualsiasi contatto diretto tra il metallo e la pelle dell'animale. Facoltativamente, applicare uno strato di resina epossidica per rafforzare ulteriormente il copricapo.
  5. Testare il movimento della vite di azionamento.
  6. Coprire la sommità della cuffia con un pezzo tagliato da un guanto di gomma.

8. Registrazione nella animali liberi di muoversi

  1. Dopo approprimangiato post-operatorio, collegare l'animale al sistema di registrazione con un headstage ad alta impedenza e un peso leggero, ultraflessibile multi-strand cavo. Bilanciare il peso della cuffia.
  2. Verificare la qualità della registrazione ogni giorno nel homecage. La posizione dei siti di registrazione viene giudicato da modelli unitari sia cottura e la forma dei potenziali di campo locali. Abbassare la sonda gradualmente ruotando la vite di piccoli incrementi (tipicamente 1/8 1/4 di giro al giorno, ossia 35-70 micrometri) fino alla struttura obiettivo viene raggiunto.

9. Risultati rappresentativi

Segnali elettrofisiologici (potenziale del campo locale e unità di attività) variano a seconda della struttura e registrato il comportamento corrente dell'animale. La figura 1 mostra alcuni esempi di 32 canali CA1 dell'ippocampo registrazioni mentre il ratto sta esplorando un campo aperto. Si noti la prominente 8 Hz (banda theta) oscillazione del potenziale del campo locale durante l'esplorazione con superimposed spiking su gambi e siti (esempi di picchi indicati dalla freccia). Per analizzare l'attività neuronale unità, i picchi vengono individuati e ordinati in singole unità che utilizzano cluster analysis della loro forme d'onda 15-16.

Figura 1
Figura 1. Registrazioni CA1 dell'ippocampo nei ratti comportamento utilizzando un 4 gambi x 8 siti sonda silicio. Le registrazioni sono a banda larga e campionato a 20 000 Hz, che permette di studiare sia le oscillazioni potenziali locali di campo (ad es band "theta" 8 ritmo Hz) e l'attività neuronale spiking.

Tabella 1
Tabella 1. Alternative alla reagenti e delle attrezzature utilizzate.

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Discussion

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Questo film illustra la procedura di impianto di sonde di silicio per cronici su larga scala le registrazioni nel ratto comportarsi. Passaggi critici per garantire registrazioni di qualità di attività neuronale nascono dalla fragilità sia biologico (tessuto cerebrale) e tecnica (silicio sonda) dei materiali. Particolare attenzione dovrebbe essere presa durante la manipolazione della sonda per evitare il contatto di denti da remoto con qualsiasi superficie "dura" (per esempio, i gambi si rompono se uno di loro ha cercato di impiantare nel cervello senza rimuovere la dura). Allo stesso modo, qualsiasi lesione al tessuto cerebrale (mentre si prepara la superficie del cervello per l'impianto, o da sbattere la sonda o su disco una volta che si sia impiantato) si tradurrebbe in danneggiare le cellule e compromettere la registrazione di attività dell'unità. Inoltre, il percorso elettrico di messa a terra deve essere controllata, come qualsiasi interruzione circuito tra il fluido cerebrospinale, la vite di terra, il filo di rame, i lembi di maglia in rame e il piedino di terra Connector, si tradurrebbe in un artefatti da movimento di grandi dimensioni e / o rumori di linea (50 Hz o 60 Hz). Se la gabbia di Faraday non è sufficientemente elevata, il sporgente micro-unità può agire come antenna. L'effetto antenna può essere impedito da terra l'unità come bene (a saldare un altro filo di rame tra il convertitore e il rame-mesh). Il percorso del segnale di riferimento deve essere controllato in modo simile.

Abbiamo illustrato l'impianto di una sonda di silicio, ma registrazioni siti multipli utilizzando sonde multiple e unità può essere facilmente realizzato dopo una certa pratica. Inoltre, stiamo usando dischi simili ma più piccolo per l'impianto di sonde di silicio nel cervello di topo. Le sonde di silicio disponibili in commercio e sonda-flex cavo-connettore componenti, con ridotte dimensioni di preamplificatori multicanale hanno drastica semplificazione del processo di preparazione rispetto alle tecniche precedenti. Oggi, è facile da registrare da 64 a 128 siti contemporaneamente in un roditore comportarsi come da 2 siti conelettrodi a filo appena un decennio fa.

La tecnologia Silicon sonda è in fase di rapido sviluppo e 17 un utilizzo diffuso. Preamplificatori può essere integrato con sonde 18, e piccoli headstages, multiplexer o sistemi telemetrici vengono prodotte commercialmente, spingendo i limiti delle registrazioni fisiologiche ulteriori limiti.

Recenti studi teorici e sperimentali con sonde di silicio 17,19 indicano che in modo appropriato raffinati larga scala metodi di registrazione, in combinazione con le nuove intuizioni matematiche e studi di modellazione, si sarà in grado di registrare da una frazione rappresentativo di grandi dimensioni o forse ogni neurone del volume del cervello rilevata da una sonda multiple gambo di silicio (in migliaia di cellule in ~ 1 micron 3, 5-17). Tuttavia, data la natura correlazionale di queste misurazioni, il rapporto causa-effetto tra i modelli di attività neuronali resta inevitabilmente ambigua. Una conoscenza approfondita dicome l'attività insieme coordinato emerge dalle sue componenti neuronali richiede almeno due passaggi aggiuntivi. Il primo è l'identificazione dei diversi tipi di cellule neuronali, ognuno dei quali contribuisce unicamente al comportamento di assemblaggio - letteralmente come membri di un'orchestra. La seconda fase, e complementari, è una manipolazione di principio dell'attività incurvamento celle identificate o gruppi di cellule, in una maniera ingegneri interrogare circuiti elettronici 20. Recentemente messo a punto strumenti molecolari optogenetic può essere usato per manipolare specifiche popolazioni cellulari dagli enti locali stimolazione luminosa 20-22. I metodi efficienti registrazioni scala grande combinazione ottica e con sonde di silicio 23 fornisce i mezzi sia per identificare e pilotare selettivamente specifiche popolazioni cellulari, consentendo quindi ad affrontare le relazioni causali nelle reti del cervello.

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Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Acknowledgments

Marie Curie Outgoing International Fellowship (dell'Unione europea FP/2007-2013 convenzioni di sovvenzione # 221834 e 254780), JD McDonnell Foundation, NSF sovvenzione SBE 0542013, National Institutes of Health di Grant NS034994, Istituto Nazionale di Salute Mentale di Grant MH5467 e la Howard Hughes Medical Institute (Janelia Farm Research Campus di sovvenzione).

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Silicon probe Buzsaki32, 4 shanks x 8 sites. Packaging: flexible polyamide cable Material NeuroNexus Technologies Probe: buzsaki32 Packaging: HC32 Recording probe
Round Brass Screw, 00-90 x 1/2 Round Brass Screws Material JIMorris R0090B500 Drive part
Brass Hex Nut, 00-90 Material JIMorris N0090B Drive part
Brass C260 Strip, ASTM-B36 Thickness: 0.025", Length: 12", Width: 1/2" Material Small Parts, Inc. B000FMYU72 Drive part
Connector Header, pitch 2mm, male, single row, straigt, 36 positions Material Digi-Key 2163S-36-ND Drive part
2-part Sylgard silicon Elastomer Material World Precision Instruments, Inc. SYLG184 To extra-insulate the probe
Decon Contrad 70 Liquid Detergent Reagent Fisher Scientific 04-355 Decon Laboratories No.:1002 To clean the recording sites
Impedance Conditioning Module Equipment FHC, Inc. 55-70-0 Impedance meter
niPOD - 32 channels Equipment NeuroNexus Technologies niPOD -32 Impedance meter
Grip Cement Industrial Grade Material Caulk Dentsply 675571 (powder) 675572 (solvent) Grip cement
1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (’DiI’; DiIC18(3)) Reagent Invitrogen D282 To stain the probe track in the brain
Stainless Steel Machine Screw, Binding Head, Slotted Drive, #00-90, 1/8" Material Small Parts, Inc. MX-0090-02B Ground and reference screws
Magnet wire, 20G, nylon-polyurethane coating, MW80 Material Small Parts, Inc. B000IJYRP2 Ground and reference wire
Stainless Steel Machine Screw, Binding Head Slotted Drive, #000-120, 1/16" Material Small Parts, Inc. MX-000120-01B Anchor screws
N-3 All purpose Flux Liquid Reagent La-Co (Markal) 23512 Allows to solder stainless-steel
MicroGrid Precision Expanded Copper Material Dexmet 3 CU6-050 FA Copper mesh for on-head Faraday cage
C&B-METABOND Quick! Cement System - Dentin Activator Material Parkell S380
C&B-METABOND Quick! Cement System - Dental cement Material Parkell S380
Sharp point tungsten needle and holder Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-6064 and RS-6061 To make the hook to lift the dura
Carbide Bur HP 1/4 Tool Henry Schein 9990013
Paraffin (Granules) Material Fisher Scientific P31-500
Mineral Oil, Light (NF/FCC) Material Fisher Scientific O121-1
GC ELECTRONICS 10-114 2-Part Epoxy Adhesive Material Newark Inc 00Z416
Type 1 LITZ 21 AWG 40/36 Red Single Polyurethane-Nylon (MW80-C) TO 0.041"+/-0.002" OD Material New England Biolabs N28-36E-400-2 To make the cable between the headstage and the amplifier
32-channel Very Large Scale Integration headstage, 20x gain Equipment Plexon HST/32V-G20 Headstage

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References

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Vandecasteele, M., M., S., Royer, S., Belluscio, M., Berényi, A., Diba, K., Fujisawa, S., Grosmark, A., Mao, D., Mizuseki, K., Patel, J., Stark, E., Sullivan, D., Watson, B., Buzsáki, G. Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents. J. Vis. Exp. (61), e3568, doi:10.3791/3568 (2012).More

Vandecasteele, M., M., S., Royer, S., Belluscio, M., Berényi, A., Diba, K., Fujisawa, S., Grosmark, A., Mao, D., Mizuseki, K., Patel, J., Stark, E., Sullivan, D., Watson, B., Buzsáki, G. Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents. J. Vis. Exp. (61), e3568, doi:10.3791/3568 (2012).

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