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Neuroscience

A gran escala de grabación de las neuronas por medio de sondas de silicio móviles en comportarse roedores

doi: 10.3791/3568 Published: March 4, 2012

Summary

Se describen métodos para la gran escala de grabación de múltiples unidades individuales y potencial del campo local en comportando los roedores con sondas de silicio. Unidad de fabricación, el apego de la sonda a la unidad y los procesos de implantación de la sonda se ilustran con suficiente detalle para facilitar la réplica.

Abstract

Un reto importante de la neurociencia es la vinculación de la conducta de la actividad colectiva de asambleas neuronales. Comprensión de las relaciones de insumo-producto de las neuronas y los circuitos requiere de métodos con la selectividad espacial y resolución temporal adecuada para el análisis mecanicista de los conjuntos neuronales en la conducta animal, es decir, la grabación de muestras representativa grandes de neuronas individuales aislados. Monitoreo conjunto de la actividad neuronal ha progresado notablemente en la última década en los animales pequeños y grandes cerebros, incluyendo seres humanos 1-11. De múltiples sitios de grabación con dispositivos basados ​​en silicio son particularmente eficaces debido a su escalabilidad, de pequeño volumen y el diseño geométrico.

Aquí se describen los métodos para el registro de múltiples neuronas individuales y los potenciales de campo local en comportando los roedores, utilizando comercialmente disponibles de micro-mecanizado sondas de silicio con componentes accesorios hechos a medida. Hay dos opciones básicas fo la interconexión de las sondas de silicio a previos: placas de circuitos impresos y cables flexibles. Empresas proveedoras de la sonda ( http://www.neuronexustech.com/ ; http://www.sbmicrosystems.com/ ; http://www.acreo.se/ ) suelen proporcionar el servicio de enlace y entregar las sondas unidas a las placas de circuitos impresos o cables flexibles. Aquí, se describe la implantación de un vástago 4-, 32-sitio sonda conectada al cable flexible de poliimida, y montado sobre un microdrive movible. Cada paso de la preparación de la sonda, la construcción microdrive y la cirugía se ilustra de modo que el usuario final puede fácilmente replicar el proceso.

Protocol

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1. La construcción de la Microdrive

Todas las unidades que están hechos de los mismos elementos básicos: una parte móvil, que lleva el electrodo y una parte fija, que está anclada en el cráneo. Un microdrive ideal permite suficiente recorrido suave pero largo del electrodo en múltiples pasos pequeños, es lo suficientemente resistente como para impedir el movimiento accidental del electrodo, fácil de manipular por el experimentador sin interferir con el comportamiento del animal, de tamaño pequeño y ligero de peso. Como resultado de estos requisitos en conflicto, conjunto de unidades de diferente diferentes aplicaciones.

Sólo 4 partes son necesarias para construir nuestra unidad básica: un tornillo de latón de cabeza plana, una tuerca de juego, un puente de plástico preparado a partir de un encabezado de fila único punto de conexión y dos cortados a planchas de bronce.

  1. Romper una pieza de 3 pines de la cabecera
  2. Retire con cuidado el pin central.
  3. Ampliar el agujero de perforación a través de él con un tamaño de broca # 55.
  4. Cortar una ªleer usando la llave de 00-90.
  5. Corte dos piezas de la placa de bronce.
  6. Presente los bordes de las placas con una dremmel.
  7. Haga un agujero en el medio de ambas piezas con un tamaño de broca # 65.
  8. Montar las piezas de accionamiento de manera que las placas de latón se toquen las clavijas. Para ello, inserte el tornillo de bronce a través de, sucesivamente, la placa de bronce, el orificio roscado de cabecera, la segunda placa de bronce, y la tuerca. Apretar el tornillo suavemente de modo que el conjunto se vuelve estable.
  9. Soldar el pin termina a las planchas de bronce.
  10. Presente el extremo saliente del tornillo.
  11. Soldadura de la tuerca en el tornillo. Tenga cuidado de no suelde la tuerca a la placa de bronce.
  12. Pon a prueba el movimiento de la unidad: girar el tornillo de las agujas del reloj para elevar el puente de plástico.

2. Preparación de la sonda de silicio

Antes de fijar la sonda a la unidad, agregar aislamiento extra a la zona de unión de la sonda para evitar cerebrospinal líquido cefalorraquídeo (LCR) o la humedad de la producción de cortocircuitos:

  1. Pesar y mezclar los componentes de elastómero Sylgard en una proporción de 10:1.
  2. El uso de un aplicador de algodón afilada, aplicar el Sylgard al extremo superior de la sonda.
  3. Que se seca en un horno precalentado a 60 ° C durante 2 horas.

Para asegurarse de que los sitios de registro están desprovistos de cualquier residuo, las puntas de las sondas se deben limpiar:

  1. Prepare una dilución del 4% de detergente Contrad.
  2. Que la sonda en remojo en el detergente a 63 ° C durante al menos 2 horas.
  3. Enjuagar el detergente fuera por inmersión de la sonda repetidamente en agua destilada.

Antes de fijar la sonda a la unidad, la impedancia de cada sitio de registro se debe comprobar:

  1. Sumerja la sonda en 0,9%, y conectarlo a una impedancia metros. Si los sitios de grabación demasiados tienen una impedancia incorrecta, repita los pasos 2.4-2.6 o considerar el uso de una sonda diferente.Aquí se utiliza un módulo de acondicionamiento de Impedancia de Federico Haer, Co. (FHC), combinada con un selector de canales de fabricación casera. Alternativamente, un niPOD por NeuroNexus, Inc. o NanoZ por Neuralynx, Inc. permite la monitorización de la impedancia de todos los canales de la sonda de forma simultánea.

3. Colocación de la sonda al microdrive

  1. Utilizando una cuchilla de afeitar, cortar ranuras múltiples en el puente para crear una superficie rugosa.
  2. Aproximar la sonda hasta el puente de la unidad. Este procedimiento se realiza mejor bajo un microscopio quirúrgico, manteniendo la unidad con una pinza y el ajuste de la sonda por un micromanipulador de modo que los vástagos son perfectamente paralelo con el tornillo de accionamiento. Esto asegura que durante el avance, el movimiento de la sonda vástagos en el tejido cerebral sin 'cortar' a través de ella. La profundidad exacta de las puntas de las sondas con relación a la base de la unidad se debe determinar en esta etapa, teniendo en cuenta la profundidad de la estructura de destino de la superficie delcráneo.
  3. La sonda se fija entonces al puente con cemento agarre.
  4. Opcional: para la visualización de la pista de la sonda en el cerebro, solución Dil (1-2% diluida en etanol) se puede aplicar a la parte posterior de la sonda en esta etapa.

4. Preparación del cráneo

Antes de la cirugía, los electrodos de referencia y de tierra, y las partes de la jaula de Faraday en la cabeza se preparan:

  1. Cortar dos piezas 2 "-largos de hilo de cobre y estaño un extremo de cada cable de cobre aislado durante aproximadamente 1 mm.
  2. Usando una aguja, raspar la cabeza de un 00-90, 1/8 "tornillo de acero inoxidable y la soldadura de una pieza de alambre de cobre a la misma. Soldadura de acero inoxidable tales tierra tornillo-electrodos requiere un flujo adecuado (por ejemplo, N-3 Todos propósito flujo de La-Co) y altas temperaturas punta del soldador. cuidadosamente evitar cualquier soldadura fluya en la ranura del tornillo. Esto será utilizado como el electrodo de tierra. Repetir con otro tornillo y el alambre de cobre para prepararel electrodo de referencia.
  3. Corte los pedazos trapezoidal de malla de cobre. Estas piezas serán ensamblados para proteger el cabezal de la platina.

Los instrumentos quirúrgicos y la preparación son los mismos tal como se utiliza en muchas de las cirugías de pequeños animales. Toda la cirugía se realiza bajo anestesia con isoflurano profundo, utilizando las condiciones de asepsia, de acuerdo con las directrices aprobadas por el NIH. Tenga en cuenta que la cirugía (simulacro) se muestra en este video es para fines de demostración. Para los fines pertinentes visibilidad y el rodaje, varias medidas preparatorias, las precauciones y procedimientos quirúrgicos postoperatorios no se muestran / visible o discutido.

Antes de la cirugía, todos los componentes y materiales deben ser esterilizados, siguiendo los procedimientos adecuados (véase la Guía de supervivencia para la cirugía de roedores; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf~~HEAD=NNS). Durante la cirugía, un campo estéril en el cráneo está preparado y aislado por paños estériles. Al final de la cirugía, unos antibióticos de amplio espectro es unapplied a nivel local y un analgésico de acción prolongada que se administra por vía intramuscular (por ejemplo, buprenorfina, [Buprenex] 0,05 mg / kg). Además, analgésico (por ejemplo, ibuprofeno) se proporciona en el agua potable a aproximadamente 60 mg/kg/24 horas durante 5 días. Para los procedimientos adecuados de anestésicos y quirúrgicos, consultar la información pertinente 12.

  1. Instale el animal en el aparato estereotáxico, rasura y limpia el cuero cabelludo 13.
  2. Cortar la piel a lo largo de la línea media y dejar de lado el cuero cabelludo. Retire el periostio, limpiar y secar el cráneo.
  3. Mida la ubicación y distancia entre bregma y lambda, y determinar las coordenadas x e y de la zona de implantación de la sonda de acuerdo con un atlas estereotáxico 14. Marcar el sitio raspando una cruz en el cráneo con un bisturí.
  4. Perforar el cráneo usando un poco la cabeza de perforación redonda (tamaño ¼) y los tornillos de la unidad de apoyo (de acero inoxidable, 000-120, 1/16 ") a mitad de camino en el hueso, en las placas óseas diferentes en la parte superior unª en el lado del cráneo. Los tornillos se ofrecen anclajes para fijar la fianza del casco en el cráneo.
  5. Perforar agujeros por encima del cerebelo e inserte la tierra y electrodos de referencia preparados en el paso 4.2. Para el registro de potenciales de campo locales (LFP), la elección del sitio de referencia es fundamental. Este sitio se eligió porque LFP cerebelosa es la más pequeña de todas las regiones corticales y artefactos musculares son mínimas en este lugar la línea media.
  6. Aplicar la dentina activador (Metabond kit) utilizando un pequeño cepillo sobre toda la superficie del cráneo. Enjuague con solución salina al 0,9%.
  7. Aplique el cemento dental (Metabond kit, siga las instrucciones del fabricante para la mezcla) en el cráneo, cubriendo bien los tornillos de anclaje y el suelo y los electrodos de referencia, pero dejando el sitio de implantación de la sonda claro.
  8. Fije las aletas de cobre cuatro mallas (preparado en el paso 4.3) en el cráneo. Para ello, consolidar la estrecha base de cada una de ellas a las partes anteriores, izquierda, derecha y posterior del cráneo. Thcobre e nunca debe estar en contacto directo con el hueso pero siempre separados por una capa de cemento.

5. Preparación de la superficie del cerebro

  1. Usando un poco la cabeza de perforación redonda, perforar alrededor del sitio de implantación en múltiples etapas, mientras que con frecuencia la irrigación del hueso con solución salina.
  2. Retire con cuidado el colgajo óseo y el riego de la superficie del cerebro.
  3. Para insertar una sonda de múltiples vástago, una tira de gran duración se elimina. Dos herramientas son necesarias para eliminar la dura: un bisturí y un gancho preparado a partir de una aguja de insectos (como alternativa, un microelectrodo de tungsteno estándar). Doble la punta de la aguja empujando contra una superficie dura (por ejemplo, diapositivas de vidrio para microscopio), y adjuntarlo a un mango (en este caso, un pedazo de madera Q-tip, alternativamente, el titular de microdissecting aguja).
  4. Levante la duramadre con el gancho, y la cortó con un bisturí. Se tiene especial cuidado para evitar dañar la pia, los vasos y la superficie de la corteza cerebral. Pequeño sangrado puede ser resueltopor la irrigación con solución salina. Si ocurra un sangrado mayor o el neocórtex está comprometida en modo alguno, se debe considerar la terminación de la cirugía y la preparación de otro animal.

6. La implantación de la sonda

En esta etapa, la densidad y la orientación de los vasos superficiales corticales son evaluados cuidadosamente. Coordenadas estereotáxicas se debe ajustar, ya que la sonda tiene que penetrar en el cerebro en un área libre de buques de mayor tamaño.

Para la implantación, el conjunto de la unidad se hace con una pinza unida a la titular de la estereotáxica. Visibilidad ininterrumpida de la superficie del cerebro y las puntas de la sonda son críticos para la penetración exitosa.

  1. Baje lentamente la sonda hasta aproximadamente 1 mm por encima del objetivo previsto, mientras que el riego constante de la craneotomía con solución salina. Para la grabación de la neocorteza, las puntas de las sondas se bajan en la corteza de aproximadamente 0,5 mm y la levantó de nuevo cerca de la superficie. Sellar la craneotomía mediante la aplicación de una mezcla fundida caliente de aceite de parafina y cera a través de una aguja (10-20g de cera en 10 ml de aceite de parafina, se calentó a 65 ° C). Antes de la aplicación, enfriar la mezcla a 30 ° C y probar la densidad. Debe ser lo suficientemente suave para permitir el movimiento de la sonda fácil). Para facilitar la cobertura completa, la mezcla puede ser fundido in situ por acercarse a la cera endurecida con la punta de un cauterizador micro.
  2. Coloque la parte inferior de la unidad en el cráneo con cemento agarre, teniendo cuidado de dejar la tuerca gire libremente. Es de suma importancia para evitar cualquier accidente "golpe" de la unidad en esta etapa, de lo contrario la sonda puede dañar la corteza. Después de la unidad se fija en el cráneo, el movimiento suave de la sonda debe ser verificado.
  3. Cemente la parte del conector de la sonda en el cráneo.

7. La construcción de la cabeza en jaula de Faraday

  1. Tire hacia arriba y montar las tapas de malla de cobre en un cilindro de protección alrededor de la sonda y el drive. El cilindro también sirve como un blindaje eléctrico contra el ruido ambiental y los artefactos de onda lenta producidos por las patillas cargadas en el animal comportarse.
  2. Ajustar la altura del cilindro cortando el exceso de material por lo que la malla de cobre está a nivel con la parte superior del conector de la sonda.
  3. Soldar los cables de la referencia y tornillos de tierra a los pines correspondientes del conector. Además de soldadura aletas adyacentes malla de cobre juntos para asegurar su continuidad eléctrica, y soldar el cable de tierra a la malla de cobre.
  4. Aplicar una capa de cemento agarre sobre la malla de cobre para reforzarla y para evitar cualquier contacto directo entre el metal y la piel del animal. Si lo desea, aplique una capa de resina epoxi para reforzar aún más el casco.
  5. Probar el movimiento del tornillo de accionamiento.
  6. Cubrir la parte superior del casco con un corte pieza de un guante de caucho.

8. Grabación en el animal que se mueve libremente

  1. Después de aprocomió cuidados post-operatorios, conecte el animal con el sistema de grabación mediante un cabezal de alta impedancia y un cable ligero y ultraflexible multi-hilo. Contrarrestar el peso del casco.
  2. Pon a prueba la calidad de la grabación de cada día en el homecage. La posición de los sitios de grabación se juzga por ambos patrones de unidad de disparo y la forma de los potenciales de campo local. Bajar la sonda gradualmente haciendo girar el tornillo en pequeños incrementos (típicamente 1/8 a 1/4 vuelta por día, es decir, 35-70 micrómetros) hasta que la estructura objetivo se alcanza.

9. Los resultados representativos

Señales electrofisiológicas (potenciales de campo local y la actividad de la unidad) varían dependiendo de la estructura de grabado y el comportamiento actual de los animales. La figura 1 muestra ejemplos de 32 canales de CA1 del hipocampo de las grabaciones, mientras que la rata está explorando un campo abierto. Nótese la prominente 8 Hz (theta banda) de oscilación del potencial del campo local durante la exploración con apoyoerimposed adición de espigas y sitios (por ejemplo de los picos indicados por puntas de flecha). Para analizar la actividad de la unidad neuronal, los picos se detectan y se clasifican en unidades individuales mediante el análisis conjunto de sus formas de onda 15-16.

Figura 1
Figura 1. CA1 del hipocampo en las grabaciones de la rata comportarse con una 4 x 8 vástagos de los sitios de la sonda de silicio. Las grabaciones son de banda ancha y la muestra a 20 000 Hz, lo que permite estudiar tanto las oscilaciones de campo locales potenciales (por ejemplo, "zeta" banda de 8 ritmo Hz) y un rápido aumento de la actividad neuronal.

Tabla 1
Tabla 1. Las alternativas a los reactivos y el equipo utilizados.

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Discussion

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Esta película muestra el proceso de implantación de las sondas de silicio para la crónica a gran escala las grabaciones en la rata se comporta. Los pasos críticos para garantizar la calidad de grabación de la actividad neuronal se derivan de la fragilidad de tanto biológicas (tejido cerebral) y material técnico de silicio (la sonda). Especial cuidado se debe tomar durante la manipulación de la sonda para evitar cualquier contacto de rejones con cualquier remota "duro" de la superficie (por ejemplo, los vástagos se rompería si se trató de implantar en el cerebro sin necesidad de retirar la duramadre). Del mismo modo, cualquier daño al tejido cerebral (mientras se prepara la superficie del cerebro para la implantación, o de tropezar con la sonda o la unidad una vez que se implanta) daría lugar a daños en las células y poner en peligro la unidad de registro de la actividad. Además, el recorrido eléctrico de la conexión a tierra debe ser controlada, como cualquier interrupción del circuito entre el fluido cerebroespinal, el tornillo de tierra, el alambre de cobre, las aletas de malla de cobre y el conector de tierra en el Connector, se traduciría en unos grandes artefactos de movimiento y / o ruido de línea (50 Hz o 60 Hz). Si la jaula de Faraday no es suficientemente alta, el saliente de micro-unidad puede actuar como una antena. El efecto de la antena puede ser impedido por la unidad de conexión a tierra, así (soldadura otro alambre de cobre entre la unidad y la malla de cobre-). La trayectoria de la señal de referencia debe ser igualmente revisadas.

Nos ilustra la implantación de una sonda de silicio, pero varias grabaciones in situ con sondas múltiples y unidades puede llevarse a cabo fácilmente después de alguna práctica. Además, se están utilizando las unidades similares pero de menor tamaño para la implantación de las sondas de silicona en el cerebro del ratón. Las sondas de silicio disponibles en el comercio y sonda-flex conector del cable-componentes, junto con el pequeño tamaño de preamplificadores multicanal han drásticamente simplificado el proceso de preparación en comparación con las técnicas anteriores. Hoy en día, es tan fácil de grabar de 64 a 128 sitios de forma simultánea en un roedor se comporta como de 2 sitios conelectrodos de alambre hace apenas una década.

Silicio sonda de la tecnología está experimentando un rápido desarrollo y 17 de uso generalizado. Preamplificadores se puede integrar con las sondas de 18 y más pequeños cabezales, multiplexores y sistemas telemétricos están siendo fabricados comercialmente, ampliando los límites de las grabaciones fisiológicas a otros límites.

Recientes estudios teóricos y experimentales con las sondas de silicio 17,19 indican que con los métodos de registro debidamente refinados a gran escala, en combinación con nuevos elementos matemáticos y estudios de modelado, uno será capaz de grabar desde una fracción representativa de gran tamaño o tal vez todas las neuronas del volumen del cerebro supervisado por un vástago de la sonda de silicio múltiples (miles de células en aproximadamente 1 m 3; 5-17). Sin embargo, dada la naturaleza correlacional de estas mediciones, la relación causa-efecto entre los patrones de actividad neuronal sigue siendo inevitablemente ambigua. Una comprensión profunda decómo la actividad conjunto coordinado emerge de sus componentes neuronales requiere al menos dos pasos adicionales. La primera es la identificación de los múltiples tipos de células neuronales, cada uno de los que únicamente contribuye a la conducta de montaje - literalmente, como miembros de una orquesta. El segundo paso, y complementaria, es una manipulación de principios de la actividad de adición de las células identificadas o grupos de células, en una manera interrogar a los ingenieros de circuitos electrónicos 20. Las herramientas moleculares desarrolladas recientemente optogenética puede ser usado para manipular las poblaciones específicas de células por estimulación local de la luz 20-22. Los métodos eficientes de combinación de grabaciones de gran escala y la óptica con 23 sondas de silicona proporciona los medios para identificar y selectiva tanto en la conducción poblaciones celulares específicas, lo que permitirá hacer frente a las relaciones causales en las redes cerebrales.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Marie Curie de salida de Becas (FP/2007-2013 Unión Europea acuerdos de subvención # 221834 y 254780), JD McDonnell Foundation, NSF Grant SBE 0542013, los Institutos Nacionales de Salud Grant NS034994, Instituto Nacional de Salud Mental Grant MH5467 y el Instituto Médico Howard Hughes (Granja Janelia de Investigación del Campus de subvención).

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Silicon probe Buzsaki32, 4 shanks x 8 sites. Packaging: flexible polyamide cable Material NeuroNexus Technologies Probe: buzsaki32 Packaging: HC32 Recording probe
Round Brass Screw, 00-90 x 1/2 Round Brass Screws Material JIMorris R0090B500 Drive part
Brass Hex Nut, 00-90 Material JIMorris N0090B Drive part
Brass C260 Strip, ASTM-B36 Thickness: 0.025", Length: 12", Width: 1/2" Material Small Parts, Inc. B000FMYU72 Drive part
Connector Header, pitch 2mm, male, single row, straigt, 36 positions Material Digi-Key 2163S-36-ND Drive part
2-part Sylgard silicon Elastomer Material World Precision Instruments, Inc. SYLG184 To extra-insulate the probe
Decon Contrad 70 Liquid Detergent Reagent Fisher Scientific 04-355 Decon Laboratories No.:1002 To clean the recording sites
Impedance Conditioning Module Equipment FHC, Inc. 55-70-0 Impedance meter
niPOD - 32 channels Equipment NeuroNexus Technologies niPOD -32 Impedance meter
Grip Cement Industrial Grade Material Caulk Dentsply 675571 (powder) 675572 (solvent) Grip cement
1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (’DiI’; DiIC18(3)) Reagent Invitrogen D282 To stain the probe track in the brain
Stainless Steel Machine Screw, Binding Head, Slotted Drive, #00-90, 1/8" Material Small Parts, Inc. MX-0090-02B Ground and reference screws
Magnet wire, 20G, nylon-polyurethane coating, MW80 Material Small Parts, Inc. B000IJYRP2 Ground and reference wire
Stainless Steel Machine Screw, Binding Head Slotted Drive, #000-120, 1/16" Material Small Parts, Inc. MX-000120-01B Anchor screws
N-3 All purpose Flux Liquid Reagent La-Co (Markal) 23512 Allows to solder stainless-steel
MicroGrid Precision Expanded Copper Material Dexmet 3 CU6-050 FA Copper mesh for on-head Faraday cage
C&B-METABOND Quick! Cement System - Dentin Activator Material Parkell S380
C&B-METABOND Quick! Cement System - Dental cement Material Parkell S380
Sharp point tungsten needle and holder Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-6064 and RS-6061 To make the hook to lift the dura
Carbide Bur HP 1/4 Tool Henry Schein 9990013
Paraffin (Granules) Material Fisher Scientific P31-500
Mineral Oil, Light (NF/FCC) Material Fisher Scientific O121-1
GC ELECTRONICS 10-114 2-Part Epoxy Adhesive Material Newark Inc 00Z416
Type 1 LITZ 21 AWG 40/36 Red Single Polyurethane-Nylon (MW80-C) TO 0.041"+/-0.002" OD Material New England Biolabs N28-36E-400-2 To make the cable between the headstage and the amplifier
32-channel Very Large Scale Integration headstage, 20x gain Equipment Plexon HST/32V-G20 Headstage

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References

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Vandecasteele, M., M., S., Royer, S., Belluscio, M., Berényi, A., Diba, K., Fujisawa, S., Grosmark, A., Mao, D., Mizuseki, K., Patel, J., Stark, E., Sullivan, D., Watson, B., Buzsáki, G. Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents. J. Vis. Exp. (61), e3568, doi:10.3791/3568 (2012).More

Vandecasteele, M., M., S., Royer, S., Belluscio, M., Berényi, A., Diba, K., Fujisawa, S., Grosmark, A., Mao, D., Mizuseki, K., Patel, J., Stark, E., Sullivan, D., Watson, B., Buzsáki, G. Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents. J. Vis. Exp. (61), e3568, doi:10.3791/3568 (2012).

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