Summary
このプロトコルの詳細、大きな一枚膜脂質小胞へのペプチド移行の定量的測定のための方法。また、このメソッドは、膜の転座の割合に関する情報を提供し、効率的かつ自発的に脂質二重層を横切るペプチドを同定するために使用することができます。
Abstract
容易に細胞膜の受容体1の支援なしに細胞膜を通過ペプチドに積極的に関心があります。これらの多くは、頻繁に1から3の薬物送達ベクターとしての可能性で注目されて細胞透過性ペプチド、と呼ばれています。また、特に4,5以外の膜溶解メカニズム、細胞溶解を引き起こすことなく、細菌の膜を通過し、細胞内プロセス6,7に干渉することによって細胞を殺すものを介して動作抗菌ペプチドの関心が高まっている。実際に、著者らはますます細胞透過性と抗菌ペプチド1,8の間の関係を指摘している。膜の転座とペプチドの構造と転位する能力との関係のプロセスのしっかりとした理解は、転座のための効果的な、再現性のアッセイを必要とします。いくつかのグループは、大きなunilamelに転座を測定する手法を提案したLAR脂質小胞（LUVs）9-13 LUVsは、細菌と真核生物の細胞膜の有用なモデルとなると頻繁に14,15ペプチド蛍光の研究に使用されています。ここで、我々はまずそのようなマガイニンとbuforin II 16,17のような抗菌性ペプチドを、考慮する松崎と共同研究者によって開発された方法の我々のアプリケーションについて説明します。この方法のために我々のプロトコルを提供することに加えて、我々はまた、このアッセイを用いて転座の能力を定量データ分析への直接的なアプローチを提示する。他人と比較してこの転座アッセイの利点は、それが膜の転座の割合に関する情報を提供する可能性を秘めているとトリプトファン含有ペプチドにペプチドの特性18を 、変えることができる蛍光標識、の加算を必要としないことです。簡潔に、脂質小胞へのトランスロケーション機能は、ネイティブのトリプトファン残基とdの間にフォスターの共鳴エネルギー移動（FRET）の関数として測定されますタンパク質が外部に関連付けられているansylホスファチジルエタノールアミンは、膜（図1）LUVは。彼らはLUVsでカプセル化された制約のないトリプシンが発生したとして、細胞透過性ペプチドは、マブラヴ膜とFRETシグナルの減少から解離につながる、切断されています。 LUVsがトリプシンおよびトリプシンインヒビター、またはときに自発的に脂質膜を通過していないペプチドをトリプシン含有LUVsにさらされている両方が含まれているときに転位ペプチドで観察されたFRETシグナルの低下は、同一のペプチドで観察されたものよりかなり大きいです。蛍光の変化は、時間の経過ペプチド転座の直接定量を提供します。
Protocol
1。ラージユニラメラ脂質小胞の調製（LUVs）
- アッセイ19細胞膜を模倣として機能するLUVsを準備します。
- ミックスホスファチジルコリン（POPC、760.10グラム/モル）、ホスファチジルグリセロール（POPG. 770.99グラム/モル）、5 - ジメチルアミノナフタレン-1 - スルホニル50でクロロホルムに溶解したホスファチジルエタノールアミン（DNS - POPE、994.350グラム/モル）（アヴァンティ極性脂質） ：45:5の比率。すべてのアッセイは、実験群とコントロールの両方LUVsの別々の準備を必要とするとして、2つの脂質ケーキのバイアルを準備する必要があります。総脂質の0.376ミリグラム（0.188 mgをPOPC、0.169 mgのPOPG、および0.019 mgのDNS - POPE）は通常、単一の転座試験のために十分な小胞を作るのに十分です。
- N 2ガ ス流を用いてクロロホルム蒸発。
- 真空デシケーター内の脂質のケーキ9月14日時間を乾かします。
- 株式の10 mM HEPES緩衝液（10mMのHEPES、238.3グラム/モル、45 mMのNaCl、58.44グラム/モル、1mMのEDTA、372.24グラム/モルpH7.4）を準備します。 HEPESバッファーはSTです。4℃で論理和
- 上記で調製した10 mMのHEPES緩衝液に0.4mMのブタトリプシン（23.3キロ/モル）のストック溶液を調製。トリプシンは、-20℃で保存されており、私たちの実践で、通常使用の前に2つ以上の凍結融解サイクルを受けることはありません。
- -20℃で、10mMのHEPES緩衝液、店舗には4.0 mMのボーマン - バークトリプシンインヒビター（8キロ/モル）のストック溶液を調製私たちの使用では、この株式は毎月補充されると、それが再び行われる前に通常3つ以上の凍結/融解サイクルを受けることはありません。
- 0.4mMのトリプシンの株式や乾燥脂質のケーキ〜10 mMのHEPES緩衝液の等量を追加することにより、0.2mMのトリプシン溶液で再構成実験的な多重膜小胞（MLVは）。 0.376 mg総脂質の一つのサンプルの場合は、トリプシン溶液とHEPES緩衝液150μL150μLの混合物で十分です。
- 0の等量を追加することによって、0.2mMのトリプシンと2.0 mMのボーマン - バークトリプシンインヒビターとソリューションで再構成制御MLVは。4mMのトリプシンの株式や乾燥脂質ケーキ〜4.0 mMのトリプシンインヒビター。 0.376 mg総脂質の一つのサンプルの場合は、トリプシン溶液とトリプシンインヒビターの150μLの150μLの混合物で十分です。
- ガラスバイアルから1.7 mlのマイクロ遠心チューブに転送MLVソリューション。
- 液体窒素で5凍結/解凍サイクルに従うMLVソリューション。
- 各テフロン押出片にHEPES緩衝液で湿らせた二つのフィルターをサポートして配置することにより、脂質の押出機（アヴァンティ極性脂質）を準備します。 twoテフロン押出片の間に0.1μmの孔（ワットマン、イギリス）とnucleporeトラックエッチング膜を置き、金属の押出機のキャニスター内の押出機のピースを置きます。押出機のキャニスターの金属の上部を締めてホルダーにそれを置く前に、2つの押出機の片上のドーナツのスペーサを置きます。
- 小胞のサンプルの損失を防ぐために、250μLのガラスシリンジを用いて、500μLの10mM HEPES緩衝液で押出機内空隙容積を埋める。</ LI>
- 押出機にそれぞれのMLVのサンプルをロードし、膜を介して均一な単層ベシクルのサイズを確保するために少なくとも21回のサンプルを押してください。 LUVsは、MLVのソリューションは、次の押し出しから取得されます。
- 4℃店舗LUVs℃、48時間以内に使用する。
2。定量化は、濃度をLUVは
- マブラヴ濃度は、試料20の全リンの含有量を測定することによって定量した。
- 室温でnanopure水に濡らしたりの8.9 NH 2 SO 4を準備します。
- nanopure水では2.5％w / vのアンモニウムモリブデン酸VI（588.04グラム/モル）溶液を調製します。 10パーセントw / vのアスコルビン酸（176.1グラム/モル）nanopure水の溶液を調製します。ホイルで管を覆うことにより、露光からアスコルビン酸溶液を保護する。最大2ヶ月間4℃で両方のソリューションを保管してください。
- 0.65 mMリン酸緩衝液（一塩基性無水リン酸ナトリウム、120 g /モル）を準備します。
- 6つの標準TUを準備BES。規格は0.0μL、50μL（0.0325μモル）、100μL（0.065μモル）、175μL（0.114μモル）、250μL（0.163μモル）、またはリン溶液350μL（0.228μモル）を含める必要があります。
- 三連でサンプルチューブをLuvの準備。各サンプルチューブはLUVsの約0.1μモルが含まれている必要があります。実験群とコントロールは、濃度を個別に測定する必要がありますLUVは。
- ボーマン - バークインヒビターの粉の任意の乾燥リン酸塩を補正するためには、コントロールは空白が準備されている必要がありますLUVは。サンプルチューブをLuvのコントロールに配置されたとしてブランク、0.2 mMのtrypsin/2.0 mMのボーマン - バーク阻害剤溶液の同量が含まれている必要があります。
- 標準試料、およびブランクチューブのそれぞれに8.9 NH 2 SO 4の代わりに450μL。
- 熱のサンプル、標準、および175から210で25分間の空白°オーブンでC。
- 全てのチューブを取り外し、それらを冷却することができます。 TUのそれぞれに30％H 2 O 2の150μLを追加BES。
- 熱のサンプル、標準、および175から210で30分間の空白℃、
- サンプル、基準、および熱からブランクを取り外します。ソリューションのいずれかがまだ無色ではない場合、175から210でさらに15分間、すべてのチューブと熱℃に50μLH 2 O 2を追加
- 3.9 mLのnanopure H 2 O、0.5 mLのモリブデン酸アンモニウム溶液と各チューブに0.5 mLのアスコルビン酸溶液を加える。
- 沸騰水浴中で5〜7分間、すべてのチューブを加熱する。
- Agilentの8453紫外可視分光光度計を用いて820 nmで、それぞれ標準とサンプルの吸光度を測定します。 0.0ミリモルのリンを含むチューブは、すべての規格の空白として使用され、実験的にサンプルをLUVはされるべきである。 0.2mMのtrypsin/2.0 mMのボーマン - バーク阻害剤溶液を含むチューブはサンプルをマブラヴ制御するための空白として使用する必要があります。
- リニア吸光度対リンコンテンツの標準曲線を作製し、合計phosphを計算するために使用することができます。orusのコンテンツとサンプルの濃度をLUVは。
3。ペプチド溶液の準備
- nanopure H 2 Oにペプチドを溶かす説明に従って、このアッセイで使用されているペプチド一トリプトファン残基が含まれている必要があります。
- 三連の282 nmでのペプチド溶液の吸光度を測定します。 5700 M -1 cm -1のトリプトファンのモル吸光係数を用いてペプチドの濃度を計算する。
- 30μMの最終濃度までnanopure水のペプチドを希釈する。 -20℃で保存
4。転座定量
- を1.7 mLのマイクロ遠心チューブ中で実験群とコントロールサンプルを準備します。 250μMの最終濃度は、各ソリューションに十分なLUVsを追加。その阻害剤は、トリプシンの濃度より10倍も大きいの最終濃度になるように十分なボーマン - バークインヒビター溶液を加える。 450μLに最終的なソリューションのボリュームをもたらすのに十分な、10mMのHEPES緩衝液を追加します。 <Starnaマイクロ石英の蛍光光度計のセルへのLi>場所50μLのペプチド溶液。 LUVsとペプチドとの間の比はほぼすべての無傷のペプチドはいずれも小胞に転いない場合でも、FRETシグナルを与えるためにダンシル基の十分近くに近接していることを保証するために十分に高いです。これは、何と小胞内に移行していないペプチドの制御条件において観察されたFRETが似と一致しています。
- キュベット内のペプチド溶液に、実験またはコントロールサンプルを追加。これは、3μMの最終ペプチド濃度を持参してください。
- 少なくとも1秒間に1回ずつ蛍光読書をしながら、ソリューションをマブラヴの実験またはコントロールを添加するとすぐに 25分の蛍光反応速度の実験を始める。 25に280nmの励起波長は525 nmでの発光波長、および温度を℃に設定キャリーのEclipse蛍光分光光度計を使用して、我々は高いのPMT感度を設定します。
5。定量的転率を生成
- データ収集の15秒後の蛍光読書として、初期の蛍光（F O）を定義する。当社の機器のセットアップでは、我々は収集した蛍光データの最初の15秒サンプルを添加するとシステムにサンプルチャンバーを閉じ、そして他の摂動、原因混合に信頼性であることを見出した。各時点での相対的な蛍光（F / F 0）を取得するためにF oで後続の各測定値を割ります。
- 平均的な実験の最後の分からすべての相対的な蛍光の測定値が最終的な平均的な相対的な蛍光を得るために
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。 - 分割による制御のサンプル用実験試料の補正を最終蛍光値を取得する。
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。 図2は、堅牢な転座を示した代表的なペプチドのためのこのアッセイの結果を示しています。この実験における信号（黒のトレースは）時間をかけてFRETシグナルの著しい低下を示しています。しかし、それは不完全なトリプシンの阻害または転座の能力とは無関係な他の要因によるFRETシグナルの潜在的な損失を制御することが重要である。この目的のために、我々は常にもペプチドとトリプシンとボーマン - バークトリプシンインヒビター（グレーのトレース、図2）の両方を含むLUVs間でFRETシグナル測定する。私たちの手で、それは実験が実行されるたびにすべてのペプチドは、このコントロールを実行するために重要であった。これは、私たちは明らかに一般的にこれらの濃度で観察された比較的弱い蛍光シグナルに大きな影響を与えることができる脂質の小胞の調製品や楽器の音、間の相違に起因する信号の変化を補正することができます。
コントロールEXPEの重要性トリプシンインヒビターを含むLUVsを使用してrimentは、図3に示すようにデータによって強調表示されます。このケースでは、ペプチドシグナルは、実験サンプル（黒のトレース）の図2のような量を減少させた。しかし、対照サンプルは、このペプチドのためのより急速な減少を示していますので、その正味の転座が低くなります。
我々のプロトコルのセクション5では、この実験から、転座を定量化する簡単な方法を説明します。高い転座の比率は、効率的に転位するペプチドを示すものであり、図2に示すように細胞透過性ペプチドのための転座の比は1.16であり、弱く転位ペプチドが1に近いほど、転座の比率を持っている。我々の経験では、別の小胞の準備を行う3つの独立した実験のための標準誤差は0.01〜0.06の範囲内です。
図1。 translocatの回路図イオンアッセイ実験は試料を（）蛍光ダンシルPOPE（黒棒）でドープされ、トリプシン（はさみ）をカプセル化含むLUVは。トリプシンインヒビター（赤い円）がLUVs外にトリプシンを阻害するために使用されます。 LUVsは、ペプチド（紫）にさらされている。とペプチド会合はtransloctingペプチドが遠慮のない内部トリプシンが発生したとして減少する信号（緑）をFRETが膜の歩留まりをLUVは。トリプシンとトリプシンインヒビターの両方をコントロールにカプセル化されている（B）転座に関係のないFRETシグナルの減少を測定するためにサンプルをLUVは。
図2。細胞透過性ペプチドのための代表的なデータが。抗菌pepideを転位担当者は、その制御に比べてFRETシグナルが大幅に低下を示しています。
図3。コントロールの重要性を強調する代表的なデータは非転位ペプチドのトリプシン消化の不完全な抑制は、実験群とコントロールの両方で時間をかけてFRETシグナルの低下につながるソリューションをLUVは。コントロールと実験的なトレースの差が比較的小さいため、この変異体は弱く転位ペプチドとして特徴付けられる。
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Discussion
ここで紹介するプロトコルは、内部および脂質小胞の外側のペプチドの濃度の相対的な変化を評価するために使用することができます。これらの変更は、転座の能力に関連しています。このプロトコルは、薬物送達ベクターとしての可能性と細胞透過性ペプチドを同定するために使用することができます。細胞透過性ペプチドへの関心が拡大するにつれ、それは直接転座のイベントを測定する方法は定量的な方法で開発され、使用されているかどうか興味がもたれるでしょう。
私たちの研究室では、我々は、アッセイの整合性を慎重に実験のいくつかの特定の側面を監視することにより改善できることを見出した。最初に、実験群とコントロールの両方小胞の定量化は、このプロトコルを使用して得られた結果の一貫性を向上させます。このアッセイはまた、タンパク質の移行と消化の先頭へ前の正確な初期の蛍光を検出する能力に依存します。したがって、それはfluoreために不可欠であるとすぐにタンパク質やペプチドなどを開始するscence信号コレクションはLuvのソリューションに公開されます。このアッセイはまた、使用される特定のトリプシン阻害剤に敏感であり、現在までに、我々は、ボーマン - バークトリプシンインヒビター（Sigma社製T - 9777）で最も一貫した結果を得ている。重要なことは、制御シナリオにおいて観察された劣化の度合いは、ペプチド（図2および図3で強調表示）の間と同じペプチドのための別の小胞の調製の間にいくつかのケースで大きく異なるようだ。これはさらに、各実験の複製を持つコントロールを実行する必要性を強調している。追加のコントロールとして、人はまたトリプシンもトリプシンインヒビターのどちらを含む小胞のサンプルにさらされたペプチドのためのFRETの応答を測定することができます。しかし、このコントロールは、ペプチドトランスロケーションのためのデータを評価するために必要な追加情報を提供していません。
一つの懸念は、膜溶解性ペプチドがするのに十分な膜を透過性可能性があることだトリプシンまたはトリプシンインヒビターは、膜を横切って移動することができます。本書の例で使用されるペプチドは、少し膜透過を引き起こすことが示されている。それにもかかわらず、多くの膜溶解性ペプチドはまた、これと同様の転座アッセイ9,16,21,22に適している。ボリュームが小胞の内側より外側にはるかに大きいので、これは可能性があります。このように、小胞の漏れるが、余分なトリプシンインヒビターによって阻害されることができる任意のトリプシンは、小胞外ペプチドの任意の開裂を防止。従って、この測定での陽性結果は、おそらく小胞に漏れから阻害剤を防止する、比較的小さい膜破壊を引き起こしながら移行しペプチドを表す。関係なく、ペプチドの特性の徹底的な特性評価は、膜透過性の評価を含める必要があります。
このアッセイは、実験的な状況の広い様々な適応に従順です。転座が楽しいとして測定されていることを考えるととしてこのアッセイを説明し、タンパク質と膜との間のFRETシグナルのctionはアニオンLUVsで自発的に関連付けるタンパク質やペプチドへの最善のに最適です、一つトリプトファン残基を含み、トリプシンは、トリプトファン残基の近くにサイトを待ち構えている。カットのサイトへのトリプトファンの近接は、トリプトファンを含むフラグメントが無視できる膜の親和性を持っていることを保証し、従って無視は、FRETシグナル。しかし、人はまた、適切なFRETのアクセプターを含む小胞と共に、チロシンまたは他の化学的に結合した蛍光moitiesを含むペプチドを使用することができます。同様に、トリプシンは、目的のペプチドで代替切断部位を標的とする別のプロテアーゼに置き換えることができます。いくつか市販のトリプシンおよびトリプシン阻害剤は凝集またはベシクル試料の不安定性をもたらしたしかし、酵素と阻害剤を変更しても、追加の最適化が必要になる場合があります。 LUVsの脂質組成を変えることによって、このアッセイはまた、役割を決定するために使用されることがありますペプチドトランスロケーションを決定する上でその脂質の充電または構造の再生。さらに、このアッセイはまた、容易にWimleyと共同研究者9のと同様のアプローチで転座の高スループット測定を提供するように適合することができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、有用な議論をエレノアフレミングとジェシカ陳に感謝します。資金は、国立アレルギー感染病研究所（NIH - NIAID）賞R15AI079685とリサーチ株式会社コットレル大学科学賞によって提供されていました。追加の学生支援は、ハワードヒューズ医学研究所とStaley氏の資金によって提供されていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipid, Inc | 840457C | |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipid, Inc | 810330C | |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457C | |
| Porcine trypsin | Sigma-Aldrich | T-0303 | |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9777 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A1417 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt Baker Inc. | 5240-05 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3375 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S-0751 |
References
- Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they? Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
- Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).
- Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).
- Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).
- Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).
- Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).
- Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).
- Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. , (2011).
- Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).
- Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochemistry. 44 (30), 10189-10189 (2005).
- Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).
- Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother? Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).
- Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
- Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochemistry. 39 (29), 8648-8648 (2000).
- Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochemistry. 34 (19), 6521-6521 (1995).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).
- Torchilin, V. P., Weissig, V. Liposomes. , Oxford University Press. New York. (2003).
- Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).
- Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).
