Summary
Denne protokollen detaljer en metode for kvantitativ måling av peptid translokasjon inn i store unilamellar lipid blemmer. Denne metoden gir også informasjon om graden av membran translokasjon og kan brukes til å identifisere peptider som effektivt og spontant krysse lipid bilayers.
Abstract
Det er en aktiv interesse i peptider som lett krysser cellemembranen uten hjelp av cellemembranen reseptorer 1. Mange av disse er referert til som celle-gjennomtrengende peptider, som er ofte kjent for sitt potensial som narkotika levering vektorer 1-3. Videre er det økende interesse for antimikrobielle peptider som opererer via non-membran lytisk mekanismer 4,5, spesielt de som krysser bakteriell membraner uten å forårsake cellelyse og dreper celler ved å forstyrre med intracellulære prosesser 6,7. Faktisk har forfatterne stadig påpekt forholdet mellom celle-gjennomtrengende og antimikrobielle peptider 1,8. En fast forståelse av prosessen med membran translokasjon og forholdet mellom peptid struktur og dens evne til å translocate krever effektive, reproduserbare analyser for translokasjon. Flere grupper har foreslått metoder for å måle translokasjon inn i store unilamelLar lipid vesikler (LUVs) 9-13. LUVs tjene som nyttige modeller for bakteriell og eukaryote cellemembraner og brukes ofte i peptid fluorescerende studier 14,15. Her beskriver vi vår bruk av metoden først utviklet av Matsuzaki og medarbeidere til å vurdere antimikrobielle peptider, som for eksempel magainin og buforin II 16,17. I tillegg til å gi vår protokoll for denne metoden, vi også presentere en grei tilnærming til data analyse som kvantifiserer translokasjon evne til å bruke denne analysen. Fordelene med denne translokasjon analysen i forhold til andre er at den har potensial til å gi informasjon om graden av membran translokasjon og krever ikke tillegg av et fluorescerende etikett, noe som kan endre peptid egenskaper 18, til tryptofan som inneholder peptider. Kort fortalt er translokasjon evne til lipid vesikler målt som en funksjon av Foster Resonance Energy Transfer (FRET) mellom innfødte tryptofan rester og dansyl phosphatidylethanolamine når proteiner er forbundet med den eksterne LUV membran (figur 1). Cell-gjennomtrengende peptider er kløyvde som de støter uhemmet trypsin innkapslet med LUVs, som fører til disassociation fra LUV membran og en nedgang i FRET signal. Fallet i FRET signal observert for en translocating peptid er betydelig større enn det som ble observert for den samme peptid når LUVs inneholder både trypsin og trypsin inhibitor, eller når et peptid som ikke spontant krysse lipid membraner er eksponert mot trypsin inneholder LUVs. Denne endringen i fluorescens gir en direkte kvantifisering av peptid translokasjon over tid.
Protocol
1. Utarbeidelse av Stor Unilamellar Lipid Blemmer (LUVs)
- Forbered LUVs å tjene som cellemembranen etterligner for analysen 19.
- Mix phosphatidylcholine (POPC, 760,10 g / mol), phosphatidylglycerol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl phosphatidylethanolamine (DNS-PAVEN, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) oppløst i kloroform i en 50 : 45:5 ratio. Som alle analysen krever separate utarbeidelse av både eksperimentelle og kontroll LUVs, bør to lipid kake ampuller være forberedt. 0.376 mg av totalt lipid (0,188 mg POPC, 0,169 mg POPG, og 0,019 mg DNS-PAVEN) er vanligvis tilstrekkelig til å gjøre nok vesikler for en enkelt translokasjon rettssak.
- Fordampe av kloroform ved hjelp av en N 2 gasstrømmen.
- Tørk lipid kaken 9-14 timer i et vakuum eksikkator.
- Forbered en aksje 10 mm HEPES buffer løsning (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). HEPES buffer er stored ved 4 ° C.
- Forbered en stamløsning på 0,4 mM svin trypsin (23,3 kg / mol) i 10 mm HEPES buffer forberedt ovenfor. Trypsin lagres ved -20 ° C, og i vår praksis, gjør vanligvis ikke gjennomgår mer enn 2 fryse-tine sykluser før bruk.
- Forbered en stamløsning på 4,0 mM Bowman-Birk trypsin inhibitor (8 kg / mol) i 10 mm HEPES bufferløsning og oppbevar ved -20 ° C. I bruk vår, er denne bestanden replenished månedlig og vanligvis gjennomgår ikke mer enn 3 fryse / tine sykluser før det er laget igjen.
- Rekonstituer eksperimentelle multilamellar vesikler (MLVs) i en 0,2 mm trypsin løsningen ved å tilsette et tilsvarende volum på 0,4 mM trypsin lager og 10 mM HEPES buffer løsning på tørket lipid kaken. For en enkelt prøve av 0.376 mg total lipid, er en blanding av 150 mL av trypsin løsning og 150 mL av HEPES buffer tilstrekkelig.
- Rekonstituer kontroll MLVs i en løsning med 0,2 mM trypsin og 2,0 mM Bowman-Birk trypsin hemmer ved å legge til et likt volum av 0.4 mm trypsin lager og 4,0 mM trypsin inhibitor til tørket lipid kaker. For en enkelt prøve av 0.376 mg total lipid, er en blanding av 150 mL av trypsin løsning og 150 mL av trypsin inhibitor tilstrekkelig.
- Transfer MLV løsninger fra hetteglass til 1,7 ml mikrosentrifuge tube.
- Subject MLV løsninger til 5 fryse / tine sykluser i flytende nitrogen.
- Forbered lipid ekstruder (Avanti Polar Lipids) ved å plassere to filter støtter fuktet i HEPES buffer på hver Teflon ekstruder stykke. Plasser en nuclepore spor etset membran med 0,1 mikrometer porer (Whatman, Storbritannia) i mellom de to Teflon ekstruder stykker, og legg ekstruder stykker inne i metallet ekstruder beholderen. Plasser donut spacer over de to ekstruder biter før tiltrekking metall toppen av ekstruder beholderen og plassere den i holderen.
- Fylle tomrommet volum i ekstruder med 500 mL 10 mm HEPES buffer ved hjelp av en 250 mL glassprøyte å hindre tap av vesicle prøve. </ Li>
- Load hver MLV prøve i ekstruder og skyve prøven gjennom membranen minst 21 ganger for å sikre ensartet unilamellar vesicle størrelse. LUVs er hentet fra MLV løsningen etter ekstrudering.
- Oppbevar LUVs ved 4 ° C og bruk innen 48 timer.
2. Kvantifisering LUV Konsentrasjon
- LUV konsentrasjonen var kvantifisert ved å bestemme det totale innhold av fosfor i prøven 20.
- Forbered 8,9 NH 2 SO 4 i nanopure vann og oppbevar ved romtemperatur.
- Forbered en 2,5% w / v ammonium molybdate VI (588,04 g / mol) løsning i nanopure vann. Tilbered en 10% w / v askorbinsyre (176.1 g / mol) løsning i nanopure vann. Beskytt askorbinsyre løsning mot lys ved å dekke røret med folie. Oppbevar begge løsninger ved 4 ° C i opptil 2 måneder.
- Forbered 0,65 mM fosfatbuffer løsning (monobasic vannfri natrium fosfat, 120 g / mol).
- Forbered seks standard tuBES. Standarder bør inneholde 0,0 mL, 50 mL (0.0325 μmoles), 100 mL (0,065 μmoles), 175 mL (0,114 μmoles), 250 mL (0,163 μmoles), eller 350 mL (0,228 μmoles) av fosfor løsning.
- Forbered LUV prøverør i tre eksemplarer. Hvert prøverør bør inneholde ca 0,1 μmoles av LUVs. Eksperimentell og kontroll LUV konsentrasjoner må måles separat.
- Å korrigere for eventuelle tørket fosfor salter i Bowman-Birk hemmer pulver, en kontroll LUV blank må være forberedt. Den tomme bør inneholde de samme volumet på 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk inhibitor løsning som ble plassert i kontrollgruppen LUV prøverør.
- Plasser 450 mL på 8,9 NH 2 SO 4 i hver av prøven, standard, og tomme rør.
- Heat prøver, standarder, og blanks for 25 minutter ved 175-210 ° C i ovn.
- Fjern alle rør og la dem avkjøles. Tilsett 150 mL av 30% H 2 O 2 til hver av tuBES.
- Heat prøver, standarder, og blanks i 30 minutter ved 175-210 ° C.
- Ta ut prøvene, standarder og blanks fra varmen. Hvis noen av løsningene er ennå ikke fargeløs, tilsett 50 mL H 2 O 2 til alle rørene og varme i ytterligere 15 minutter ved 175-210 ° C.
- Legg 3,9 mL nanopure H 2 O, 0,5 mL ammonium molybdate løsning og 0,5 mL askorbinsyre løsning til hvert rør.
- Heat alle rør i 5-7 minutter i kokende vannbad.
- Mål absorbansen til hver standard og prøve på 820 nm ved hjelp av en Agilent 8453 UV-synlig spektrofotometer. Tuben inneholder 0,0 mmoles fosfor bør brukes som tomt for alle standarder og eksperimentelle LUV prøver. Tuben inneholder 0,2 mm trypsin/2.0 mM Bowman-Birk hemmer oppløsning bør brukes som tomt for kontroll LUV prøven.
- En lineær absorbans vs fosfor standardkurve kan produseres og brukes til å beregne den totale phosphOrus innhold og LUV konsentrasjon av prøvene.
3. Forbereder Peptide Solutions
- Løs opp peptid i nanopure H 2 O. Peptider som brukes i denne analysen som beskrevet må inneholde én tryptofan rester.
- Mål absorbansen av peptid løsningen ved 282 nm i tre eksemplarer. Beregn peptid konsentrasjon hjelp av molare ekstinksjonskoeffisient for tryptofan av 5700 M -1 cm -1.
- Fortynnes peptid i nanopure vann til en endelig konsentrasjon på 30 mikrometer. Oppbevar ved -20 ° C
Fire. Translokasjon Kvantifisering
- Forbered eksperimentelle og kontroll prøver i 1,7 mL Mikrosentrifugerør. Legg nok LUVs til hver løsning for en endelig konsentrasjon på 250 mikrometer. Legg nok Bowman-Birk inhibitor løsning slik at inhibitor er en endelig konsentrasjon 10X større enn trypsin konsentrasjon. Legg nok 10 mm HEPES buffer å ta den endelige løsningen volumet til 450 mL. <li> Sett 50 mL peptid løsning til en Starna mikro kvarts fluorometer celle. Forholdet mellom LUVs og peptid er høy nok til å sikre at nesten alle intakt peptider er i nær nok nærhet til en dansyl gruppe for å gi en FRET signal selv om ingen har translocated i vesicle. Dette er konsistent med tilsvarende FRET observert i kontroll vilkår for peptider som gjør og ikke translocate inn blemmer.
- Legg til eksperimentell eller kontroll prøven til peptid løsningen i kyvetten. Dette bør få den endelige peptid konsentrasjon til 3 mikrometer.
- Begynn en 25 minutters fluorescerende kinetikk eksperimentere umiddelbart ved tilsetning av eksperimentell eller kontroll LUV løsning, ta en fluorescens leser minst en gang per sekund. Sett eksitasjon bølgelengde på 280 nm, utslipp bølgelengde på 525 nm, og temperaturen til 25 ° C. Ved hjelp av en Cary Eclipse Fluorescens spektrofotometer, setter vi PMT følsomheten for høyt.
5. Generere en Kvantitative translokasjon Ratio
- Definer innledende fluorescens (F o) som fluorescens lesing etter femten sekunder med datainnsamling. I vår instrumentoppsett, har vi funnet ut at de første femten sekunder av fluorescens innsamlede data er upålitelige på grunn av miksing, lukke prøven kammer, og andre forstyrrelser i systemet når prøven tillegg. Divide hver senere lesing av F o å skaffe relative fluorescens (F / F 0) på hvert tidspunkt.
- Gjennomsnittlig alle relative fluorescens avlesninger fra det siste minuttet av forsøket å få en endelig gjennomsnittlig relativ fluorescens
![[F / Fo] avg](//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg)
. - Del for kontroll prøver ved for eksperimentelle prøver å få en korrigert endelig fluorescens verdi.
![[F / Fo] avg](http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg)
. Figur 2 viser resultatene av denne analysen for et representativt peptid som viste robust translokasjon. Signalet i dette eksperimentet (svart spore) viser en markant nedgang i FRET signal over tid. Det er imidlertid viktig å kontrollere for det potensielle tapet av FRET signal på grunn av ufullstendig trypsin hemming eller andre forhold relatert til translokasjon evne. For å oppnå dette, vi alltid også måle FRET signal mellom peptid og LUVs inneholder både trypsin og Bowman-Birk trypsin inhibitor (grå spore, figur 2). I våre hender, har det vært viktig å utføre denne kontrollen for hver peptid hver gang et eksperiment kjøres. Dette gir oss muligheten til å tydelig korrigere for eventuelle endringer i signal på grunn av eventuelle forskjeller mellom lipid vesicle preparater eller instrument støy, som kan være av betydning for den relativt svake fluorescerende signaler vanligvis observert ved disse konsentrasjonene.
Betydningen av kontrollen erfaringriment bruker LUVs inneholder trypsin inhibitor fremheves av dataene vist i figur 3.. I dette tilfellet redusert peptid signal et tilsvarende beløp som i figur 2 i det eksperimentelle utvalget (svart spor). Viser imidlertid kontrollutvalget en raskere reduksjon for denne peptid, så netto translokasjon er lavere.
§ 5 av protokoll våre beskriver en enkel metode for å kvantifisere translokasjon fra dette eksperimentet. Høyere translokasjon forholdstall indikerer peptider som translocate effektivt, translokasjon ratio for cellen gjennomtrengende peptid vist i Figur 2 er 1.16, mens svakt translocating peptider har translokasjon forholdstall nærmere 1. Vår erfaring er standard feil for tre uavhengige eksperimenter utført med forskjellige vesicle forberedelser i området 0,01 til 0,06.
Figur 1. Skjematisk av translocation analysen. Experimental LUV prøver (A) er dopet med selvlysende dansyl PAVEN (svarte striper) og inneholder innkapslet trypsin (saks). Trypsin inhibitor (rød sirkel) brukes til å hemme trypsin utenfor LUVs. Den LUVs utsettes for peptid (lilla). Peptid assosiasjon med LUV membraner gir en FRET signal (grønn) som avtar som translocting peptider møte uhemmet interne trypsin. Både trypsin og trypsin inhibitor er innkapslet i kontroll LUV prøver (B) for å måle nedgang i FRET signal urelatert til translokasjon.
Figur 2. Representative data for en celle-gjennomtrengende peptid. En representant translocating antimikrobielle pepide viser en betydelig nedgang i FRET signal i forhold til kontroll.
Figur3. Representative data fremheve viktigheten av kontroll. Ufullstendig hemming av tryptic fordøyelsen av en ikke-translocating peptid fører til et fall i FRET signal over tid i både eksperimentelle og kontroll LUV løsninger. Fordi forskjellen mellom kontroll og eksperimentelle spor er relativt liten, er dette mutant karakterisert som et svakt translocating peptid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres her kan brukes til å vurdere den relative endringen i konsentrasjonen av peptider i og utenfor lipid blemmer. Disse endringene er knyttet til translokasjon evne. Denne protokollen kan brukes til å identifisere celle-gjennomtrengende peptider med potensial som narkotika levering vektorer. Som interesse i celle-gjennomtrengende peptider vokser, vil det være interessant å se hvordan metoder som direkte måler translokasjon arrangementet er utviklet og brukes i en kvantitativ måte.
I vårt laboratorium har vi funnet at konsistensen av analysen kan forbedres ved nøye overvåking noen bestemte aspekter av forsøket. Først forbedrer kvantifisering av både eksperimentelle og kontroll vesikler konsistensen av resultatene oppnådd ved hjelp av denne protokollen. Denne analysen er også avhengig av evnen til å oppdage en nøyaktig innledende fluorescens før begynnelsen av protein translokasjon og fordøyelse. Derfor er det viktig for fluorescence signal samling å begynne så snart protein eller peptid er utsatt for LUV løsningen. Denne analysen er også følsomme for den bestemte trypsin inhibitor brukt, til dags dato, har vi fått de mest konsistente resultatene med Bowman-Birk trypsin inhibitor (Sigma T-9777). Viktigere, synes graden av nedbrytning observert i kontroll scenarier å variere betydelig mellom peptider (som markert i figur 2 og 3) og i noen tilfeller mellom ulike vesicle forberedelsene til samme peptid. Dette ytterligere understreker behovet for å kjøre en kontroll med hver eksperimentelle replikering. Som en ekstra kontroll, kunne man også måle FRET responsen for peptid utsatt for en vesikkel prøve inneholder verken trypsin eller trypsin inhibitor. Men denne kontrollen ikke gi noen flere opplysninger som er nødvendig for å evaluere data for peptid translokasjon.
En bekymring er at membran-lytiske peptider kan permeabilize membranen nok til åtillate trypsin eller trypsin inhibitor å reise over membranen. Peptider som brukes for eksemplene i denne artikkelen har vist seg å forårsake lite membran permeabilization. Likevel, mange membran-lytiske peptider også er mottagelig for dette og lignende translokasjon analyser 9,16,21,22. Dette er sannsynligvis fordi volumet er mye større utenfor enn inne i blemmer. Dermed eventuelle trypsin som lekker ut av vesicle kan bli hemmet av overskytende trypsin inhibitor, forebygge eventuelle spalting av peptid utenfor vesicle. Dermed betegner et positivt resultat fra denne analysen sannsynligvis et peptid som translocates mens forårsaker relativt minimal membran avbrudd, og hindrer inhibitor lekker inn i vesikler. Uansett bør en grundig karakterisering av peptid egenskaper inkludere en vurdering av membran permeabilization.
Denne analysen er mottakelig for tilpasning til et bredere utvalg av eksperimentelle omstendigheter. Gitt at translokasjon er målt som en morsomction av FRET signal mellom protein og membran, som beskrevet denne analysen er best egnet til proteiner og peptider som spontant assosierer med anioniske LUVs, inneholde ett tryptofan rester og har trypsin kuttet områder nær tryptofan rester. Nærheten av tryptofan til et kutt område sikrer at fragmentet inneholder tryptofan har en ubetydelig membran tilhørighet, og dermed en ubetydelig FRET signal. Men man kunne også bruke peptider som inneholder tyrosin eller annen kjemisk konjugert fluorescerende moities sammen med blemmer som inneholder en passende FRET akseptor. På samme måte kan trypsin bli erstattet med en annen protease som er rettet mot alternativ kuttet nettsteder i et peptid av interesse. Imidlertid kan endre enzymet og inhibitor kreve ytterligere optimalisering siden noen kommersielt tilgjengelige trypsins og trypsin hemmere førte til aggregering eller ustabilitet av vesicle prøver. Ved å endre lipid sammensetningen av LUVs, kan denne analysen også brukes til å bestemme hvilken rolleat lipid tiltale eller struktur spiller i å bestemme peptid translokasjon. I tillegg kan denne analysen også være lett tilpasses for å gi high-throughput målinger av translokasjon i en tilnærming lik som Wimley og medarbeidere 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Eleanor Fleming og Jessica Chen for nyttige diskusjoner. Finansieringen ble gitt av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIH-NIAID) Award R15AI079685 og Research Corporation Cottrell College Science Award. Ekstra student støtte ble gitt av Howard Hughes Medical Institute og Staley fond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipid, Inc | 840457C | |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipid, Inc | 810330C | |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457C | |
| Porcine trypsin | Sigma-Aldrich | T-0303 | |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9777 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A1417 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt Baker Inc. | 5240-05 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3375 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S-0751 |
References
- Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they? Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
- Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).
- Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).
- Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).
- Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).
- Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).
- Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).
- Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. , (2011).
- Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).
- Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochemistry. 44 (30), 10189-10189 (2005).
- Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).
- Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother? Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).
- Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
- Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochemistry. 39 (29), 8648-8648 (2000).
- Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochemistry. 34 (19), 6521-6521 (1995).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).
- Torchilin, V. P., Weissig, V. Liposomes. , Oxford University Press. New York. (2003).
- Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).
- Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).
