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Biology

बड़े Unilamellar vesicles में पेप्टाइड स्थानान्तरण माप

Published: January 27, 2012 doi: 10.3791/3571
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Wellesley College

Summary

यह प्रोटोकॉल बड़े unilamellar लिपिड vesicles में पेप्टाइड स्थानान्तरण के मात्रात्मक उपाय के लिए एक विधि के विवरण. इस विधि भी झिल्ली स्थानान्तरण की दर के बारे में जानकारी प्रदान करता है और पेप्टाइड्स है कि कुशलतापूर्वक और अनायास लिपिड bilayers पार की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

1. बड़े Unilamellar लिपिड vesicles (LUVs) की तैयारी

  1. LUVs तैयार की सेवा के रूप में कोशिका झिल्ली 19 परख के लिए mimics.
  2. मिक्स (POPC, 760.10 छ / mol) phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol (POPG. 770.99 छ / mol), 5 dimethylaminonaphthalene-1-Sulfonyl (डीएनएस पोप, 994.350 छ / mol) phosphatidylethanolamine (अवंती ध्रुवीय Lipids) 50 में क्लोरोफॉर्म में भंग : 45:5 अनुपात. हर परख के रूप में दोनों प्रयोगात्मक और नियंत्रण LUVs के अलग - अलग तैयारी की आवश्यकता होती है, दो लिपिड केक शीशियों तैयार रहना चाहिए. कुल लिपिड (0.188 मिलीग्राम POPC, 0.169 मिलीग्राम POPG, और 0.019 मिलीग्राम डीएनएस पोप) की 0.376 मिलीग्राम है आमतौर पर एक एकल स्थानान्तरण परीक्षण के लिए पर्याप्त vesicles बनाने के लिए पर्याप्त है.
  3. एक एन 2 गैस धारा का उपयोग क्लोरोफॉर्म बंद लुप्त हो जाना .
  4. लिपिड केक एक निर्वात desiccator में 9-14 घंटे सूखी.
  5. एक शेयर 10 मिमी HEPES बफर समाधान (10 मिमी HEPES, 238.3 छ / mol, 45 मिमी NaCl, 58.44 छ / mol, 1 मिमी EDTA, 372.24 छ / mol पीएच 7.4) तैयार है. HEPES बफर सेंट है4 डिग्री सेल्सियस पर ored
  6. 10 मिमी HEPES ऊपर तैयार बफर में 0.4 मिमी सुअर का trypsin (23.3 किलो / mol) के एक शेयर के समाधान तैयार है. Trypsin -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है, और हमारे व्यवहार में, आमतौर पर अधिक से अधिक 2 फ्रीज पिघलना चक्र उपयोग करने से पहले गुजरना नहीं करता है.
  7. 10 मिमी HEPES बफर और -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान में 4.0 मिमी बोमन Birk trypsin अवरोध करनेवाला (8 किलो / mol) के एक शेयर के समाधान की तैयारी हमारे उपयोग में, यह स्टॉक मासिक मंगाया है और आमतौर पर 3 से अधिक फ्रीज / पिघलना चक्र से गुजरना नहीं इससे पहले कि इसे फिर से किया जाता है है.
  8. Reconstitute एक 0.2 मिमी 0.4 मिमी trypsin शेयर और 10 मिमी HEPES बफर सूखे लिपिड केक के लिए समाधान के एक बराबर मात्रा जोड़कर trypsin समाधान में प्रयोगात्मक multilamellar vesicles (MLVs). 0.376 मिलीग्राम कुल लिपिड के एक एकल नमूना के लिए, trypsin समाधान और HEPES बफर के 150 μL 150 μL का एक मिश्रण के लिए पर्याप्त है.
  9. 0 के एक बराबर मात्रा जोड़कर 0.2 मिमी trypsin और 2.0 मिमी बोमन Birk trypsin अवरोध करनेवाला के साथ एक समाधान में reconstitute नियंत्रण MLVs.4 मिमी trypsin शेयर और 4.0 मिमी trypsin सूखे लिपिड केक करने के लिए अवरोध करनेवाला. 0.376 मिलीग्राम कुल लिपिड के एक एकल नमूना के लिए, trypsin समाधान और trypsin अवरोध करनेवाला के 150 μL 150 μL का एक मिश्रण के लिए पर्याप्त है.
  10. स्थानांतरण कांच की शीशियों से 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब MLV समाधान.
  11. तरल नाइट्रोजन में विषय MLV 5 / फ्रीज पिघलना चक्र समाधान.
  12. प्रत्येक Teflon extruder के टुकड़े पर दो फिल्टर HEPES बफर में सिक्त का समर्थन करता है रखकर लिपिड extruder (अवंती ध्रुवीय Lipids) तैयार करें. 0.1 में सुक्ष्ममापी (वाटमान, यूनाइटेड किंगडम) के दो Teflon extruder के टुकड़े के बीच pores के साथ एक nuclepore ट्रैक etched झिल्ली प्लेस, और धातु extruder कनस्तर अंदर extruder के टुकड़े जगह. दो extruder के टुकड़े पर डोनट स्पेसर extruder कनस्तर के धातु शीर्ष कस और यह धारक में रखने से पहले रखें.
  13. Extruder के भीतर शून्य मात्रा 500 μL 10 मिमी HEPES एक 250 μL कांच सिरिंज का उपयोग कर पुटिका नमूना के नुकसान को रोकने के बफर के साथ भरें. </ Li>
  14. Extruder में प्रत्येक MLV नमूना लोड और झिल्ली के माध्यम से नमूना वर्दी unilamellar पुटिका आकार सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 21 बार धक्का. LUVs MLV समाधान निम्नलिखित बाहर निकालना से प्राप्त कर रहे हैं.
  15. 4 में स्टोर LUVs डिग्री सेल्सियस और 48 घंटे के भीतर का उपयोग करें.

2. बढ़ाता एकाग्रता Luv

  1. Luv एकाग्रता कुल 20 नमूने में फास्फोरस की सामग्री का निर्धारण करने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था.
  2. 4 अतः nanopure और कमरे के तापमान पर पानी की दुकान में 8.9 राष्ट्रीय राजमार्ग दो तैयार करें.
  3. एक 2.5% w v / अमोनियम molybdate छठी (588.04 छ / mol) nanopure पानी में समाधान तैयार करें. एक 10% w / v ascorbic एसिड (176.1 छ / mol) nanopure पानी में समाधान तैयार करें. पन्नी के साथ कवर ट्यूब द्वारा प्रकाश जोखिम से ascorbic एसिड समाधान को सुरक्षित रखें. 4 ° C में 2 महीने के लिए दोनों के समाधान स्टोर.
  4. 0.65 मिमी फॉस्फेट बफर समाधान (एक समाक्षारीय निर्जल सोडियम फास्फेट, 120 छ / mol) तैयार करें.
  5. छह मानक तू तैयारbes. मानक 0.0 μL, 50 μL (.०३२५ μmoles), 100 μL (0.065 μmoles), 175 μL (0.114 μmoles), 250 μL (0.163 μmoles), या फास्फोरस समाधान के 350 μL (0.228 μmoles) को शामिल करना चाहिए.
  6. तीन प्रतियों में नमूना ट्यूबों Luv तैयार. प्रत्येक नमूना ट्यूब लगभग LUVs के 0.1 μmoles शामिल करना चाहिए. प्रायोगिक और नियंत्रण Luv सांद्रता अलग मापा जाना चाहिए.
  7. किसी भी अवरोध करनेवाला बोमन Birk पाउडर में सूखे फास्फोरस लवण के लिए सही करने के लिए, एक नियंत्रण Luv रिक्त तैयार रहना चाहिए. रिक्त 0.2 मिमी trypsin/2.0 मिमी अवरोध करनेवाला बोमन Birk समाधान का एक ही मात्रा को नियंत्रित नियंत्रण में रखा गया था के रूप में नमूना ट्यूब Luv चाहिए.
  8. जगह नमूना, मानक, और खाली ट्यूबों में से प्रत्येक में 450 8.9 2 अतः 4 राष्ट्रीय राजमार्ग की μL.
  9. हीट नमूनों, मानकों, और 175-210 पर 25 मिनट के लिए रिक्त स्थान ° सी एक ओवन में.
  10. सभी ट्यूबों निकालें और उन्हें शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. तू के प्रत्येक के लिए 30% एच 2 2 हे की 150 μL जोड़ेंbes.
  11. हीट नमूनों, मानकों, और 30 मिनट के लिए 175-210 पर खाली ° सी.
  12. नमूनों, मानकों, और गर्मी से रिक्त स्थान निकालें. यदि समाधान के किसी भी अभी तक नहीं बेरंग हैं, सभी ट्यूब और एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए गर्मी 175-210 डिग्री सेल्सियस के लिए 50 μL एच 2 2 हे जोड़ने
  13. 3.9 एमएल nanopure एच 2 हे, 0.5 एमएल अमोनियम molybdate समाधान और 0.5 एमएल ascorbic एसिड प्रत्येक ट्यूब का हल जोड़ें.
  14. एक उबलते पानी स्नान में 5-7 मिनट के लिए सभी ट्यूब हीट.
  15. प्रत्येक और 820 एनएम पर एक Agilent 8453 यूवी दर्शनीय स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर मानक नमूना absorbance के उपाय. 0.0 mmoles फास्फोरस युक्त ट्यूब सभी मानकों और प्रयोगात्मक के लिए रिक्त के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए नमूनों Luv. 0.2 मिमी मिमी trypsin/2.0 अवरोध करनेवाला बोमन Birk समाधान युक्त ट्यूब नियंत्रण के लिए रिक्त के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए नमूना Luv.
  16. एक रैखिक absorbance बनाम फास्फोरस सामग्री मानक वक्र और उत्पादन कुल phosph गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैorus सामग्री और एकाग्रता के नमूने Luv.

3. पेप्टाइड समाधान की तैयारी

  1. Nanopure एच 2 ओ में पेप्टाइड भंग इस परख में प्रयोग किया जाता के रूप में वर्णित पेप्टाइड्स एक tryptophan अवशेषों शामिल होना चाहिए.
  2. तीन प्रतियों में 282 एनएम पर पेप्टाइड समाधान के absorbance के उपाय. पेप्टाइड एकाग्रता tryptophan के लिए 5700 एम -1 -1 सेमी की दाढ़ विलुप्त होने गुणांक का उपयोग कर की गणना .
  3. 30 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता nanopure पानी में पेप्टाइड पतला. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

4. स्थानान्तरण मात्रा

  1. 1.7 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में प्रयोगात्मक और नियंत्रण के नमूने तैयार. 250 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक समाधान के लिए पर्याप्त LUVs जोड़ें. पर्याप्त बोमन - Birk अवरोध करनेवाला समाधान जोड़ें ताकि अवरोध करनेवाला एक अंतिम 10X एकाग्रता trypsin एकाग्रता से अधिक है. अंतिम समाधान 450 μL मात्रा लाने के लिए पर्याप्त 10 मिमी HEPES बफर जोड़ें.
    2. <ली> 50 प्लेस Starna सूक्ष्म क्वार्ट्ज fluorometer सेल में μL पेप्टाइड समाधान. LUVs और पेप्टाइड के बीच का अनुपात काफी उच्च करने के लिए सुनिश्चित करें कि लगभग सभी बरकरार पेप्टाइड्स करीब एक dansyl समूह के लिए पर्याप्त निकटता में एक झल्लाहट संकेत दे भले ही कोई भी पुटिका में translocated है. यह इसी तरह नियंत्रण की स्थिति में पेप्टाइड्स के लिए मनाया कि करते हैं और vesicles में सरकाना नहीं झल्लाहट के साथ संगत है.
  2. क्युवेट में पेप्टाइड समाधान के लिए प्रयोगात्मक या नियंत्रण नमूना जोड़ें. यह अंतिम पेप्टाइड 3 सुक्ष्ममापी एकाग्रता लाना चाहिए.
  3. एक 25 मिनट के प्रयोगात्मक या नियंत्रण के अलावा पर ​​फ्लोरोसेंट कैनेटीक्स तुरंत प्रयोग समाधान Luv शुरू, एक प्रतिदीप्ति पढ़ने प्रति सेकंड कम से कम एक बार ले . 25 उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 280 एनएम, 525 एनएम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य, और तापमान सेट डिग्री सेल्सियस एक Cary ग्रहण प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करना, हम उच्च करने के लिए PMT संवेदनशीलता सेट.

5. एक मात्रात्मक स्थानान्तरण अनुपात उत्पन्न

  1. डेटा संग्रह के पंद्रह सेकंड के बाद प्रतिदीप्ति पढ़ने के रूप में प्रारंभिक प्रतिदीप्ति (एफ ओ) को परिभाषित करें. हमारे साधन सेटअप में, हमने पाया है कि प्रतिदीप्ति एकत्र आंकड़ों के पहले पंद्रह सेकंड अविश्वसनीय मिश्रण करने के लिए कारण हैं, नमूना कक्ष बंद करने, और अन्य perturbations नमूना इसके अलावा पर व्यवस्था करने के लिए. एफ ओ द्वारा प्रत्येक बाद पढ़ने के लिए हर समय बिंदु पर रिश्तेदार प्रतिदीप्ति (/ एफ 0 एफ) प्राप्त करने के फूट डालो.
  2. औसत प्रयोग के आखिरी मिनट से सभी रिश्तेदार प्रतिदीप्ति रीडिंग प्राप्त करने के लिए एक अंतिम औसत रिश्तेदार प्रतिदीप्ति [एफ / एफओ] औसत .
  3. फूट डालो [एफ / एफओ] औसत द्वारा नियंत्रण नमूने लिए [एफ / एफओ] औसत प्रयोगात्मक नमूने के लिए एक सही अंतिम प्रतिदीप्ति मूल्य प्राप्त करने के लिए.
ले "> 6. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 2 एक प्रतिनिधि पेप्टाइड है कि मजबूत स्थानान्तरण दिखाया के लिए इस परख के परिणामों से पता चलता है. इस प्रयोग में काले (ट्रेस) में संकेत समय पर संकेत झल्लाहट में एक चिह्नित ड्रॉप से ​​पता चलता है. हालांकि, यह महत्वपूर्ण है अधूरा trypsin अवरोध या अन्य स्थानान्तरण करने की क्षमता करने के लिए असंबंधित कारकों की वजह से संकेत झल्लाहट के संभावित नुकसान के लिए नियंत्रण. यह अंत करने के लिए, हम हमेशा भी पेप्टाइड और दोनों trypsin और बोमन Birk trypsin अवरोध करनेवाला (ग्रे का पता लगाने, चित्रा 2) युक्त LUVs के बीच संकेत को मापने झल्लाहट. हमारे हाथ में, यह महत्वपूर्ण हो गया है हर पेप्टाइड के लिए इस पर नियंत्रण में हर समय एक प्रयोग चलाया जाता है प्रदर्शन. यह हमें स्पष्ट रूप से संकेत में किसी भी परिवर्तन लिपिड पुटिका तैयारी या साधन शोर है, जो अपेक्षाकृत कमजोर फ्लोरोसेंट आम तौर पर इन सांद्रता में मनाया संकेतों के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है के बीच कोई मतभेद के कारण के लिए सही करने के लिए अनुमति देता है.

नियंत्रण अनुभव के महत्वriment trypsin अवरोध करनेवाला युक्त LUVs का उपयोग चित्रा 3 में दिखाया गया डेटा से प्रकाश डाला है. इस मामले में, पेप्टाइड संकेत प्रयोगात्मक नमूने (काले ट्रेस) में चित्रा 2 में है कि एक समान राशि की कमी हुई. हालांकि, नियंत्रण नमूना इस पेप्टाइड के लिए एक और अधिक तेजी से कमी से पता चलता है, तो उसके शुद्ध स्थानान्तरण कम है.

हमारे प्रोटोकॉल की धारा 5 के इस प्रयोग से स्थानान्तरण बढ़ाता के लिए एक सरल तरीका बताता है. उच्च स्थानान्तरण अनुपात पेप्टाइड्स कि कुशलतापूर्वक टसकाना का संकेत कर रहे हैं, सेल मर्मज्ञ चित्रा 2 में दिखाया पेप्टाइड के लिए स्थानान्तरण अनुपात 1.16 है, जबकि कमजोर translocating पेप्टाइड्स स्थानान्तरण अनुपात 1 के लिए करीब है. हमारे अनुभव में, तीन स्वतंत्र अलग पुटिका तैयारी के साथ प्रदर्शन प्रयोगों के लिए मानक त्रुटि 0,01 करने के लिए 0,06 की रेंज में है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Translocat के योजनाबद्धआयन परख. प्रायोगिक नमूने (ए) फ्लोरोसेंट dansyl पोप (काली सलाखों) के साथ doped हैं और trypsin (कैंची) शामिल समझाया Luv . Trypsin अवरोध करनेवाला (लाल वृत्त) LUVs बाहर trypsin को बाधित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. LUVs पेप्टाइड (बैंगनी) को उजागर कर रहे हैं. पेप्टाइड के साथ मिलकर झिल्ली पैदावार एक (हरा) संकेत है कि घट जाती है के रूप में translocting पेप्टाइड्स uninhibited आंतरिक trypsin मुठभेड़ झल्लाहट Luv. दोनों trypsin और trypsin अवरोध करनेवाला नियंत्रण में encapsulated रहे हैं नमूने Luv (बी) स्थानान्तरण करने के लिए असंबंधित संकेत झल्लाहट में घट जाती है मापने के लिए.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रतिनिधि सेल मर्मज्ञ एक पेप्टाइड के लिए डेटा. रोगाणुरोधी pepide translocating प्रतिनिधि इसके नियंत्रण की तुलना में संकेत झल्लाहट में एक महत्वपूर्ण गिरावट दिखाता है.

चित्रा 3
आंकड़ा3. एक गैर translocating पेप्टाइड tryptic पाचन के प्रतिनिधि डेटा नियंत्रण के महत्व पर प्रकाश डाला. अपूर्ण निषेध दोनों प्रयोगात्मक और नियंत्रण में समय पर संकेत झल्लाहट में एक बूंद की ओर जाता है है समाधान Luv. क्योंकि नियंत्रण और प्रयोगात्मक निशान के बीच का अंतर अपेक्षाकृत छोटा है, इस उत्परिवर्ती एक कमजोर translocating पेप्टाइड के रूप में विशेषता है.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल लिपिड vesicles के अंदर और बाहर पेप्टाइड्स की एकाग्रता में रिश्तेदार परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन परिवर्तनों को स्थानान्तरण करने की क्षमता से संबंधित हैं. इस प्रोटोकॉल के लिए दवा वितरण वैक्टर के रूप में क्षमता के साथ सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. के रूप में सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स में ब्याज बढ़ता है, यह कैसे तरीकों कि सीधे स्थानान्तरण घटना उपाय विकसित कर रहे हैं और एक मात्रात्मक तरीके से इस्तेमाल किया देखने के लिए दिलचस्प हो जाएगा.

हमारी प्रयोगशाला में, हमने पाया है कि परख की संगति सावधानी से प्रयोग के कुछ विशेष पहलुओं की निगरानी के द्वारा सुधार किया जा सकता है है. सबसे पहले, दोनों प्रयोगात्मक और नियंत्रण vesicles की मात्रा का ठहराव इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर से प्राप्त परिणामों की स्थिरता में सुधार. यह परख भी प्रोटीन स्थानान्तरण और पाचन की शुरुआत से पहले एक सटीक प्रारंभिक प्रतिदीप्ति पता लगाने की क्षमता पर निर्भर करता है. इसलिए, यह fluore के लिए आवश्यक हैscence संकेत के रूप में प्रोटीन या पेप्टाइड के रूप में जल्द ही शुरू संग्रह समाधान Luv से अवगत कराया है. यह परख भी विशेष trypsin अवरोध करनेवाला प्रयोग किया जाता के प्रति संवेदनशील है, तिथि करने के लिए, हम बोमन Birk trypsin अवरोध करनेवाला (सिग्मा टी - ९,७७७) के साथ सबसे अनुरूप परिणाम प्राप्त किया है. महत्वपूर्ण बात, नियंत्रण परिदृश्यों में मनाया गिरावट की डिग्री पेप्टाइड्स (के रूप में आंकड़े 2 और 3 में प्रकाश डाला) के बीच और एक ही पेप्टाइड के लिए अलग पुटिका तैयारी के बीच कुछ मामलों में काफी भिन्नता है लगता है. यह आगे प्रत्येक प्रयोगात्मक प्रतिकृति के साथ एक नियंत्रण चलाने की जरूरत पर जोर दिया. एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में, एक भी एक पुटिका न तो trypsin और न ही trypsin अवरोध करनेवाला युक्त नमूना उजागर करने के लिए पेप्टाइड के लिए प्रतिक्रिया झल्लाहट उपाय कर सकता है. हालांकि, इस पर नियंत्रण आवश्यक है कि क्रम में पेप्टाइड स्थानान्तरण के लिए डेटा का मूल्यांकन किसी भी अतिरिक्त जानकारी प्रदान नहीं करता है.

एक चिंता का विषय है कि झिल्ली lytic पेप्टाइड्स झिल्ली पर्याप्त permeabilize सकताtrypsin या trypsin अवरोध करनेवाला झिल्ली भर में यात्रा की अनुमति. इस पत्र में उदाहरण के लिए प्रयोग किया जाता पेप्टाइड्स थोड़ा झिल्ली permeabilization कारण दिखाया गया है. बहरहाल, कई झिल्ली lytic पेप्टाइड भी इस 9,16,21,22 और समान स्थानान्तरण assays के लिए उत्तरदायी हैं. यह संभावना है क्योंकि मात्रा ज्यादा vesicles के अंदर से बाहर अधिक है. इस प्रकार, किसी भी trypsin कि पुटिका के बाहर लीक अतिरिक्त trypsin अवरोध करनेवाला द्वारा हिचकते जा सकता है, पुटिका बाहर पेप्टाइड किसी भी दरार को रोकने. इस प्रकार, इस परख से एक सकारात्मक परिणाम की संभावना एक पेप्टाइड कि translocates जबकि अपेक्षाकृत कम से कम झिल्ली विघटन के कारण, vesicles में लीक से अवरोध करनेवाला को रोकने अर्थ. बावजूद, पेप्टाइड संपत्तियों की एक पूरी तरह से विशेषताओं झिल्ली permeabilization के एक आकलन शामिल करना चाहिए.

यह परख प्रयोगात्मक परिस्थितियों की एक व्यापक विविधता के लिए अनुकूलन करने के लिए उत्तरदायी है. यह देखते हुए कि स्थानान्तरण एक मजेदार के रूप में मापा जाता हैप्रोटीन और झिल्ली के बीच संकेत के ction झल्लाहट के रूप में वर्णित इस परख प्रोटीन और पेप्टाइड्स के लिए सबसे अनुकूल अनायास anionic LUVs के साथ संबद्ध है कि, एक tryptophan के अवशेषों होते हैं और tryptophan के अवशेषों के पास trypsin कटौती साइटों है. tryptophan की एक कट साइट के लिए निकटता सुनिश्चित करता है कि tryptophan युक्त टुकड़ा एक नगण्य झिल्ली आत्मीयता है, और इस तरह एक नगण्य संकेत झल्लाहट. हालांकि, एक भी उपयोग के साथ एक उपयुक्त युक्त vesicles tyrosine या अन्य रासायनिक संयुग्मित फ्लोरोसेंट moities युक्त पेप्टाइड्स झल्लाहट स्वीकर्ता सकता है. इसी तरह, trypsin एक protease है कि ब्याज की एक पेप्टाइड में वैकल्पिक कटौती साइटों लक्ष्य के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है. हालांकि, एंजाइम और अवरोध करनेवाला फेरबदल अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता के बाद से कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध trypsins और trypsin inhibitors के एकत्रीकरण या पुटिका नमूनों की अस्थिरता के लिए नेतृत्व हो सकता है. LUVs के लिपिड संरचना में फेरबदल करके, इस परख भी भूमिका निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैकि लिपिड या पेप्टाइड स्थानान्तरण का निर्धारण करने में प्रभारी संरचना नाटकों. इसके अतिरिक्त, इस परख भी आसानी से करने के लिए एक Wimley और सह कार्यकर्ताओं 9 कि समान दृष्टिकोण में स्थानान्तरण की उच्च throughput मापन प्रदान सकता है अनुकूलित किया जा .

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों उपयोगी विचार - विमर्श के लिए Eleanor फ्लेमिंग और जेसिका चेन धन्यवाद देना चाहूंगा. अनुदान एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (एनआईएच NIAID) के द्वारा R15AI079685 पुरस्कार और अनुसंधान निगम Cottrell कॉलेज विज्ञान पुरस्कार प्रदान किया गया. अतिरिक्त छात्र समर्थन हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट और Staley फंड द्वारा प्रदान की गई थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16:0-18:1 PG Avanti Polar Lipid, Inc 840457C
1:18 Dansyl PE Avanti Polar Lipid, Inc 810330C
16:0-18:1 PC Avanti Polar Lipid, Inc 850457C
Porcine trypsin Sigma-Aldrich T-0303
Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor Sigma-Aldrich T-9777
Mini-extruder Avanti Polar Lipid, Inc 610000
Ammonium molybdate (para) Alfa Aesar 10811
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A1417
Hydrogen Peroxide, 30% solution Mallinckrodt Baker Inc. 5240-05
HEPES Sigma-Aldrich H-3375
NaCl Sigma-Aldrich S-9625
EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S-0751

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References

  1. Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they? Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
  2. Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).
  3. Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).
  4. Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).
  5. Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).
  6. Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).
  7. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).
  8. Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).
  9. Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. , (2011).
  10. Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).
  11. Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).
  12. Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochemistry. 44 (30), 10189-10189 (2005).
  13. Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).
  14. Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother? Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).
  15. Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
  16. Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochemistry. 39 (29), 8648-8648 (2000).
  17. Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochemistry. 34 (19), 6521-6521 (1995).
  18. Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).
  19. Torchilin, V. P., Weissig, V. Liposomes. , Oxford University Press. New York. (2003).
  20. Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).
  21. Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).

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आण्विक जीवविज्ञान 59 अंक झिल्ली स्थानान्तरण पुटिका झल्लाहट पेप्टाइड tryptophan
बड़े Unilamellar vesicles में पेप्टाइड स्थानान्तरण माप
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Spinella, S. A., Nelson, R. B.,… More

Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (59), e3571, doi:10.3791/3571 (2012).

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