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Biology

대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

Published: January 27, 2012 doi: 10.3791/3571
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Wellesley College

Summary

이 프로토콜 세부 대형 unilamellar 지질 vesicles로 펩타이드 translocation의 양적 측정을위한 방법입니다. 이 방법은 또한 멤브레인 translocation의 속도에 대한 정보를 제공하고 효율적이고 자발적 지질 bilayers를 건너되는 펩티드를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

쉽게 세포막 수용체 1의 도움없이 세포 세포막을 교차 펩티드에 적극적인 관심이 있습니다. 이들의 대부분은 자주 약물 전달 벡터 1-3으로 자신의 잠재력에 대해 설명되어 있습니다 세포 관통 펩티드,라고합니다. 또한, 특히 4,5 이외의 멤브레인 lytic 메커니즘, 세포 용해를 일으키는 않고 박테리아 세포막을 건너 세포내 프로세스 6,7을 방해하여 세포를 죽일 이들을 통해 작동 항균 펩티드의 증가 관심이 있습니다. 사실, 저자는 점점 더 셀 - 관통 및 항균 펩티드 1,8 사이의 관계를 지적했습니다. 멤브레인 translocation과 펩타이드 구조와 이동시키다하는 기능 사이의 관계 과정의 확실한 이해 translocation에 대한 효과적이고 재현성 assays가 필요합니다. 몇몇 그룹은 대형 unilamel로 translocation을 측정하는 방법을 제안했습니다고맙다 지질 vesicles (LUVs) 9-13. LUVs은 박테리아와 진핵 세포 점막에 대한 유용한 모델로 봉사하고 자주 펩타이드 형광 연구 14,15에 사용됩니다. 여기, 우리는 먼저 이러한 magainin 및 buforin II 16,17으로 항균 펩티드를 고려 마츠 및 동료에 의해 ​​개발된 방법은 우리의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 방법에 대한 우리의 프로토콜을 제공하는 것 외에도, 우리는이 분석을 사용하여 translocation 능력을 quantifies 데이터 분석에 대한 직접적인 접근 방식을 제시한다. 다른 사람에 비해이 translocation 분석의 장점은 멤브레인 translocation의 속도에 대한 정보를 제공하고 트립토판 함유 펩티드로, 펩타이드 특성 18을 변경할 수있는 형광 레이블의 추가를 필요로하지 않습니다 가능성을 가지고 있습니다. 간단히, 지질 vesicles로 translocation 능력은 기본 트립토판의 잔류물와 D 사이의 포스터 공명 에너지 전송 (걱정)의 함수로 측정단백질은 외부와 관련된 ansyl phosphatidylethanolamine은 멤브레인 (그림 1) LUV. 그들은 LUVs와 캡슐 노골적인 트립신 발생으로 휴대 관통 펩티드는 LUV 멤브레인 및 신호를 걱정의 드롭에서 disassociation로 이어지는, 죽습니다. 의 드롭 translocating 펩타이드에 대한 관찰 신호가 LUVs이 트립신 및 트립신 억제제, 또는 때 저절로 지질 세포막을 교차하지 않는 펩타이드가 트립신 함유 LUVs에 노출을 모두 포함하는 동일한 펩타이드에 대한 관찰보다 훨씬 큰 무서워. 형광에이 변경 사항은 시간이 지남에 따라 펩타이드 translocation의 직접 부량을 제공합니다.

Protocol

1. 대형 Unilamellar 지질 Vesicles (LUVs)의 준비

  1. 세포막의 분석 19 싫어하지 '역할을 LUVs를 준비합니다.
  2. 믹스 phosphatidylcholine (POPC, 760.10 g / 몰), phosphatidylglycerol (POPG. 770.99 g / 몰), 5 dimethylaminonaphthalene - 1 - sulfonyl 50 클로로포름에 용해 phosphatidylethanolamine (DNS - 포프, 994.350 g / 몰) (아벤티 폴라 Lipids) : 45:5 비율. 모든 분석은 실험 및 제어 모두 LUVs의 별도의 준비가 필요합니다 마찬가지로 두 개의 지질 케이크 유리병을 준비한다. 총 지질 (0.188 MG POPC, 0.169 MG의 POPG, 그리고 0.019 MG DNS - 교황)의 0.376 MG는 일반적으로 하나의 translocation 시험에 대한 충분한 vesicles를 만들기 위해 충분하다.
  3. N 2 가스 스트림을 사용하여 클로로포름에서 증발.
  4. 지질 케이크에게 진공 건조기에서 9~14시간을 건조.
  5. 주식 10 MM의 HEPES 버퍼 솔루션 (10 MM의 HEPES, 238.3 g / 몰, 45 MM NaCl, 58.44 g / 몰, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 372.24 g / 몰 산도 7.4) 준비합니다. HEPES 완충액은 일입니다4 ° C.에 ored
  6. 위의 준비 10 MM HEPES 버퍼에서 0.4 mm까지 돼지의 트립신 (23.3 ㎏ / 몰)의 주식 솔루션을 준비합니다. 트립신은 -20 ° C에서 저장되고, 우리의 실천, 보통 사용하기 전에 2 개 이상의 동결 - 해동주기를 받아야하지 않습니다.
  7. -20 ° C. 10 MM의 HEPES 버퍼 솔루션과 저장소에있는 4.0 밀리미터 보먼 - Birk 트립신 억제제 (8 ㎏ / 몰)의 주식 솔루션을 준비 우리의 사용이 주식은 매월 보충함하고 그것이 다시 만들어지기 전에 보통 3 개 이상 동결 / 해동주기를 받아야하지 않습니다.
  8. 0.4 MM 트립신 재고 및 말린 지질 케이크 10 MM HEPES 버퍼 솔루션의 동일한 볼륨을 추가하여 0.2 MM의 트립신 솔루션 Reconstitute 실험 multilamellar vesicles (MLVs). 0.376 MG 총 지질의 단일 샘플 들어, 트립신 솔루션과 HEPES 완충액 150 μL의 150 μL의 혼합물은 충분합니다.
  9. 0 동등한 볼륨을 추가하여 0.2 MM 트립신 및 2.0 MM 보먼 - Birk 트립신 억제제와 솔루션에 Reconstitute 제어 MLVs.4 MM 트립신 재고 및 말린 지질 케이크 4.0 MM 트립신 억제제. 0.376 MG 총 지질의 단일 샘플 들어, 트립신 솔루션과 트립신 억제제 150 μL의 150 μL의 혼합물은 충분합니다.
  10. 유리 튜브에서 1.7 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송 MLV 솔루션.
  11. 액체 질소 5 동결 / 해동주기에 따라 MLV는 솔루션을 제공합니다.
  12. 각 테플론 압출기 기사에 HEPES 버퍼에 moistened이 필터 지원을 배치하여 지질 압출기를 (아벤티 폴라 Lipids) 준비합니다. 두 테플론 압출기 조각 사이에 0.1 μm의 모공 (워트 먼지, 영국)와 nuclepore 트랙 새겨져 멤브레인를 삽입하고 금속 압출기 용기 내부의 압출기의 조각을 넣으십시오. 압출기 용기의 금속 위로 강화하고 홀더에 넣어 전에 두 압출기 조각을 통해 도넛 스페이서를 넣으십시오.
  13. 소포 샘플의 손실을 방지하기 위해 250 μL 유리 주사기를 사용하여 500 μL 10 MM의 HEPES 버퍼와 압출기 내에서 무효 볼륨을 채우십시오. </ 리>
  14. 압출기에 각 MLV 샘플을로드하고 세포막을 통해 균일한 unilamellar 소포 크기를 보장하기 위해 최소한 21 번 샘플을 누르십시오. LUVs은 MLV 솔루션 다음 압출에서 얻을 수 있습니다.
  15. 4 저장 LUVs ° C 및 48 시간 이내에 사용합니다.

2. Quantifying은 집중력 LUV

  1. LUV 농도는 샘플 20 전체 인의 함량을 결정하여 계량했다.
  2. 상온에서 nanopure 물 저장 4 SO 8.9 NH 2를 준비합니다.
  3. 2.5 % W / V 암모늄 molybdate VI (588.04 g / 몰) nanopure 물의 솔루션을 준비합니다. 10 % W / V 아스코르비 산 (176.1 g / 몰) nanopure 물의 솔루션을 준비합니다. 튜브 호일로를 덮고하여 빛의 노출에서 아스코르비 산 솔루션을 보호할 수 있습니다. 최대 2 개월 동안 4 ° C에서 두 솔루션을 저장합니다.
  4. 0.65 MM 인산 버퍼 솔루션 (일염기의 무수 인산 나트륨, 120g / 몰) 준비합니다.
  5. 여섯 표준 부엉 준비bes. 표준 0.0 μL, 50 μL (0.0325 μmoles), 100 μL (0.065 μmoles), 175 μL (0.114 μmoles), 250 μL (0.163 μmoles) 또는 인 솔루션의 350 μL (0.228 μmoles)를 포함해야합니다.
  6. 세중의에서 샘플 튜브를 LUV 준비합니다. 각 샘플 튜브 LUVs의 약 0.1 μmoles를 포함해야합니다. 실험 및 제어 농도가 별도로 측정해야합니다 LUV.
  7. 보먼 - Birk 억제제 가루에 말린 인의 소금에 대한 해결하려면 컨트롤 빈이 준비되어야합니다 LUV. 샘플 튜브 LUV 컨트롤에 배치되면서 빈은 0.2 MM MM trypsin/2.0 보먼 - Birk 억제제 솔루션의 동일한 볼륨을 포함해야합니다.
  8. 표준 샘플, 그리고 빈 튜브의 각에 8.9 NH 2 SO 4의 장소 450 μL.
  9. 175-210에서 열 샘플, 표준, 25 분 동안 공백 ° C 오븐에.
  10. 모든 튜브를 제거하고 괜찮아 수 있습니다. 부엉의 각 30 % H 2 O 2 150 μL 추가bes.
  11. 열 샘플, 표준 및 175-210에서 30 분 여백 ° C.
  12. 샘플, 표준 및 열을에서 공백을 제거합니다. 솔루션 중 하나가 아직 무색하지 않은 경우, 175-210시 추가 15 분 동안 모든 튜브와 열 ° C. 50 μL H 2 O 2를 추가
  13. 3.9 ML nanopure H 2 O, 0.5 ML의 암모늄 molybdate 솔루션과 각각의 튜브에 0.5 ML의 아스코르비 산 솔루션을 추가합니다.
  14. 끓는 물에 목욕에 5~7분 모든 튜브를 가열.
  15. 애질런트 8453 UV - 보이는 분광 광도계를 사용하여 820 nm의 각 표준 및 시료의 흡광도를 측정. 0.0 mmoles의 인을 포함하는 튜브는 모든 표준 및 실험을위한 빈으로 사용해야하는 것은 샘플을 LUV. 0.2 MM MM trypsin/2.0 보먼 - Birk 억제제 솔루션을 포함하는 튜브 컨트롤의 빈으로 사용해야하는 것은 샘플을 LUV.
  16. 선형 흡수 대 인 콘텐츠 표준 곡선은 생산 전체 phosph를 계산하는 데 사용할 수 있습니다orus 내용과 샘플의 농도를 LUV.

3. 펩타이드 솔루션을 준비

  1. nanopure H 2 O.의 펩타이드를 해산 설명한대로이 분석에 사용되는 펩티드 하나 트립토판 잔류물을 포함해야합니다.
  2. 세중의에서 282 nm의에서 펩타이드 솔루션의 흡광도를 측정. 5700 M -1 cm -1의 트립토판을위한 어금니 흡광 계수를 사용하여 펩타이드 농도를 계산합니다.
  3. 30 μm의의 최종 농도 nanopure 물의 펩타이드를 희석. -20 ° C에 보관

4. Translocation의 부량

  1. 1.7 ML의 microcentrifuge 튜브의 실험 및 제어 샘플을 준비합니다. 250 μm의의 최종 농도는 각 솔루션에 충분한 LUVs를 추가합니다. 그 억제제가 트립신 농도보다 큰 10X 최종 농도가되도록 충분히 보먼 - Birk 억제제 솔루션을 추가합니다. 450 μL에 최종 솔루션 볼륨을 가지고 충분한 10 MM의 HEPES 버퍼를 추가합니다.
    2. <Starna 마이크로 쿼츠의 fluorometer 전지로 리> 소 50 μL 펩타이드 솔루션입니다. LUVs과 펩타이드 사이의 비율은 아무도 소포로 translocated없는 경우에도 거의 모든 그대로 펩티드가 무서워에게 신호를주는 dansyl 그룹에 가까운 정도로 가까이에있는 것을 보장하기 위해 충분히 높습니다. 이것은 유사한를하고 vesicles로 이동시키다하지 펩티드​​에 대한 컨트롤 상태에서 관찰 걱정과 일치합니다.
  2. cuvette에있는 펩타이드 솔루션 실험 또는 제어 샘플을 추가합니다. 이 3 μm의하는 최종 펩타이드 농도를 가지고해야합니다.
  3. 초당 최소 한번은 형광 독서를 복용, 실험이나 제어뿐만 아니라 즉시 25 분 형광등 속도론 실험 솔루션을 LUV을 시작합니다. 25-280 nm의에서 여기 파장 525 nm의에서 방출 파장과 온도를 설정 ° C. 캐리 이클립스 형광 분광 광도계를 사용하여, 우리가 고등에게 PMT 감도를 설정할 수 있습니다.

5. 양적 Translocation 비율을 생성

  1. 데이터 수집의 십오초 후 형광 읽기로 초기 형광 (F O)를 정의합니다. 우리 악기 설정에서, 우리는 수집된 형광 데이터의 첫 번째 15 초 샘플 추가시 시스템에 샘플 챔버를 닫고, 다른 perturbations, 때문에 혼합하기 위해 신뢰할 수있는 것으로 나타났습니다. 각각의 시점에 상대 형광을 (F / F 0) 취득 F O 각 후속 독서를 나누십시오.
  2. 평균 실험의 마지막 순간에서 모든 상대적인 형광 수치가 최종 평균 상대 형광을 얻기 위해 [F / 정] 평균 .
  3. 을 나누기 [F / 정] 평균 에 의해 제어 샘플 [F / 정] 평균 실험 샘플 수정 최종 형광 값을 얻을 수 있습니다.
르 "> 6. 대표 결과

그림 2는 강력한 translocation을 보여준 대표적인 펩타이드이 분석의 결과를 보여줍니다. 이 실험 (검은색 추적)의 신호는 시간이 지남에 따라 신호를 걱정에 표시된 드롭을 보여줍니다. 그러나, 그것은 불완전 트립신 억제 또는 translocation의 능력과 관계없는 기타 요인으로 인해 신호를 걱정의 가능성 손실을 제어하는​​ 것이 중요합니다. 이를 위해, 우리는 항상 또한, 펩타이드 및 트립신과 보먼 - Birk 트립신 억제제 (회색 추적, 그림 2)를 모두 포함하는 LUVs 사이의 신호를 무서워 측정합니다. 우리 손으로, 그것은 실험이 실행될 때마다 모든 펩타이드에 대해이 컨트롤을 수행하는 것이 중요했습니다. 이것은 우리가 명확하게 지질 소포를 준비하거나 일반적으로 이러한 농도에서 관찰 상대적으로 약한 형광 신호를 미칠 수 있습니다 악기 소음, 사이에 차이로 인해 신호의 변경 사항에 대한 정확한 수 있습니다.

컨트롤 expe의 중요성트립신 억제제를 포함하는 LUVs를 사용 riment는 그림 3에 표시된 데이터로 강조 표시됩니다. 이 경우에는 펩타이드 신호 실험 샘플 (블랙 추적)의 그림 2에서와 비슷한 금액을 감소. 그러나, 컨트롤 샘플이 펩타이드에 대한 좀 더 빠른 감소를 보여주는 그물 translocation이 낮은 그럼.

우리의 프로토콜 제 5 본 실험에서 translocation을 quantifying위한 간단한 방법을 설명합니다. 높은 translocation 비율 효율적으로 이동시키다 펩티드 지표되며 그림 2에 표시된 세포 관통 펩티드에 대한 translocation의 비율은 1.16이며, 약하게 translocating 펩티드가 가까이 1 translocation 비율을 가지고있는 동안. 우리의 경험에서, 다른 소포의 준비와 수행 세 독립적인 실험에 대한 표준 오차는 0.01-0.06의 범위에 있습니다.

그림 1
그림 1. translocat의 개략도이온 분석. 실험은 샘플 (A)가 형광등 dansyl 교황 (검은 막대)와 도핑된 있으며, 트립신 (가위)를 포함하는 캡슐 LUV. 트립신 억제제 (빨간색 동그라미)은 LUVs 외부 트립신을 억제하는 데 사용됩니다. LUVs는 펩타이드 (보라색)에 노출되어 있습니다. 과 펩타이드 협회가 translocting 펩티드는 노골적인 내부 트립신 발생으로 감소 신호 (녹색)을 걱정 세포막의 산출을 LUV. 트립신과 트립신 억제제가 모두 통제 캡슐 아르는 (B) translocation 관련없는 신호를 걱정의 감소를 측정하기위한 샘플을 LUV.

그림 2
그림 2. 세포 관통 펩티드에 대한 대표적인 데이터. 항균 pepide을 translocating 대표는 제어에 비해 신호를 걱정에 큰 방울을 보여줍니다.

그림 3
그림3. 컨트롤의 중요성을 강조 대표 데이터. 않은 translocating 펩타이드의 tryptic 소화가 완전히 억제는 실험과 제어 모두에서 시간이 지남에 따라 신호를 걱정에서 드롭으로 연결 솔루션을 LUV. 제어 및 실험 트레이스 간의 차이가 비교적 적은이기 때문에,이 돌연변이가 약하게 translocating 펩타이드로 특징입니다.

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Discussion

여기에 제시 프로토콜은 내부 지질 vesicles 외부 펩티드의 농도에 상대적인 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 변경 사항은 translocation 능력에 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 약물 전달 벡터로서 잠재력을 지닌 세포 관통 펩티드를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 세포 관통 펩티드에 대한 흥미가 증가함에 따라, 직접 translocation 이벤트를 측정할 방법이 정량 방식으로 개발하고 사용하는 방식을 볼 수 재미있을 것입니다.

우리가 실험실에서, 우리는 분석의 일관성이 조심스럽게 실험의 몇 가지 특정 측면을 모니터링하여 향상시킬 수 것으로 나타났습니다. 첫째, 실험 및 제어 모두 vesicles의 부량이 프로토콜을 사용하여 얻은 결과의 일관성을 향상시킵니다. 이 분석은 또한 이전에 단백질 translocation과 소화의 시작 부분에 정확한 초기 형광을 감지하는 능력에 따라 달라집니다. 따라서, 그것은 fluore을 위해 필수적이며,즉시 단백질이나 펩타이드로 시작하는 카메라는 신호 수집 LUV 솔루션에 노출됩니다. 이 분석은 또한 사용되는 특정 트립신 억제제에 민감, 현재까지, 우리는 보먼 - Birk 트립신 억제제 (시그마 T - 9777)로 가장 일관된 결과를 획득했습니다. 중요한 제어 시나리오에서 관찰 저하의 정도는 펩티드합니다 (그림 2, 3으로 강조) 사이와 같은 펩타이드에 대해 서로 다른 소포를 준비 사이에 어떤 경우에는 상당히 다를 것 같다. 이 추가는 각 실험 복제와 컨트롤을 실행하기 위해 필요 강조합니다. 추가 제어로, 하나는 트립신이나 트립신 억제제도를 포함하는 소포 샘플에 노출 펩타이드에 대한 걱정 응답을 측정할 수 있습니다. 그러나이 컨트롤은 펩타이드 translocation에 대한 데이터를 평가하기 위해 필요한 추가 정보를 제공하지 않습니다.

한 우려는 멤브레인 - lytic 펩티드가 충분히 막을를 permeabilize 수 있습니다트립신 또는 멤브레인 전체 여행 트립신 억제제를 허용합니다. 이 문서에서 예제에 사용되는 펩티드는 작은 멤브레인 permeabilization를 일으킬 표시되었습니다. 그럼에도 불구하고, 많은 멤브레인 - lytic의 펩티드도 이것과 유사한 translocation의 assays 9,16,21,22 의무가 있습니다. 볼륨이 vesicles 내부보다는 외부에서 훨씬 더 있기 때문에이 가능성이 높습니다. 따라서 소포의 누출 밖은, 초과 트립신 억제제에 의해 저해 수있는 트립신은 소포 외부 펩타이드의 절단을 방지. 따라서이 분석에서 긍정적인 결과는 가능성 vesicles로 누출로부터 억제제를 예방, 상대적으로 최소한의 멤브레인 혼란을 일으키는 동안 translocates 펩타이드를 나타냅니다. 에 관계없이, 펩타이드 속성의 철저한 특성은 멤브레인 permeabilization의 평가를 포함해야합니다.

이 분석은 실험 상황의보다 다양한 적응 의무가 있습니다. translocation이 재미로 측정됩니다 것을 감안할 때의 ction은이 분석은 단백질 및 펩티드에 가장 적합한 음이온 LUVs와 함께 자발적으로 연결되는 하나의 트립토판 성분을 포함하고 트립토판 잔류물 근처 트립신 컷 사이트를있다. 것입니다 설명, 단백질과 막 사이의 신호를 걱정 컷 사이트에 트립토판의 가까이 트립토판이 들어있는 조각은 무시할 수 멤브레인 친화 있다고 보장하고, 따라서 무시할 수는 신호를 무서워. 그러나, 하나도 해당이 포함된 vesicles와 함께 티로신 또는 기타 화학적 복합 형광 moities을 포함하는 펩티드는 수용체를 무서워 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 트립신은 관심있는 펩타이드의 대체자를 사이트를 대상으로 다른 프로 테아제로 대체 될 수 있습니다. 일부 상용 trypsins 및 트립신 억제제가 집합이나 소포 샘플의 불안정성에 LED 이후 그러나, 효소와 억제제를 변경하면 추가 최적화를 필요로 할 수 있습니다. LUVs의 지질 구성을 변경하여,이 분석은 또한 역할을 결정하는 데 사용할 수 있습니다펩타이드 translocation 결정에 지질 요금이나 구조 재생됩니다. 또한이 분석은 또한 쉽게 ​​Wimley 및 동료 9 비슷한 접근 translocation의 높은 처리량 측정을 제공하기 위해 적응 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

저자가 도움이 토론에 대한 우리 부부는 플레밍과 제시카 첸 감사하고 싶습니다. 자금은 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIH - NIAID) 수상 R15AI079685 및 연구 회사 Cottrell 대학 과학 수상에 의해 제공되었다. 추가 학생 지원은 하워드 휴즈 의학 연구소와 스탤리가 기금에​​ 의해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16:0-18:1 PG Avanti Polar Lipid, Inc 840457C
1:18 Dansyl PE Avanti Polar Lipid, Inc 810330C
16:0-18:1 PC Avanti Polar Lipid, Inc 850457C
Porcine trypsin Sigma-Aldrich T-0303
Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor Sigma-Aldrich T-9777
Mini-extruder Avanti Polar Lipid, Inc 610000
Ammonium molybdate (para) Alfa Aesar 10811
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A1417
Hydrogen Peroxide, 30% solution Mallinckrodt Baker Inc. 5240-05
HEPES Sigma-Aldrich H-3375
NaCl Sigma-Aldrich S-9625
EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S-0751

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분자 생물학 제 59 멤브레인 translocation 소포는 펩타이드 트립토판을 걱정
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Spinella, S. A., Nelson, R. B.,… More

Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (59), e3571, doi:10.3791/3571 (2012).

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