Summary
Detta protokoll detaljer en metod för kvantitativ mätning av peptiden translokation i stora unilamellar lipid blåsor. Denna metod ger också information om graden av membranet translokation och kan användas för att identifiera peptider som effektivt och spontant över lipid bilayers.
Abstract
Det finns ett aktivt intresse för peptider som lätt passera cellmembran utan hjälp av receptorer på cellens membran 1. Många av dessa kallas cell-penetrerande peptider, som ofta är kända för sin potential som drug delivery vektorer 1-3. Dessutom finns ett ökat intresse för antimikrobiella peptider som verkar via icke-membran lytisk mekanismer 4,5, särskilt de som korsar bakteriemembran utan att orsaka cellslys och döda celler genom att störa intracellulära processer 6,7. I själva verket har författarna pekat alltmer ut förhållandet mellan cell-penetrerande och antimikrobiella peptider 1,8. En fast förståelse av processen membranet translokation och förhållandet mellan peptiden struktur och dess förmåga att translocate kräver effektiv, reproducerbara analyser för translokation. Flera grupper har föreslagit metoder för att mäta translokation i stora unilamelLAR lipid blåsor (LUVS) 9-13. LUVS fungera som användbara modeller för bakterier och eukaryota cellens membran och används ofta i peptid fluorescerande studier 14,15. Här beskriver vi vår tillämpning av metoden utvecklades först av Matsuzaki och medarbetare att överväga antimikrobiella peptider, som magainin och buforin II 16,17. Förutom att ge våra protokoll för denna metod, presenterar vi också en enkel metod för analys av data som anger translokationen förmåga att använda denna analys. Fördelarna med denna translokation analys jämfört med andra är att den har potential att ge information om graden av membranet förflyttning och inte kräver tillsats av en fluorescerande märkningen, som kan förändra peptid egenskaper 18, tryptofan som innehåller peptider. Kortfattat är translokation förmågan till lipid blåsor mätt som en funktion av Foster Resonance Energy Transfer (FRET) mellan infödda tryptofan rester och dansyl fosfatidyletanolamin när proteiner associerade med externa LUV membran (figur 1). Cellpenetrerande peptider klyvs när de möter hämningslös trypsin inkapslad med LUVS, vilket leder till avståndstagande från LUV membranet och en nedgång i FRET signal. Nedgången i FRET signalen observeras under en translocating peptid är betydligt större än den som observerades för samma peptiden när LUVS innehåller både trypsin och trypsin inhibitor, eller när en peptid som inte spontant över lipid membraner är utsatt för trypsin innehåller LUVS. Denna förändring i fluorescens ger en direkt kvantifiering av peptid translokationen över tiden.
Protocol
1. Beredning av Stora Unilamellar Lipid Blåsor (LUVS)
- Förbered LUVS att fungera som cellmembranet härmar för analysen 19.
- Blanda fosfatidylkolin (POPC, 760,10 g / mol), phosphatidylglycerol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl fosfatidyletanolamin (DNS-Pope, 994,350 g / mol) (Avanti Polar lipider) upplöst i kloroform i en 50 : 45:5 förhållande. Som varje analys kräver separat beredning av både experimentella och kontroll LUVS bör två lipid tårta flaskor vara beredd. 0,376 mg av totala lipider (0,188 mg POPC, 0,169 mg POPG och 0,019 mg DNS-påve) är oftast tillräckligt för att göra tillräckligt vesikler för en enda translokation rättegång.
- Indunsta kloroform med en N 2 gasström.
- Torka lipid kakan 9-14 timmar i vakuumexsickator.
- Förbered ett lager 10 mM HEPES buffertlösning (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). HEPES buffert stored vid 4 ° C.
- Bered en stamlösning av 0,4 mm svin trypsin (23,3 kg / mol) i 10 mM HEPES buffert beredd ovan. Trypsin lagras vid -20 ° C och i vår praktik, brukar inte genomgå mer än 2 frys-tö-cykler före användning.
- Bered en stamlösning av 4,0 mM Bowman-Birk trypsin inhibitor (8 kg / mol) i 10 mM HEPES buffertlösning och förvara vid -20 ° C. I vår användning är detta bestånd fyllas på varje månad och kräver vanligen inte genomgå mer än 3 frys / cykler tina innan det sker igen.
- Bered experimentella multilamella blåsor (MLVs) i en 0,2 mM trypsin lösningen genom att tillsätta en lika stor volym 0,4 mm trypsin lager och 10 mM HEPES buffertlösning till torkade lipid kakan. För en enda urval av 0,376 mg totalt fett, är en blandning av 150 mikroliter av trypsin lösningen och 150 mikroliter av HEPES buffert tillräcklig.
- Bered kontroll MLVs i en lösning med 0,2 mM trypsin och 2,0 mm Bowman-Birk trypsininhibitorerna genom att lägga till en lika stor volym av 0.4 mm trypsin lager och 4,0 mm trypsininhibitorerna till torkade lipid kakor. För en enda urval av 0,376 mg totalt fett, är en blandning av 150 mikroliter av trypsin lösningen och 150 mikroliter av trypsin inhibitor tillräcklig.
- Överföring MLV lösningar från glasflaskor till 1,7 ml mikrocentrifugrör.
- Ämne MLV lösningar till 5 frys / tö cykler i flytande kväve.
- Förbered lipid extruder (Avanti Polar lipider) genom att placera två filtret stöder fuktad med HEPES buffert på varje Teflon extrudern bit. Placera en nuclepore låt etsade membran med 0,1 ìm porer (Whatman, Förenade kungariket) mellan de två teflon extrudern bitar, och placera extruder bitarna inuti metallen extrudern kapseln. Placera donut spacer under de två extrudern bitarna innan du drar åt metall toppen av extruder behållaren och placera den i hållaren.
- Fyll tomrummet volym inom extruder med 500 mikroliter 10 mM HEPES buffert med hjälp av en 250 mikroliter glasspruta att förhindra förlust av vesikler prov. </ Li>
- Ladda varje MLV provet i extruder och tryck provet genom membranet minst 21 gånger för att säkerställa en enhetlig unilamellar vesikler storlek. LUVS erhålls från MLV lösning efter extrudering.
- Förvara LUVS vid 4 ° C och använd inom 48 timmar.
2. Kvantifiera LUV Koncentration
- LUV koncentration kvantifierades genom att bestämma den totala fosforhalten i provet 20.
- Förbered 8,9 NH 2 SO 4 i nanopure vatten och förvara i rumstemperatur.
- Bered en 2,5% w / v ammoniummolybdat VI (588,04 g / mol) lösning i nanopure vatten. Bered en 10% w / v askorbinsyra (176,1 g / mol) lösning i nanopure vatten. Skydda lösningen askorbinsyra från ljusexponering genom att täcka röret med folie. Förvara båda lösningarna vid 4 ° C i upp till 2 månader.
- Förbered 0,65 mm lösning fosfatbuffert (monobasiskt vattenfri natriumfosfat, 120 g / mol).
- Förbered sex standard TUbes. Standarder bör innehålla 0,0 mikroliter, 50 mikroliter (0,0325 μmoles), 100 mikroliter (0,065 μmoles), 175 mikroliter (0,114 μmoles), 250 mikroliter (0,163 μmoles) eller 350 mikroliter (0,228 μmoles) av fosfor lösning.
- Förbered LUV provrören i tre exemplar. Varje provrör bör innehålla cirka 0,1 μmoles av LUVS. Experimentella och kontroll LUV koncentrationer måste mätas separat.
- För att korrigera för eventuella torkade fosfor salter i Bowman-Birk hämmare pulver, en kontroll LUV tomt måste vara beredda. Den tomma bör innehålla samma volym av 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk hämmare lösning som var placerad i kontrollgruppen LUV provröret.
- Plats 450 mikroliter av 8,9 NH 2 SO 4 i varje av provet, standard, och tomma rör.
- Värme prover, standarder och ämnen för 25 minuter vid 175-210 ° C i en ugn.
- Ta bort alla slangar och låt dem svalna. Tillsätt 150 mikroliter 30% H 2 O 2 till envar av de tubes.
- Värme prover, standarder och ämnen för 30 minuter vid 175-210 ° C.
- Ta bort prover, standarder och blanka från värme. Om någon av lösningarna är ännu inte färglösa, tillsätt 50 mikroliter H 2 O 2 till alla rör och värme i ytterligare 15 minuter vid 175-210 ° C.
- Tillsätt 3,9 mL nanopure H 2 O, 0,5 ml ammoniummolybdat lösning och 0,5 ml askorbinsyra lösning till varje rör.
- Värm alla rör i 5-7 minuter i kokande vattenbad.
- Mät absorbansen för varje standard och prov vid 820 nm med en Agilent 8453 UV-Synligt spektrofotometer. Röret innehåller 0,0 mmol fosfor bör användas som tomt för alla normer och experimentella LUV prover. Röret med 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk hämmare lösning bör användas som tomt för kontroll LUV prov.
- En linjär absorbans mot fosfor standardkurva kan produceras och användas för att beräkna den totala phosphOrus innehåll och LUV koncentration av proverna.
3. Förbereda Peptide Lösningar
- Lös peptid i nanopure H 2 O. Peptider som används i denna analys som beskrivs måste innehålla en tryptofan rester.
- Mät absorbansen av peptiden lösning vid 282 nm i tre exemplar. Beräkna peptid koncentration med molära extinktionskoefficienten för tryptofan av 5700 m -1 cm -1.
- Späd peptid i nanopure vatten till en slutlig koncentration av 30 mikroM. Förvara vid -20 ° C
4. Translokation Kvantifiering
- Förbered experimentella och kontrollprov i 1,7 rör ml mikrocentrifug. Lägg tillräckligt LUVS till varje lösning för en slutlig koncentration av 250 mikroM. Lägg tillräckligt Bowman-Birk hämmare lösning så att hämmare är en slutlig koncentration 10X större än trypsin koncentration. Lägg tillräckligt med 10 mM HEPES buffert för att få den slutliga lösningen volymen till 450 mikroliter. <li> Plats 50 mikroliter peptid lösningen i en Starna mikro kvarts fluorometer cell. Förhållandet mellan LUVS och peptid är tillräckligt hög för att säkerställa att så gott som alla intakta peptider är i tillräckligt nära anslutning till en dansyl grupp för att ge en FRET signal även om ingen har flyttad in i vesikler. Detta är i linje med liknande FRET observerades i kontroll förutsättningarna för peptider som gör och inte translocate i blåsor.
- Lägg till den experimentella eller kontroll provet till peptiden lösningen i kyvetten. Detta bör få den slutliga peptid koncentrationen till 3 mikrometer.
- Börja en 25 minuters fluorescerande kinetik experimentera omedelbart efter tillägg av experimentella eller kontroll LUV-lösning, med en fluorescens läsa minst en gång per sekund. Ställ excitationsvåglängden vid 280 nm, utsläpp våglängd 525 nm, och temperaturen till 25 ° C. Med hjälp av en Cary Eclipse Fluorescens Spektrofotometer, sätter vi PMT känslighet för höga.
5. Generera en kvantitativ Translokation Ratio
- Definiera första fluorescens (F o) som fluorescens läsa efter femton sekunder av datainsamling. I vårt instrument installation har vi funnit att de första femton sekunderna av fluorescens insamlade data inte är tillförlitliga pga mixning, stänger provkammaren och andra störningar i systemet efter tillsats av provet. Dela varje efterföljande behandling F o för att få relativa fluorescens (F / F 0) vid varje tidpunkt.
- Genomsnittlig alla relativa fluorescens avläsningar från den sista minuten av försöket att framställa en slutlig genomsnittliga relativa fluorescens
![[F / Fo] avg](//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg)
. - Dela upp för kontrollprov av för experimentella prov för att erhålla en korrigerad sista fluorescens värde.
![[F / Fo] avg](http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg)
. Figur 2 visar resultatet av denna analys för en representativ peptid som visade robust translokation. Signalen i detta experiment (svarta spår) visar en markant nedgång i FRET signal över tiden. Det är dock viktigt att kontrollera för den potentiella förlusten av FRET signal på grund av ofullständig trypsin hämning eller andra faktorer som inte är translokation förmåga. För detta ändamål har vi alltid också mäta FRET signalen mellan peptid och LUVS innehåller både trypsin och Bowman-Birk trypsin inhibitor (grå spår, figur 2). I våra händer har det varit viktigt att utföra denna kontroll för varje peptid varje gång ett experiment körs. Detta tillåter oss att tydligt korrigera för eventuella förändringar i signalen beroende på eventuella skillnader mellan preparat lipid vesikler eller instrument buller, vilket kan ha betydelse för den relativt svaga fluorescerande signaler vanligtvis observeras vid dessa koncentrationer.
Vikten av kontroll erfarenriment med LUVS innehåller trypsininhibitorerna understryks av de data som visas i figur 3. I detta fall minskade peptid signalen lika mycket som i figur 2 i den experimentella provet (svarta spår). Dock visar kontrollprovet en snabbare minskning för denna peptid, så dess netto translokation är lägre.
5 § i våra protokoll beskriver en enkel metod för att kvantifiera flyttning från detta experiment. Högre translokation nyckeltal är ett tecken på peptider som translocate effektivt, det translokation kvoten för cellen penetrerande peptid som visas i figur 2 är 1,16, medan svagt translocating peptider har translokation nyckeltal närmare 1. Enligt vår erfarenhet är att standardfelet för tre oberoende försök genomförts med olika vesikler förberedelserna i intervallet 0,01 till 0,06.
Figur 1. Schematisk bild av translocatjon-analysen. Experimental LUV prover (A) är dopade med fluorescerande dansyl Pope (svarta staplar) och innehåller inkapslade trypsin (sax). Trypsininhibitorer (röd cirkel) används för att hämma trypsin utanför LUVS. Den LUVS utsätts för peptid (lila). Peptid samarbete med LUV membran ger ett FRET signal (grön) som minskar som translocting peptider möter ohämmade interna trypsin. Både trypsin och trypsin inhibitor är inkapslade i kontroll LUV prover (B) för att mäta minskning FRET signal samband med flyttning.
Figur 2. Representativa uppgifter för en cell-penetrerande peptider. En representant translocating antimikrobiella pepide visar en betydande nedgång i FRET signal jämfört med kontroll.
Figur3. Representativa uppgifter belysa vikten av kontroll. Ofullständig hämning av Tryptic rötning av icke-translocating peptid leder till en nedgång i FRET signal över tiden i både experimentell och kontroll LUV lösningar. Eftersom skillnaden mellan kontroll och experimentella spår är relativt liten, detta är mutant karaktäriseras som ett svagt translocating peptid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet presenteras här kan användas för att bedöma den relativa förändringen i koncentration av peptider i och utanför lipid blåsor. Dessa förändringar är relaterade till translokation förmåga. Detta protokoll kan användas för att identifiera cellpenetrerande peptider med potential som vektorer drug delivery. Liksom intresset för cell-penetrerande peptider växer, kommer det att bli intressant att se hur metoder som direkt mäter translokation händelsen utvecklas och användas i en kvantitativ sätt.
I vårt labb har vi funnit att enhetligheten i analysen kan förbättras genom att noggrant övervaka några särskilda aspekter av försöket. Först förbättrar kvantifiering av både experimentella och kontroll vesiklar konsekvens av de resultat som erhålls med detta protokoll. Denna analys beror också på förmågan att detektera en noggrann inledande fluorescens före början av protein translokation och matsmältning. Därför är det viktigt att fluorescence signal kollektion till att börja så snart protein eller peptid utsätts för LUV lösningen. Denna analysmetod är också känsligt för de särskilda trypsin används hämmare, hittills har vi fått den mest konsekventa resultat med Bowman-Birk trypsin inhibitor (Sigma T-9777). Viktigt verkar graden av nedbrytning observerats i kontrollen scenarier för att variera avsevärt mellan peptider (vilket betonas i figurerna 2 och 3) och i vissa fall mellan olika vesikler förberedelser för samma peptid. Denna ytterligare understryker behovet av att köra en kontroll med varje experimentell replikering. Som en ytterligare kontroll, kan man mäta också FRET svaret för peptid som utsätts för en vesikler prov som innehåller varken trypsin eller trypsin inhibitor. Däremot ger denna kontroll inte någon ytterligare information som är nödvändig för att utvärdera data för peptid translokation.
Ett bekymmer är att membran-lytisk peptider kunde permeabilize membranet tillräckligt för atttillåter trypsin eller trypsininhibitorerna att resa över membranet. De peptider som används för exemplen i denna uppsats har visat sig orsaka små membran permeabilization. Trots många membran-lytisk peptider är också mottagliga för detta och liknande analyser translokation 9,16,21,22. Detta är sannolikt eftersom volymen är mycket större utanför än inne i blåsor. Således, alla trypsin som läcker ut från vesikler kan hämmas av överskott trypsin inhibitor, förhindra klyvning av peptid utanför vesikler. Således betecknar ett positivt resultat av denna analys sannolikt en peptid som translocates samtidigt som de orsakar relativt minimal membran störningar, förhindra hämmare läcker in i blåsor. Oavsett bör en grundlig karaktärisering av peptid fastigheter innehålla en bedömning av membran permeabilization.
Denna analysmetod är mottaglig för anpassning till ett bredare utbud av experimentella förhållanden. Med tanke på att translokation mäts som en kulInsatser för FRET signal mellan protein och membran, som beskrivs denna analys är bäst lämpade för proteiner och peptider som spontant förknippar med anjoniska LUVS, innehåller en tryptofan rester och har trypsin klippa som ligger nära den tryptofan rester. Närheten av tryptofan till ett snitt webbplats garanterar att fragmentet som innehåller tryptofan har försumbar membran samhörighet och därmed en försumbar FRET signal. Däremot kunde man också använda peptider som innehåller tyrosin eller andra kemiskt konjugerade fluorescerande moities tillsammans med blåsor som innehåller en lämplig FRET acceptor. Likaså kan trypsin ersättas med ett annat proteas som mål alternativt skära platser i en peptid av intresse. Kan dock förändra enzymet och hämmar kräva ytterligare optimering eftersom vissa kommersiellt tillgängliga trypsins och hämmare Trypsin lett till aggregering eller instabilitet i vesikler prover. Genom att ändra lipid sammansättning LUVS, kan denna analys även användas för att avgöra vilken rollatt lipid avgift eller spelar struktur bestämma peptid translokation. Dessutom kan denna analys också vara lätt anpassas för att ge hög kapacitet mätningar av translokation i en strategi liknande den som Wimley och medarbetare 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Eleanor Fleming och Jessica Chen för bra diskussioner. Finansieringen kom från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (NIH-NIAID) Tilldelningskriterier R15AI079685 och Research Corporation Cottrell College Science Award. Ytterligare studentstöd lämnades av Howard Hughes Medical Institute och Staley fonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipid, Inc | 840457C | |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipid, Inc | 810330C | |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457C | |
| Porcine trypsin | Sigma-Aldrich | T-0303 | |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9777 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A1417 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt Baker Inc. | 5240-05 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3375 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S-0751 |
References
- Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they? Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
- Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).
- Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).
- Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).
- Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).
- Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).
- Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).
- Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. , (2011).
- Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).
- Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochemistry. 44 (30), 10189-10189 (2005).
- Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).
- Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother? Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).
- Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
- Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochemistry. 39 (29), 8648-8648 (2000).
- Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochemistry. 34 (19), 6521-6521 (1995).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).
- Torchilin, V. P., Weissig, V. Liposomes. , Oxford University Press. New York. (2003).
- Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).
- Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).
