Summary
We beschrijven hoe retrovirale of lentivirale infecties van overexpressie of shRNA-bevattende constructies in het menselijk Ramos B-cellijn en hoe somatische hypermutatie te meten in deze cellen. Uit te voeren
Abstract
B-cellen beginnen hun leven met een lage affiniteit antilichamen gegenereerd door V (D) J recombinatie. Echter, bij het opsporen van een ziekteverwekker, is de variabele (V) regio van een immunoglobuline (Ig) gen ongeveer 100.000 keer meer dan de rest van het genoom door middel van somatische hypermutatie (SHM) gemuteerd, wat resulteert in een hoge affiniteit antilichamen 1,2. Daarnaast, klasse switch recombinatie (CSR) produceert antilichamen met verschillende effector functies, afhankelijk van de aard van de immuunrespons die nodig is voor een bepaalde ziekteverwekker. CSR en SHM worden geïnitieerd door de activatie-geïnduceerde cytidinedeaminase (AID), die cytosine residuen in DNA te produceren uracils deaminates. Deze uracils worden verwerkt door foutgevoelige vormen van reparatie wegen, uiteindelijk leidend tot mutaties en recombinatie 1-3.
Onze huidige kennis van de moleculaire details van de SHM en MVO komen uit een combinatie van studies in muizen, primaire cellen, cellijnen, en cel-free experimenten. Muismodellen blijft de gouden standaard met genetische knockouts tonen cruciale rol voor vele reparatie factoren (bijvoorbeeld Ung, MSH2, MSH6, Exo1, en polymerase η) 4-10. Echter, niet alle genen zijn vatbaar voor de knock-out studies. Bijvoorbeeld, knockouts van verschillende double-strand break repair eiwitten embryonaal dodelijk of aantasting B-cel ontwikkeling 11-14. Bovendien, soms de specifieke functie van een eiwit in SHM of MVO kan worden gemaskeerd door de meer globale defecten veroorzaakt door de knock-out. Daarnaast kan worden omdat experimenten in muizen langdurig, veranderen van de expressie van individuele genen in cellijnen is uitgegroeid tot een steeds populairder eerste stap naar het identificeren en karakteriseren kandidaat-genen 15-18.
Ramos - een Burkitt lymfoom cellijn die constitutief ondergaat SHM - is een populaire cellijn model om SHM 18-24 te bestuderen. Een voordeel van Ramos cellen is dat ze een ingebouwde handige semi hebben-Kwantitatieve meting van SHM. Wild-type cellen brengen IgM en, als ze pick-up mutaties, een aantal van de mutaties knock-out IgM expressie. Daarom is het testen van IgM verlies door fluorescentie-geactiveerde cel scanning (FACS) biedt een snelle uitlezing voor het niveau van de SHM. Een meer kwantitatieve meting van de SHM kan worden verkregen door direct sequencing het antilichaam genen.
Omdat Ramos-cellen zijn moeilijk te transfecteren, produceren we stabiele derivaten die zijn verhoogd of verlaagd expressie van een individueel gen door het infecteren van cellen met retrovirale of lentivirale constructen die ofwel een overexpressie cassette of een short hairpin RNA (shRNA), respectievelijk bevatten. Hier beschrijven we hoe we dan Ramos cellen te infecteren en het gebruik van deze cellen om de rol van specifieke genen op de SHM (figuur 1) te onderzoeken.
Protocol
1. Voorbereiding van de monsters en cellen
- Voer een middelgrote schaal bereiding van DNA (midiprep) van de overexpressie of shRNA-bevattende constructen en de retrovirale vector verpakking pKat2 of de lentivirale vectoren verpakking pVSV-G, pMDLg / pRRE, en pRSV-Rev 25. Gebruik 6 pg DNA per bouwen en een 4 ug van pKat2 (voor retrovirale infecties) of 1,5 ug DNA voor elk van de pVSV-g, pMDLg / pRRE, en pRSV-Rev verpakking vectoren (voor lentivirale infecties).
- Bereid BOSC 23 media. Voor transfectie, gebruik maken van zowel ongewijzigde Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) en als complete DMEM. Om compleet te maken DMEM, voeg 1% HEPES buffer, 1% penicilline-streptomycine-glutamine (PGS), en 10% pasgeboren kalf serum (NCS) om een fles DMEM.
- Bereid Ramos media. Voor de infectie stap maken compleet RPMI-1640 medium (RPMI) door toevoeging van 1% HEPES, 1% PGS, en 10% foetaal bovine serum (FBS) om een fles RPMI. Voor single cell seeding stap, make "geconditioneerde" media door groeiende Ramos cellen in volledige RPMI voor 2 dagen, te stoppen met draaien de cellen neer op 400 xg gedurende 4 minuten en het filteren van de supernatant met een 0,2 um filter in een steriele fles. Net als andere volledige media, is geconditioneerd media die zijn opgeslagen bij 4 ° C totdat het nodig is.
- Split 3 x 10 6 BOSC 23 cellen in een 100-mm plaat in 10 ml DMEM compleet op de dag voor de transfectie, zodat de cellen zullen worden op 50-60% confluentie de dag van de transfectie. Maak een plaat van cellen voor elke vector u van plan bent transfecteren. Het is belangrijk dat de cellen niet zijn in cultuur gehouden te lang; gebruik een lage passage aantal cellen of onlangs ontdooid cellen voor zowel de transfectie en infectie stappen om een goede infectie te verzekeren.
- Onder andere controles voor uw experimenten. Voor transfecties en infecties, een negatieve controle (ongetransfecteerde of niet-geïnfecteerde cellen) en een positieve controle (virus dat GFP en puromycine-resistentiegen uitdrukt). Voor shRNA knock-down expertiseiments, infecteren van een goed met een roerei of irrelevant shRNA controle.
2. Transfecteren BOSC 23 cellen
- Warm de flessen van de ongewijzigde DMEM en volledige DMEM bij 37 ° C.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit de BOSC 23 cellen en te vervangen door 5 ml DMEM compleet. Breng de cellen om een 37 ° C incubator tot gebruik in stap 2.6.
- Warm het flesje van Fugene 6 bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten vervolgens kort vortex (<1 seconde).
- Aliquot 600 pi ongewijzigde DMEM in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Verdun 30 pi Fugene 6 in de 600 uL ongewijzigde DMEM, vortex kort (<1 seconde), en vervolgens incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Wees voorzichtig om direct pipet in de media. Laat niet de Fugene 6 raak de zijkanten van de buis.
- Voeg 6 ug bouwen en ofwel 4 microgram pKat2 (retrovirale infecties) of 1,5 microgram elk van pVSV-G, pMDLg / pRRE, en pRSV-Rev (lentivirale infecties) aan de DMEM / Fugene 6 mix, vortex bri efly (<1 seconde), en vervolgens incubeer bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten.
- Voeg de DNA / DMEM / Fugene 6 mix om de BOSC 23 cellen en terug te keren naar een 37 ° C incubator voor 24 uur.
- Na 24 uur, voeg 5 ml DMEM compleet aan de getransfecteerde cellen en terug te keren naar een 37 ° C incubator voor een ander 24 uur.
3. Oogsten virale deeltjes
- Oogst de 10 mL van de media van de getransfecteerde BOSC 23 cellen met een 10 ml spuit.
- Bevestig een 0,45 pm filter aan het einde van de spuit en het filter van de media in een schone 15 ml polypropyleen buis.
- Direct gebruik van de virale media of bevriezen als een mL monsters in 2 ml cryogene flesjes bij -80 ° C.
- Na het oogsten van de virale media, bevestigen dat een efficiënte transfectie heeft plaatsgevonden in de positieve controle cellen door FACS. Dit kan ook gedaan worden voor alle monsters als het construct bevat ofwel een fluorescerend (bijv. GFP) of een celoppervlak marker (bijv. Thy1).
- Zaad 2 mL van 2 x 10 5 cellen / ml Ramos cellen in volledige RPMI in een 6-wells plaat 24 uur voor infectie. Nogmaals, moet u een lage doorgang aantal cellen of recent ontdooid cellen gebruiken om een goede infectie te verzekeren.
- Bij gebruik van bevroren monsters van het virus, snel ontdooien de virale media bij 37 ° C.
- Meng 1 ml virale media met 3 pl van 10 mg / ml polybreen. De uiteindelijke concentratie van polybreen moet 10 pg / ml in een totaal volume van 3 ml.
- Voeg de virus / polybreen mix naar de cellen en meng goed door pipetteren. Zoals eerder vermeld, een goed gebruikt moet worden als een niet-geïnfecteerde controle; voeg 1 mL compleet RPMI en 3 ui polybreen om dit goed in plaats van 1 ml virus. Zorg ervoor dat u goed infecteren een met een passende negatieve controle. We hebben ook goed infecteren een met een GFP-bevattende vector, om infectie-efficiëntie te bepalen door FACS.
- Centrifugeer de 6-well plaat bij 3000 xg gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.
- Zet de plaateen 37 ° C incubator gedurende 48 uur.
- Na 48 uur, spin down van de geïnfecteerde cellen in een 15 ml polypropyleen buis bij 400 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de media door aspiratie, waarbij u niet te storen de cel pellet. Resuspendeer de cellen in verse RPMI.
- Bevestigen de efficiëntie van infectie in de positieve controle monster door FACS. Net als voorheen, kunt u dit doen voor al uw monsters als het construct bevat ofwel een fluorescerend (bijv. GFP) of een celoppervlak marker (bijv. Thy1).
- Start selectie van cellen (indien van toepassing). Onze shRNA-bevattende constructen bevatten allemaal een puromycine weerstand cassette. Wij selecteren shRNA-geïnfecteerde Ramos cellen met 0,25 ug / ml puromycine. Wij vinden dat derivaten van Ramos cellen soms tonen gevoeligheid veranderd om puromycine en daarom voeren we doden bochten om de concentratie van puromycine te optimaliseren voor elke afgeleide. Ook de behandeling van niet-geïnfecteerde controle cellen met puromycine om te bevestigen dat selectie effectief is.
Single zaaien kan worden uitgevoerd in een van de twee manieren: door FACS-sortering of handmatig.
- FACS: Gebruik een FACS sorter met een plaat adapter om zaad een cel / well in een 96-wells plaat voorgevuld met 100 pl van 40% RPMI/40% onder de voorwaarde media/20% FBS. Deze methode geeft een veel meer enkele cel klonen per plaat.
- Handmatig: Tel de cellen. Verdun een hoeveelheid van cellen tot 10 cellen / ml in 40% RPMI/40% onder de voorwaarde media/20% FBS. Gebruik 10 ml verdund cellen voor elk gezaaid plaat. Verschillende klonen zal variabel herstel in dit stadium daarom is het nuttig om verschillende platen met verschillende concentraties (van 3 tot 20 cellen / ml). Gebruik maken van de een dat minder uitwassen te klonen die voortvloeien uit meerdere cellen te voorkomen) produceert. Gebruik een multichannel pipet om zaad 96-wells platen met 100 pi van de verdunde cellen.
- Plaats de plaat in een 37 ° C incubator voor 2 weken.
- Controleer de individuele putten under de microscoop op de aanwezigheid van cellen die een dag na het uitzaaien te bevestigen. Enkele cellen kunnen worden lastig te vinden door de noodzaak om zich te concentreren op de juiste diepte. Focussen op de goed cijfers afgedrukt aan de onderkant van de 96-wells plaat zou moeten helpen. Cellen zijn gemakkelijker te vinden wanneer gezaaid door de FACS sorter omdat de meeste putten hebben een cel.
- Na 2 weken, kan groeiende kolonies nauwelijks te zien met het blote oog door te kijken naar de platen van onderen. Ze zijn veel gemakkelijker te zien onder de microscoop. Kolonies hebben de neiging om te groeien langs de randen van de put en typisch meeste kolonies in een plaat groeien langs dezelfde rand in verschillende putten. Mark Wells robuuste cel-groei en overdracht van de cellen naar 24-well platen in 1 ml RPMI en terug te keren naar een 37 ° C incubator.
- Instandhouding van de lichaamscellen op een x 10 5 tot 1 x 10 6 cellen / ml. Wijzig de media door het draaien van de cellen op 400 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur en het verwijderen van de media als dat nodig is. Te vervangen door 1 ml verse RPMI.
- Na een aantal dAys van groei, overdracht van de cellen om een 6-well plaat en blijven groeien in een 37 ° C incubator.
- Na 3 weken, het analyseren van de klonen voor IgM verlies (zoals hieronder beschreven).
- Blijven de cellen groeien voor 2 weken meer en dan weer het analyseren van de klonen op het 5 week tijd punt.
6. Analyse: IgM verlies (3 weken en 5 weken)
- Aliquot 5 x 10 5 cellen uit elk putje in een 1,5 ml microcentrifugebuis en spin de cellen neer op 400 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik cellen van elk van de controle en shRNA-knock-down putten, maar ook als een monster voor een onbevlekte controle.
- Was de cellen in 1 ml PBS en dan weer draaien op 400 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer in 50 ul van PBS (ongekleurde controle) of PBS + 1:20 verdunning van PE-gelabeld α-mens IgM antilichaam. Incubeer op ijs gedurende 1 uur.
- Spin de cellen neer op 400 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cells tweemaal met 1 ml PBS en spin voor 400 X g gedurende 4 minuten per keer bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer in 100 pi PBS. Overdracht van de geresuspendeerde gekleurde cellen om een FACS buis.
- Analyseer de cellen met behulp van een FACS apparaat.
- Vergelijk het percentage van IgM - cellen van de controles versus het shRNA aangereden cellen. Zoals eerder opgemerkt, IgM schade als gemeten door FACS is een betrouwbare semi-kwantitatieve meting van de SHM in Ramos cellen.
7. Analyse: Bevestig knock-down door kwantitatieve RT-PCR (5 weken)
- Aliquot 3 x 10 6 cellen uit elk putje en neer op 400 X g draaien gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid RNA uit de fractie van de cellen. We maken gebruik van TRIzol volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Bereid cDNA van het RNA prep. We maken gebruik van 2 ug RNA en Superscript II volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Voer een kwantitatieve PCR met behulp van de cDNA om bevestigingm knock-down. We maken gebruik van GAPDH als een normalisering controle, en de SYBR FAST qPCR kit in een 10 pi totale reactie volume.
8. Analyse: Genomic sequencing (5 weken)
- Aliquot 5 x 10 6 cellen uit elk putje en neer op 400 X g draaien gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
- Genomisch DNA te isoleren uit deze cellen. We maken gebruik van de Wizard SV genomische DNA-zuivering kit volgens aanbevelingen van de fabrikant.
- PCR versterken de genomische DNA voor de Ig-V-genen 19 (tabel 1) en alle andere genen van belang het gebruik van de KAPA HiFi DNA-polymerase. We gebruiken deze polymerase vanwege de lage fout-tarieven, maar elke high-fidelity PCR polymerase moet aanvaardbaar zijn.
- Gel te zuiveren van de PCR-producten op een 1% agarosegel met behulp van de QIAquick gel extractie kit.
- Sommige polymerasen voegen een deoxyadenosine (A) residu een einde aan de drie 'van de PCR-producten, terwijl anderen dat niet doen. Deze drie 'A staarten zijn nodig voor de TOPO TAklonen stap. De KAPA HiFi polymerase laat geen 3 'A staarten. A-staart van de PCR-producten door het incuberen van 25 pi gel-gezuiverd PCR product met 3 pi 10x Taq reactie buffer, 1 ui 10 mM dNTPs, en een eenheid Taq-polymerase bij 72 ° C gedurende 30 minuten.
- Kloon van de gel-gezuiverde PCR-producten met behulp van de TOPO TA Cloning kit. Transformeren van de producten uit de TOPO reactie in de bijgeleverde E. coli DH5a-T1 R competente cellen en plaat op LB / agarplaten die 100 ug / ml ampicilline en aangevuld met 1,6 mg van de X-gal volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Stuur individuele kolonies voor het rangschikken.
- Sequentie-analyse uit te voeren om soorten en locaties van mutaties vast te stellen.
9. Representatieve resultaten:
Zoals eerder opgemerkt, gebruiken we een positieve controle virale vector die zowel GFP als een puromycine-resistentiegen uitdrukt. We meestal zien 50-75% GFP +-cellen twee dagenna transfectie. In onze infecties, we meestal zien 50-70% cellen GFP + twee dagen na de infectie, maar voor de selectie. Na selectie is voltooid,> 95% van de cellen GFP +.
Als vertegenwoordiger experimenten, laten we de effecten van overexpressie AID of neerhalen een reparatie factor in Ramos cellen. Concreet hebben we getransfecteerd een retrovirale overexpressie vector voor AID verbonden via een IRES site Thy1.1, samen met de retrovirale vector verpakking pKat2 in BOSC 23 cellen. Virus-bevattende media werd gefilterd en vervolgens gebruikt om Ramos cellen te infecteren. Zowel wild type (WT) en de AID tot overexpressie (AID hi) cellen werden enkele cel gezaaid en gekweekt gedurende 3 weken, waarna ze werden geanalyseerd op genexpressie door qRT-PCR (figuur 2) en voor IgM verlies door FACS (Figuur 3 ). Voor de FACS kleuring, werden de cellen geïncubeerd met beide 1:20 verdunde PE-gelabeld α-mens IgM antilichaam en 1:400 verdund FITC-gelabelde α-rat CD90/mouseCD90.1 (Thy1.1) antilichaam. In een afzonderlijk experiment werden lentivirussen bevat ofwel een irrelevante shRNA (controle) of een shRNA tegen een high-fidelity DNA-herstel factor zal naar verwachting te beschermen tegen SHM in BOSC 23 cellen, en vervolgens geïnfecteerd in een AID hi kloon van Ramos cellen. Opnieuw werden genexpressie (figuur 4) en IgM verlies (Figuur 5) geanalyseerd in een cel klonen na 3 weken. Sinds de reparatie factor wordt verondersteld om bescherming tegen mutaties gedurende SHM te bieden, dan zien we een toename van de IgM verlies en SHM bij afwezigheid van de factor. Als we knocked-down een factor betrokken is bij het genereren van SHM-geassocieerde mutaties, zouden we hebben gezien een daling van de IgM verlies plaats.
Zoals verwacht, onze qRT-PCR resultaten tonen een duidelijke toename van de AID expressie na infectie van cellen met een AID overexpressie vector (figuur 2), terwijl het niveau van het DNA-herstel factor daling van de aanwezigheid van een gerichte shRNA tegen dat factor (figuur 4 ). Omdat individuele clones kunnen variëren, kun je zien wat variatie in genexpressie niveaus. Omdat de genexpressie kan variëren, is het noodzakelijk om bevestiging van de uitdrukking in elke kloon u van plan bent op het analyseren verder. Verschillende shRNAs tegen hetzelfde gen zou kunnen hebben verschillende effecten op genexpressie zo goed, dus je moet een aantal shRNAs het scherm om te bepalen welke heeft de grootste impact. Knockdown kunnen ook worden bevestigd op het eiwit niveau door immunoblotting. Ook kunnen afzonderlijke klonen sterk verschillen in niveaus van IgM verlies. Sommige klonen zou kunnen aantonen dat er een "jackpot"-effect, waarbij een IgM mutatie opgetreden in een van de eerste celdelingen - bijvoorbeeld, zul je> 50% IgM verlies zien alleen maar omdat een van de cellen werden IgM - op de twee-cellig stadium. De invloed van deze klonen wordt geminimaliseerd door het berekenen van de mediaan voor een aantal enkele cel klonen.
Figuur 1. Schematische voor het transontsmetting, infectie en de analyse van IgM verlies. Zie tekst voor details.
Figuur 2. AID overexpressie in Ramos cellen. WT en de AID hi Ramos cellen werden enkele cel gekloond en gegroeid gedurende 3 weken, op welk moment AID uiting in de individuele klonen werd gemeten door qRT-PCR. GAPDH uitdrukking werd gebruikt voor normalisatie. WT was ingesteld op 1. De mediaan waarde wordt weergegeven. * Geeft ap waarde van <0,01, berekend als een eenzijdige Student's t-test.
Figuur 3. Verhoogde IgM verlies in AID hi-cellen in vergelijking met WT-cellen. Oppervlak IgM werd gemeten door FACS op het 3 week tijdstip, en het percentage van de IgM verlies werd berekend voor WT en AID hi-cellen. (A) Vertegenwoordiger FACS plot van een WT kloon en een AID hi kloon. De AID overexpressie vEctor heeft AID gekoppeld aan Thy1.1 via een IRES site, dus Thy1.1 uitdrukking wordt gebruikt als een surrogaat voor de AID expressie. (B) Kwantificering van IgM verlies in diverse WT en de AID hi klonen. De mediaan waarde wordt weergegeven. * Geeft ap waarde van <0,01, berekend als een eenzijdige Student's t-test.
Figuur 4. Knockdown van een reparatie factor in AID hi cellen. De cellen werden geïnfecteerd met ofwel een irrelevante shRNA controle (controle) of onze shRNA van belang (shRNA), en enkele cel gezaaid. Na 3 weken was genexpressie in individuele klonen gemeten door qRT-PCR. GAPDH uitdrukking werd gebruikt voor normalisatie. WT was ingesteld op 1. De mediaan waarde wordt weergegeven. * Geeft ap waarde van <0,01, berekend als een eenzijdige Student's t-test.
Figuur 5. Verhoogd IgM verliesAID in hi cellen met knocked-down niveau van een reparatie factor. Oppervlak IgM in verschillende klonen werd gemeten door FACS op het 3 week tijdstip, en het percentage van de IgM verlies werd berekend in de cellen nog steeds tot overexpressie AID. De mediaan waarde wordt weergegeven. * Geeft ap waarde van <0,01, berekend als een eenzijdige Student's t-test.
. Tabel 1 Primer sequenties voor de Ig-genen 19: de constante regio Cμ, de zware keten V regio (V H), en de lichte keten V regio (V L).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals eerder besproken, hebben cellijn modellen voor antilichaam diversificatie uitgegroeid tot een populaire uitvalsbasis om nieuwe eiwitten die verschillende stappen invloed tijdens antilichaam diversificatie te identificeren. We presenteren hier een methode voor het gebruik van virale infectie van beide knock-down of overexpressie eiwitten in de Ramos B-cellijn en vervolgens onderzoekt de impact op de SHM.
Voor deze studies maken we gebruik van zowel WT Ramos en AID hi Ramos cellen. WT cellen kunnen worden gebruikt om de factoren die betrokken zijn bij de opsporing of de uitdrukking van de AID en reparatie van AID-generated laesies, studie terwijl de AID hi-cellen uit te sluiten factoren die de AID meningsuiting.
Ook moet worden opgemerkt dat, SHM hier wordt gemeten door testen voor het verlies van IgM uit een populatie van cellen die in eerste instantie zijn IgM +. Als alternatief is het mogelijk om te beginnen met IgM -. Cellen en voor een winst van IgM + cellen zien in een terugkeer test 23 </ P>
Door het gebruik van verschillende selectie-markers (bijv. puromycine, hygromycine, GFP, of Thy1.1), kunnen we ook uitvoeren met meerdere infecties op hetzelfde moment met hetzelfde protocol. We hebben echter ontdekt dat bij het gebruik van twee verschillende antibiotica selectie markers, de gevoeligheden van de cellen te veranderen. Het zal nodig zijn om extra te doden curves uit te voeren om de voorwaarden te optimaliseren voor de keuze met twee antibiotica tegelijk. We kunnen gemakkelijk genereren dubbel knock-downs van twee verschillende factoren of een knock-down van een factor, plus een overexpressie van een ander, etc.
We hebben ook dit protocol aangepast voor de andere B-cel-line modellen. Bijvoorbeeld met CH12F3-2-cellen (een muis B-cellijn gebruikt om MVO-studie) 26,27, kan dezelfde infectie stappen worden gebruikt om 1 x 10 6 CH12F3-2-cellen gezaaid op de dag van infectie (variatie van infecteren stap 4.1). Deze cellen worden geselecteerd met 1 ug / ml puromycine. Op dezelfde manier, hetzelfde protocol kan ookworden gebruikt voor kippen DT40-cellen - een cellijn model voor de AID-geïnitieerde genconversie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De pMSCV-AID-I-Thy1.1 en pKat2 vectoren werden een soort geschenk van DG Schatz en de pVSV-G, pRSV-Rev, en pMDLg / pRRE vectoren werden een soort geschenk van BR Cullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Suggested reagents - most of these may be substituted with similar products from other vendors. | |||
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Biosciences | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Corporation | 4604 | |
| Agar | TEKnova, Inc. | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche Group | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth - Luria) Powder | Difco Laboratories | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma-Aldrich | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega Corp. | A2495 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega Corp. | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
References
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
- Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
- Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
- Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
- Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
- Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
- Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
- Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
- Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
- Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
- Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
- Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
- Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
- Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
- Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
- Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
- Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
- Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
- Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
- Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
- Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
- Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
- Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
