Summary
Мы опишем, как выполнять ретровирусных или лентивирусов инфекции гиперэкспрессия или shRNA содержащих конструкций в человеческой Рамос B-клеточной линии и как измерить соматических hypermutation в этих клетках.
Protocol
1. Подготовка образцов и клетки
- Выполнить средний подготовки масштаба ДНК (midiprep) из гиперэкспрессия или shRNA содержащих конструкции и упаковки ретровирусных вектор pKat2 или лентивирусов векторов упаковки pVSV-G, pMDLg / pRRE и pRSV-Rev 25. Используйте 6 мкг ДНК для каждой конструкции и либо 4 мкг pKat2 (для ретровирусных инфекций) или 1,5 мкг ДНК для каждого из pVSV-г, pMDLg / pRRE и pRSV-Rev упаковки векторов (для лентивирусов инфекций).
- Подготовка Боск 23 средств массовой информации. Для трансфекции, использовать обе среды без изменений изменение Дульбеко Орла (DMEM), а также полное DMEM. Чтобы сделать полный DMEM, добавить 1% HEPES буфера, 1% пенициллин-стрептомицина-глютамин (PGS), а 10% новорожденных телячьей сыворотки (NCS), чтобы бутылка DMEM.
- Подготовка Рамос СМИ. Для инфекции шаг, сделать полный RPMI-1640 (RPMI), добавив 1% HEPES, 1% PGS, и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), чтобы бутылка RPMI. За один шаг посева клетки, маке «условной» СМИ растущей Рамос клеток в полной RPMI в течение 2 дней, спиннинг вниз ячейки вниз при 400 Х г в течение 4 минут и фильтрацию супернатанта с 0,2 мкм фильтр в стерильные бутылки. Как и в других СМИ полную, обусловленные средства массовой информации хранится при температуре 4 ° С, пока это необходимо.
- Сплит 3 х 10 6 Боск 23 клеток в 100-мм пластины в 10 мл полной DMEM день до трансфекции, так что клетки будут на 50-60% слияния день трансфекции. Сделайте одну пластину клеток для каждого вектора вы планируете трансфекции. Важно, что клетки не были сохранены в культуре слишком долго, использование низких пассаж клеток или недавно талой клетки для трансфекции и инфекции шаги, чтобы гарантировать хорошее инфекции.
- Включите управления для ваших экспериментов. Для трансфекции и инфекций, создать отрицательный контроль (untransfected или неинфицированных клеток) и положительного контроля (вирус, который выражает GFP и пуромицину гена устойчивости). Для shRNA нокдаун экспериментаментов, заразить хорошо защищенные или не имеют отношения контроля shRNA.
2. Трансфекции Боск 23 клетки
- Теплый бутылки без изменений DMEM и полной DMEM при температуре 37 ° C.
- Удаление информации из Боск 23 клетки и замените 5 мл полной DMEM. Вернуться клетки 37 ° C инкубаторе до использования в шаге 2.6.
- Теплая бутылка FuGENE 6 при комнатной температуре в течение 5 минут, после чего кратко вихря (<1 секунды).
- Алиготе 600 мкл DMEM без поправки на 1,5 трубки микроцентрифужных мл.
- Развести 30 мкл FuGENE 6 в 600 мкл DMEM без изменений, вихревые кратко (<1 секунды), а затем инкубируют при комнатной температуре в течение пяти минут. Будьте осторожны, чтобы пипетки прямо в средствах массовой информации. Не позволяйте FuGENE 6 сенсорным стороны трубки.
- Добавить 6 мкг построить и либо 4 мкг pKat2 (ретровирусных инфекций) или 1,5 мкг каждого из pVSV-G, pMDLg / pRRE и pRSV-Rev (лентивирусов инфекций) в DMEM / FuGENE 6 смеси, вихревые бри efly (<1 секунды), а затем инкубируют при комнатной температуре в течение 25 минут.
- Добавить ДНК / DMEM / FuGENE 6 микс Боск 23 клеток и возвращение к 37 ° C инкубаторе в течение 24 часов.
- После 24 часов, добавляют 5 мл полной DMEM для трансфекции клеток и возвращение к 37 ° C инкубатора в течение еще 24 часов.
3. Сбор вирусных частиц
- Урожай 10 мл СМИ из трансфицированных Боск 23 ячеек с 10 мл шприц.
- Прикрепить 0,45 мкм фильтр до конца шприц и фильтра средств массовой информации в чистое 15 трубки полипропилена мл.
- Используйте вирусный СМИ сразу или заморозить до 1 мл аликвот в 2 мл флаконах криогенных при температуре -80 ° C.
- После сбора урожая вирусных СМИ, подтверждают, что эффективная трансфекция произошло в положительных клеток контроль СУИМ. Это может быть сделано для всех образцов, если построить содержит либо люминесцентные (например, GFP) или на поверхности клеток маркера (например, Thy1).
- Семенной 2 мл 2 х 10 5 клеток / мл Рамос клеток в полной RPMI в 6-луночный планшет за 24 часа до инфекции. Опять же, не забудьте использовать низкий проход числа клеток или недавно талой клетки, чтобы обеспечить хороший инфекции.
- Если вы используете замороженные аликвоты вируса, оттепель вирусных СМИ быстро при температуре 37 ° C.
- Смешайте 1 мл вирусной СМИ с 3 мкл 10 мг / мл polybrene. Конечная концентрация polybrene должно быть 10 мкг / мл в общем объеме 3 мл.
- Добавить вирус / polybrene смеси для клеток и хорошо перемешать с помощью пипетки. Как упоминалось ранее, одной скважины должны использоваться в качестве неинфицированных контроля; добавить 1 мл полной RPMI и 3 мкл polybrene для этого хорошо, а не 1 мл вируса. Будьте уверены, чтобы заразить хорошо соответствует отрицательный контроль. Мы также заразить хорошо с GFP-содержащая вектор, для определения инфекции эффективность СУИМ.
- Центрифуга 6-луночный планшет в 3000 г Х в течение 90 минут при комнатной температуре.
- Вернуться пластину37 ° C инкубаторе в течение 48 часов.
- Через 48 часов спином вниз инфицированных клеток в 15 мл полипропиленовые трубки при 400 Х г в течение 4 минут при комнатной температуре. Удалить СМИ стремление, будучи уверенным, чтобы не мешать осадок клеток. Ресуспендируют клеток в свежей RPMI.
- Подтвердить эффективность инфекции в положительном образце контроля СУИМ. Как и прежде, вы можете сделать это для всех образцов, если построить содержит либо люминесцентные (например, GFP) или на поверхности клеток маркера (например, Thy1).
- Начать выбор из мобильных телефонов (при необходимости). Наши shRNA содержащих конструкции содержат кассеты пуромицин сопротивления. Мы выбираем shRNA-инфицированных Рамос клеток с 0,25 мкг / мл пуромицин. Мы считаем, что производные клетки Рамос иногда показывают изменены восприимчивость к пуромицин и, следовательно, мы выполняем убить кривые для оптимизации концентрации пуромицин для каждой производной. Кроме лечения неинфицированных клетках управления с пуромицин чтобы подтвердить, что выбор эффективной.
Одноместный посева может быть выполнена одним из двух способов: FACS сортировки или вручную.
- FACS: Используйте FACS сортировщик с пластиной для крепления к семени 1 клетку / лунку в 96-луночного планшета предварительно заполнены 100 мкл 40% RPMI/40%, что обусловлено media/20% FBS. Этот метод дает намного больше одной ячейки клонов на чашку.
- Вручную: Граф клеток. Развести аликвоту клеток до 10 клеток / мл в 40% RPMI/40%, что обусловлено media/20% FBS. Используйте 10 мл разбавленного клеток для каждой пластины посеяны. Различные клоны покажет переменная восстановления на данном этапе, поэтому было бы полезно создать несколько пластин при различных концентрациях (от 3 до 20 клеток / мл). Используйте тот, который производит меньше наросты, чтобы избежать клонов, возникающих из нескольких клеток). Использование многоканальной пипеткой семян 96-луночных планшетах с 100 мкл разбавленного клеток.
- Место пластинки в 37 ° C инкубаторе в течение 2 недель.
- Проверка отдельных скважин недеформированнойГ микроскопом, чтобы подтвердить наличие клетки в один прекрасный день после посева. Отдельные клетки может быть сложно найти из-за необходимости сосредоточить внимание на правильную глубину. Сосредоточение внимания на номера также запечатлен на дне 96-луночного планшета должна помочь. Клетки легче найти, когда посеяны на сортировщик FACS поскольку большинство скважин клетки.
- Через 2 недели, рост колоний может быть едва видно невооруженным глазом, глядя на пластины снизу. Они намного легче увидеть под микроскопом. Колонии как правило, растут по краям хорошо, и как правило, наиболее колоний в пластину растут по отношению к этому краю в разных скважинах. Марк скважин с надежным ростом клеток и передачи клеткам 24-луночных планшетах в 1 мл RPMI и вернуться к 37 ° С инкубатор.
- Поддерживать клетки в 1 х 10 5 до 1 х 10 6 клеток / мл. Изменение средств массовой информации, крутя клетки при 400 X г в течение 4 минут при комнатной температуре и удалении СМИ по мере необходимости. Заменить на 1 мл свежей RPMI.
- После нескольких гн я роста, передача клетки 6-луночного планшета и продолжать расти в 37 ° C инкубатора.
- Через 3 недели, анализ клонов для IgM потери (как описано ниже).
- Продолжайте расти клетки в течение еще 2 недель, а затем анализировать клонов снова в 5 момент времени в неделю.
6. Анализ: IgM потери (3 недели и 5 недель)
- Алиготе 5 х 10 5 клеток из каждой лунки на 1,5 трубки микроцентрифужных мл и спина ячейки вниз при 400 Х г в течение 4 минут при комнатной температуре. Используйте клетки от каждого из контроля и shRNA-нокдауна скважин, а также один образец для неокрашенных контроля.
- Вымойте клеток в 1 мл ФСБ, а затем снова спина при 400 Х г в течение 4 минут при комнатной температуре.
- Ресуспендируют в 50 мкл PBS (неокрашенных контроль) или PBS + 1:20 разбавление PE-меченых α-человеческий IgM антитела. Инкубируйте на льду в течение 1 часа.
- Спиновые ячейки вниз на 400 Х г в течение 4 минут при комнатной температуре.
- Мойте слоктя в два раза с 1 мл ФСБ и спин на 400 Х г в течение 4 минут каждый раз при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и ресуспендируют в 100 мкл PBS. Передача ресуспендировали окрашенных клеток к трубке СУИМ.
- Анализ клеток с использованием машины СУИМ.
- Сравните процент IgM - клетки, из управления по сравнению с shRNA разобранном клеток. Как было отмечено выше, IgM потери измеряются FACS является надежным полу-количественная мера ГИМ в клетках Рамос.
7. Анализ: Подтвердите нокдауна количественными RT-PCR (5 недель)
- Алиготе 3 х 10 6 клеток из каждой лунки и спином вниз на 400 Х г в течение 4 минут при комнатной температуре.
- Подготовка РНК из аликвоту клеток. Мы используем TRIzol в соответствии с рекомендациями производителя.
- Подготовка кДНК из РНК преп. Мы используем 2 мкг РНК и Надстрочный II в соответствии с рекомендациями производителя.
- Выполните количественной ПЦР с использованием кДНК подтвержденийм нокдауна. Мы используем GAPDH как нормализация контроля и SYBR БЫСТРО комплект КПЦР в 10 мкл Общий объем реакции.
8. Анализ: геномные последовательности (5 недель)
- Алиготе 5 х 10 6 клеток из каждой лунки и спином вниз на 400 Х г в течение 4 минут при комнатной температуре.
- Изолировать от геномной ДНК этих клеток. Мы используем геномной ДНК SV Мастер очистки комплект в соответствии с рекомендациями производителя.
- ПЦР усиливают геномной ДНК для Ig генов V 19 (табл. 1) и любые другие гены интерес использованием ДНК-полимеразы KAPA HiFi. Мы используем эту полимераза из-за его низкой ошибок ставки, но и любой высококачественный ПЦР-полимераза должна быть приемлемой.
- Гель очищают продуктов ПЦР на 1% агарозном геле использованием добычу QIAquick гель комплект.
- Некоторые полимеразы добавить один дезоксиаденозина () остаток на концах 3 'ПЦР-продуктов, в то время как другие не делают. Эти 3 'хвосты необходимы для TOPO Т.А.Клонирование шаг. Полимеразной KAPA HiFi не оставляет 3 'хвосты. Хвост продуктов ПЦР путем инкубации 25 мкл гель-очищенного продукта ПЦР с 3 мкл 10x реакции Taq буфер, 1 мкл 10 мМ дНТФ, и 1 единица Taq-полимеразы при 72 ° С в течение 30 минут.
- Клон гель-очищенной ПЦР продуктов с использованием клонирования TOPO TA комплект. Преобразование продуктов реакции TOPO в предоставленный Е. DH5α палочка-T1 R компетентных клеток и пластину на LB / агара, содержащий 100 мкг / мл ампициллина и дополнены с 1,6 мг X-гал в соответствии с рекомендациями производителя.
- Отправить отдельных колоний для секвенирования.
- Выполните последовательность анализа для определения типа и местоположения мутации.
9. Представитель Результаты:
Как отмечалось ранее, мы используем положительный контроль вирусный вектор, который выражает и GFP, а также пуромицину гена устойчивости. Как правило, мы видим 50-75% GFP + клеток через два дняпосле трансфекции. В наших инфекциями, мы обычно видим 50-70% клетки GFP + два дня после заражения, но до выбора. После выбора завершена,> 95% клеток GFP +.
В качестве представителя эксперименты, мы показываем последствия гиперэкспрессией помощи или сбить ремонт фактора в клетках Рамос. В частности, мы трансфицированных ретровирусных вектор гиперэкспрессия для AID связаны через сайт IRES к Thy1.1 вместе с упаковкой ретровирусных вектор pKat2 в Боск 23 клеток. Вирус средах отфильтровывают и затем используются для заражения клетки Рамос. Оба дикого типа (WT) и гиперэкспрессией AID (AID привет) клетки одной клетки посеяны и выросли на 3 недели, после чего они были проанализированы на экспрессии генов с QRT-PCR (рис. 2) и IgM потери FACS (рис. 3 ). Для окрашивания FACS, клетки инкубировали с обоими 1:20 разбавленный PE-меченых α-человеческий IgM антитела, а также 1:400 разбавляется FITC-меченого α-крыса CD90/mouseCD90.1 (Thy1.1) антител. В отдельном эксперименте, лентивирусов, содержащие либо не имеет значения shRNA (контроля) или shRNA против высококачественные репарации ДНК фактор ожидаемого для защиты от ГИМ были сделаны в Боск 23 клеток, а затем инфицированных в клон ПОМОЩИ привет клеток Рамос. Опять же, экспрессии генов (рис. 4) и IgM потерь (рис. 5) были проанализированы в одном клонов клетки после 3 недель. Так как ремонт фактор, как полагают, обеспечивают защиту от мутаций при ГИМ, мы видим увеличение IgM потери и ГИМ в отсутствие фактора. Если бы мы разобранном фактор, участвующий в создании ШМ-мутации, связанные с, мы увидели бы снижение IgM потери вместо этого.
Как и ожидалось, наши QRT-PCR результаты показывают заметный рост ПОМОЩИ выражение после заражения клеток с гиперэкспрессией вектор AID (рис. 2), в то время как уровни фактора репарации ДНК капля в присутствии целевых shRNA против этого фактора (Рис. 4 ). Поскольку индивидуальные clonэс может варьироваться, вы можете увидеть некоторые различия в уровне экспрессии генов. Потому что экспрессия генов может меняться, необходимо, чтобы подтвердить выражение в каждый клон вы планируете анализировать дальше. Различные shRNAs против того же гена могут оказывать различное воздействие на экспрессию генов, так что вы должны экран несколько shRNAs чтобы определить, какие имеет наибольшее влияние. Нокдаун может быть также подтвержден на уровне белка методом иммуноблотинга. Кроме того, индивидуальные клоны могут сильно варьироваться в уровнях IgM потери. Некоторые клоны могут продемонстрировать "джекпот" эффект, когда IgM мутация произошла в одном из первых клеточных делений - например, вы увидите,> 50% IgM потери просто потому, что одна из ячеек стали IgM - в два-клеточной стадии. Влияние этих клонов сведена к минимуму путем расчета среднего за несколько клонов одной клетке.
Рисунок 1. Схема для транс-инфекцию, инфекцию и анализ IgM потери. См. текст для деталей.
Рисунок 2. ПОМОЩИ экспрессией в клетках Рамос. WT и помощь привет Рамос клетки одной клетки клонированных и выращивали в течение 3 недель, после чего ПОМОЩИ выражение в отдельных клонов измерялась QRT-PCR. GAPDH выражение было использовано для нормализации. WT был установлен в 1. Средний значение указано. * Указывает А. П. Значение <0,01 в пересчете на одностороннее Стьюдента-тест.
Рисунок 3. IgM Увеличение потерь в клетках ПОМОЩИ привет по сравнению с WT клеток. Поверхность IgM измеряли FACS на 3 очка время недели, и процент потерь IgM был рассчитан для WT и клеток ПОМОЩИ привет. (А) представитель FACS участок WT клон и клон ПОМОЩИ привет. ПОМОЩЬ гиперэкспрессия VЭктор имеет ПОМОЩИ связаны с Thy1.1 через сайт IRES, так Thy1.1 выражение используется в качестве суррогата ПОМОЩИ выражения. (В) Количественное определение IgM потери в несколько WT и помощь привет клонов. Средний значение указано. * Указывает А. П. Значение <0,01 в пересчете на одностороннее Стьюдента-тест.
Рисунок 4. Нокдаун ремонт фактора в клетках ПОМОЩИ привет. Клетки были заражены либо не имеет значения shRNA контроль (контроль) или наших shRNA интереса (shRNA), и одна ячейка заполнена. Через 3 недели, экспрессия генов в отдельных клонов измерялась QRT-PCR. GAPDH выражение было использовано для нормализации. WT был установлен в 1. Средний значение указано. * Указывает А. П. Значение <0,01 в пересчете на одностороннее Стьюдента-тест.
Рисунок 5. Увеличение IgM потериВ ПОМОЩЬ привет клеток с разобранном уровней ремонт фактор. Поверхность IgM в нескольких клонов измерялась FACS на 3 очка время недели, и процент потерь IgM был рассчитан в клетках еще ПОМОЩЬ гиперэкспрессией. Средний значение указано. * Указывает А. П. Значение <0,01 в пересчете на одностороннее Стьюдента-тест.
Таблица 1. Primer последовательности для генов Ig 19: постоянная См регионе, тяжелая цепь V области (V H) и легкой цепи V области (V L).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как обсуждалось ранее, клеточная линия моделей для антител диверсификации стали популярным отправной точкой для выявления новых белков, которые влияют на различные шаги в процессе антител диверсификации. Мы приведем здесь способ использования вирусной инфекции либо нокдауна или гиперэкспрессией белка в Рамос B-клеточной линии, а затем изучить влияние на ГИМ.
Для этих исследований, мы используем как WT Рамос и AID привет Рамос клеток. WT клетки могут быть использованы для изучения факторов, участвующих в планировании или выражение помощи, а также ремонт ПОМОЩИ генерируемых поражения, тогда как клетки ПОМОЩИ привет исключить факторы, которые влияют ПОМОЩИ выражения.
Следует также отметить, что ГИМ при этом измеряется путем анализа потерь IgM из популяции клеток, которые первоначально IgM +. Кроме того, можно начать с IgM -. Клеток и искать усиление IgM +-клеток в возврат анализа 23 </ P>
Используя различные маркеры выбора (например, пуромицин, гигромицин, GFP, или Thy1.1), мы также можем выполнить несколько инфекций, в то же время с тем же протоколом. Тем не менее, мы обнаружили, что при использовании двух различных антибиотиков маркеры выбора, чувствительность изменения клеток. Необходимо будет провести дополнительные кривые убить, чтобы оптимизировать условия для выбора с двумя антибиотиками одновременно. Мы можем легко генерировать двойное нокдаунов двух различных факторов или нокдауна одного фактора плюс гиперэкспрессия другой и т.д.
Кроме того, мы приспособили этот протокол для других В-клеточных линий моделей. Например, при CH12F3-2 клеток (мыши B-клеточной линии используются для изучения КСО) 26,27, те же шаги, инфекция может быть использован для заражения 1 х 10 6 CH12F3-2 клетки посеяны в день инфекции (изменение шагом 4,1). Эти клетки отбирают с 1 мкг / мл пуромицин. Точно так же и тот же протокол также можетбыть использованы для DT40 куриные клетки - модель клеточной линии для AID по инициативе генной конверсии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
PMSCV-AID-I-Thy1.1 и pKat2 векторы были своего рода подарок от Д. Г. Шац и pVSV-G, pRSV-Rev, и pMDLg / pRRE векторы были своего рода подарок от BR Каллен.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Suggested reagents - most of these may be substituted with similar products from other vendors. | |||
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Biosciences | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Corporation | 4604 | |
| Agar | TEKnova, Inc. | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche Group | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth - Luria) Powder | Difco Laboratories | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma-Aldrich | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega Corp. | A2495 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega Corp. | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
References
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
- Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
- Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
- Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
- Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
- Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
- Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
- Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
- Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
- Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
- Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
- Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
- Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
- Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
- Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
- Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
- Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
- Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
- Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
- Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
- Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
- Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
- Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
