Summary
Biz aşırı ekspresyonu veya shRNA insan Ramos B-hücre hattı ve bu hücrelerin nasıl somatik hipermutasyon ölçmek için yapıları içeren. Retroviral veya lentiviral enfeksiyonları nasıl gerçekleştirileceği tarif
Abstract
V (D) J rekombinasyon tarafından oluşturulan düşük afinite antikorları B hücreleri ile onların yaşam başlar. Ancak, bir patojen tespit üzerine, immünglobulin (Ig) geninin değişken (V) bölgesinde yüksek afiniteli antikorlar 1,2, yaklaşık 100.000 kat daha fazla somatik hipermutasyon (SHM) ile genomun geri kalanından daha mutasyona uğramış olan. Buna ek olarak, sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS), belirli bir patojen için gerekli olan immün yanıtın türüne bağlı olarak farklı efektör fonksiyonları ile antikor üretir. Hem KSS ve SHM uracils üretmek için DNA'da sitozin kalıntılarının deaminates aktivasyonla indüklenen sitidinin deaminaz (AID), tarafından başlatılan. Bu uracils sonuçta, mutasyon ve 1-3 rekombinasyon, tamir yollarının hata eğilimli formları tarafından işlenir .
SHM ve CSR moleküler ayrıntıları mevcut anlayış farelerde çalışmaların bir kombinasyonu gelen, birincil hücreler, hücre hatları ve hücre-free deneyler. Fare modelleri birçok onarım faktörler (örneğin UNG, Msh2, Msh6, Exo1 ve polimeraz η) 4-10 için kritik roller gösteren genetik tırnakları ile altın standart olmaya devam etmektedir. Ancak, bütün genleri nakavt çalışmaları için mükellef bulunmaktadır. Örneğin, birkaç çift iplikli sonu onarım proteinleri tırnakları embryonically ölümcül veya B-hücre gelişimi 11-14 bozar. Ayrıca, bazen SHM veya KSS bir proteinin belirli bir işlevi nakavt neden daha fazla küresel hasar maskelenmiş olabilir. Buna ek olarak, farelerde deneyler bu yana aday genler 15-18 tanımlanması ve karakterize hücre hatları tek tek genlerin ifadesi giderek daha popüler bir ilk adım haline gelmiştir değiştirerek, uzun süreli olabilir .
Ramos - yapısal SHM uğrar Burkitt lenfoma hücre hattı - SHM 18-24 incelemek için popüler bir hücre-line model olmuştur. Ramos hücrelerinin bir avantajı yerleşik rahat yarı olmasıSHM, nicel bir ölçüsüdür. Vahşi tip hücreleri mutasyonlar, bazı mutasyonların IgM ifade knock out pick up, IgM ifade ve. Bu nedenle, floresan ile aktive olan hücre tarama (FACS) IgM kaybı assaying SHM düzeyi için hızlı okuma sağlar. SHM daha nicel ölçümü doğrudan antikor genleri sıralama elde edilebilir.
Ramos hücreleri transfect zor olduğundan, biz istikrarlı ve türevleri üretmek, sırasıyla aşırı ekspresyonu kaset ya da kısa bir saç tokası RNA (shRNA), ya içeren retroviral veya lentiviral yapıları hücrelerini enfekte artış ya da bireysel bir gen ifade düşürdü. Burada, biz Ramos hücreleri enfekte ve sonra SHM (Şekil 1) belirli genlerin rolünü araştırmak için bu hücrelerin nasıl kullandıklarını açıklar.
Protocol
1. Örnekleri ve hücrelerin hazırlanması
- DNA (midiprep) aşırı ekspresyonu veya shRNA içeren yapıları ve retroviral ambalaj vektör pKat2 veya lentiviral ambalaj vektörler pVSV-G, pMDLg / pRRE ve pRSV-Rev 25 orta ölçekli bir hazırlık gerçekleştirin . Her bir yapı için 6 mg DNA ve ya pKat2 pVSV-g, pMDLg / pRRE her 4 mg (retroviral enfeksiyonları için) veya 1.5 mg DNA ve pRSV-Rev ambalaj vektörler (lentiviral enfeksiyonlar için) kullanın.
- Bosc 23 medya hazırlayın. Transfeksiyon için, düzelmeyen Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM) yanı sıra tam DMEM kullanın. Tam DMEM yapmak için, DMEM bir şişe% 1 Hepes tampon,% 1 penisilin-streptomisin-glutamin (PGS), ve% 10 yeni doğmuş buzağı serumu (NCS) ekleyin.
- Ramos ortam hazırlayın. Enfeksiyon adım için,% 1 Hepes,% 1 PGS ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) RPMI bir şişe ekleyerek orta RPMI-1640 (RPMI) tamamlamak. Tek hücre tohumlama adım, m, 2 gün boyunca tam RPMI Ramos hücreler büyüyor, 4 dakika için 400 X g hücreleri down iplik ve steril bir şişeye filtresi 0.2 mikron ile süpernatantı filtreleme AKE "klimalı" medya. Diğer eksiksiz bir medya gibi, klimalı ortam gereklidir 4 ° C 'ye kadar saklanır.
- , Hücrelerin% 50-60 gün Transfeksiyondan confluency olacağını gün önce transfeksiyon kadar 10 ml tam DMEM 100 mm plaka Bölünmüş 3 x 10 6 Bosc 23 hücreleri . Transfecting planı her bir vektör için hücrelerin bir tabak olun. Kültür hücreleri çok uzun süre tutuldu olması önemlidir; düşük geçiş sayısının hücre ya da son zamanlarda çözülmüş hücrelerin transfeksiyon ve iyi bir enfeksiyonu sigorta için enfeksiyon adımları kullanın.
- Deneyler için kontroller içerir. Transfections ve enfeksiyonlar için, bir negatif kontrol (untransfected veya bulaşmamış hücreleri) ve pozitif kontrol (GFP ve puromycin direnç geninin ifade virüs) oluşturun. ShRNA knock-down exper içiniments, şifreli veya alakasız shRNA kontrolü ile iyi bozar.
2. Bosc 23 hücreleri Transfecting
- 37 düzelmeyen DMEM ve tam DMEM şişe Sıcak ° C
- Bosc 23 hücrelerden ortamı çıkarın ve 5 ml tam DMEM ile değiştirin. Adım 2.6 'da kullanıma kadar 37 ° C inkübatör hücrelerin dönün.
- 5 dakika sonra kısaca vorteks (<1 saniye), oda sıcaklığında FuGENE 6 şişe ısıtın.
- 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe kısım 600 mcL düzelmeyen DMEM.
- 600 mcL düzelmeyen DMEM, vorteks kısa bir süre (<1 saniye) içine 30 mcL FuGENE 6 seyreltilir ve sonra beş dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Medya doğrudan pipetle dikkatli olun. FuGENE 6 tüp kenarlarına temas etmesine izin vermeyin.
- DMEM / FuGENE 6 karışımı, girdap bri 6 mg inşa ve ya 4 mg pKat2 (retroviral enfeksiyonları) veya 1.5 mg pVSV-G, pMDLg / pRRE her, ve pRSV-Rev (lentiviral enfeksiyonlar) ekle sonra efly (<1 saniye) ve 25 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Bosc 23 hücrelere DNA / 6 DMEM / FuGENE karışımı ekleyin ve 24 saat boyunca 37 ° C inkübatör dönmek.
- 24 saat sonra, 5 ml tam DMEM transfekte hücreler eklemek ve başka bir 24 saat süreyle 37 ° C inkübatör dönmek.
3. Viral parçacıkların Hasat
- 10 ml, 10 ml şırınga ile transfekte Bosc 23 hücreleri medya Hasat.
- 0.45 mikron şırınga sonuna kadar filtre takın ve temiz bir 15 ml'lik polipropilen tüpe medya filtre.
- -80 Viral medya hemen kullanın veya 1 ml, 2 ml kriyojenik flakonlarda alikotları olarak dondurmak ° C
- Viral medya hasat sonra, verimli transfeksiyon FACS pozitif kontrol hücrelerinde meydana geldiğini teyit etmektedir. Inşa floresan (örneğin, GFP) ya da bir hücre yüzey işaretleyici (örneğin Thy1) ya içeriyorsa Bu aynı zamanda tüm örnekler için yapılabilir.
- 6 plaka enfeksiyon 24 saat önce içine tam RPMI 2 x 10 5 hücre / ml Ramos hücreleri Tohum 2 ml. Yine, iyi enfeksiyon sigortalamak için düşük geçit sayısı hücreleri veya son çözülmüş hücreleri kullandığınızdan emin olun.
- Virüsün dondurulmuş alikot kullanıyorsanız, 37 hızla viral medya Çözülme ° C
- , 10 mg / ml polybrene 3 mcL 1 ml viral medya karıştırın. Polybrene son konsantrasyon 10 mg / mL, 3 mL hacimde olmalıdır.
- Hücrelere pipetleme tarafından virüs / polybrene karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. 1 ml tam RPMI ve 3 mcL polybrene iyi yerine 1 mL virüs ekleyin; gibi daha önce, biri de bulaşmamış olduğu bir kontrol olarak kullanılan olmalıdır. Eşleştirilmiş bir negatif kontrol ile iyi bir bulaştırmak için emin olun. Ayrıca FACS enfeksiyonu etkinliğini belirlemek için, GFP içeren bir vektör ile iyi bir bulaştırmak.
- 3000 X g de 90 dakika oda sıcaklığında 6 plaka santrifüjleyin.
- Plaka dön.48 saat boyunca 37 ° C inkübatör.
- 4 dakika oda sıcaklığında 48 saat sonra, 400 X g 15 ml polipropilen tüp içinde enfekte olan hücreleri aşağı doğru döndürün. Hücre pelletini rahatsız emin olmak, aspirasyon medya çıkarın. Taze RPMI hücrelerin tekrar
- FACS pozitif kontrol örneği enfeksiyon verimliliğini onaylayın. Daha önce olduğu gibi, inşa floresan (örneğin, GFP) ya da bir hücre yüzey işaretleyici (örneğin Thy1) ya içeriyorsa tüm örnekler için yapabilirsiniz.
- (Uygunsa) hücre seçimi başlayın. Bizim shRNA içeren yapıları bir puromycin direnç kaset içerir. Biz 0.25 mikrogram / mL puromycin ile shRNA enfekte Ramos hücreleri seçin. Biz Ramos hücreleri türevleri bazen puromycin duyarlılık değişmiş göstermek ve bu nedenle, biz her türevi puromycin konsantrasyonu optimize etmek için eğriler öldürmek gerçekleştirmek bulabilirsiniz. Ayrıca bu seçimin etkin olduğunu onaylamak için puromycin bulaşmamış kontrolü hücreleri tedavi.
Tek ekim iki yöntemden biri uygulanabilir: sıralama veya elle FACS.
- FACS: tohum, 1 hücreli bir tabak adaptörü ile kullanın / FACS sıralayıcı iyi bir 96 plaka% 40 RPMI/40%% klimalı media/20 FBS 100 mcL ile önceden doldurulmuş. Bu yöntem çok daha tek bir hücre klonlar plaka başına verir.
- Elle: hücreleri sayın. % 40 RPMI/40%% klimalı media/20 FBS 10 hücre / ml 'ye bir kısım hücreler sulandırınız. Seyreltilmiş hücrelerin her numaralı seribaşı plaka için 10 ml kullanın. Farklı klonlar, bu nedenle birkaç plakaları farklı konsantrasyonlarda (3 ila 20 hücre / ml 'ye kadar) kurmak için yararlıdır, bu aşamada değişken kurtarma gösterecektir. Birden fazla hücre doğan klonların önlemek için daha az çıkıntılar) üreten birini kullanın. 100 mcL ile seyreltilmiş hücrelerinin tohum 96-iyi plakalar, çok kanallı pipet kullanın.
- 2 hafta boyunca 37 ° C inkübatör tabak yerleştirin.
- Bireysel kuyular kontrol under hücrelerinin varlığı tohumlama bir gün sonra onaylamak için mikroskop. Tek hücreler doğru derinlikte odaklanma ihtiyacı nedeniyle bulmak zor olabilir. 96-plaka altındaki baskılı iyi sayılar üzerinde yoğunlaşırken yardımcı olacaktır. Hücreleri çoğu kuyu hücre beri FACS sıralayıcı numaralı seribaşı bulmak daha kolay.
- 2 hafta sonra, büyüyen koloniler zor, alttan plakaları bakarak çıplak gözle görülebilir. Bunlar mikroskop altında görmek çok daha kolay. Kolonileri farklı kuyularda aynı kenarı boyunca büyümeye bir tabak iyi ve tipik koloniler kenarlarında büyümek eğilimindedir. Mark sağlam hücre büyümesi ile kuyu ve 1 ml RPMI 24 kuyucuğu hücreleri transferi ve 37 ° C inkübatör dönmek.
- 1 x 10 1 - 5 x 10 6 hücre / ml hücreleri koruyun. 4 dakika oda sıcaklığında 400 X g hücreler eğirme ve gerektiği gibi medya kaldırarak medya değiştirin. 1 ml taze RPMI ile değiştirin.
- Birkaç d sonrabüyüme AYS, 6 plaka hücreleri transferi ve 37 ° C inkübatör büyümeye devam.
- 3 hafta sonra, klonlar IgM kaybı (aşağıda açıklandığı gibi) için analiz eder.
- 2 hafta boyunca hücreler büyümeye devam eder ve daha sonra 5 haftalık bir zaman noktasında klonlar yeniden analiz.
6. Analizi: IgM kaybı (3 hafta ile 5 hafta)
- Kısım 5 x 10 5 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe her kuyudan hücreleri ve oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g hücreleri aşağı doğru döndürün. Lekesiz bir kontrol için shRNA-knock-down kontrol ve kuyu her hücrelerin yanı sıra bir numune kullanın.
- 1 mL PBS hücrelerin yıkayın ve sonra oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g tekrar döndürebilirsiniz.
- 50 mcL, PBS (lekesiz kontrolü) veya PBS içinde süspanse edin + PE-etiketli α-insan IgM antikoru seyreltme 01:20. 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- 4 dakika oda sıcaklığında 400 X g hücreleri aşağı spin.
- C yıkayın400 X g PBS ve spin 4 dakika için 1 ml oda sıcaklığında her zaman iki kere arşın.
- PBS 100 mcL supernatant ve tekrar süspansiyon haline getirin çıkarın. Yeniden süspanse boyanan hücreler FACS tüpüne aktarın.
- FACS makine kullanarak hücrelerin analiz edin.
- ShRNA çaldı aşağı hücreleri vs kontrolleri hücrelerin IgM yüzde karşılaştırın. Daha önce de belirtildiği gibi, gibi FACS tarafından ölçülen IgM kaybı Ramos hücreleri içinde SHM güvenilir bir yarı-nicel bir ölçüsüdür.
7. Analiz: kantitatif RT-PCR (5 hafta) knock-down onaylayın
- Kısım 3 x 10 6 Her kuyudan hücreleri ve oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g de aşağı doğru döndürün.
- RNA hücre kısım hazırlayın. Biz üretici tavsiyelerine göre TRIzol kullanın.
- RNA hazırlık cDNA hazırlayın. Biz üretici tavsiyelerine göre 2 mikrogram RNA ve Üstsimge II.
- CDNA doğrulayıcı için kantitatif PCR gerçekleştirinm tak-down. Biz 10 mcL toplam reaksiyon hacmi bir normalleşme kontrolü ve SYBR FAST qPCR kiti gibi GAPDH kullanın.
8. Analiz: Genomik sıralama (5 hafta)
- Kısım 5 x 10 6 Her kuyudan hücreleri ve oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g de aşağı doğru döndürün.
- Bu hücrelerden genomik DNA izole edin. Biz üretici tavsiyelerine göre Wizard SV genomik DNA saflaştırma kiti kullanın.
- PCR, Ig V genleri 19 (Tablo 1) ve ilgi KAPA HiFi DNA polimeraz kullanarak herhangi bir diğer genler genomik DNA yükseltmek . Biz düşük hata oranları nedeniyle bu polimeraz kullanabilirsiniz, ancak herhangi bir yüksek sadakat PCR Polimeraz kabul edilebilir olmalıdır.
- Jel QIAquick jel ekstraksiyon kiti kullanarak% 1 agaroz jel üzerinde PCR ürünleri arındırmak.
- Diğerleri yok iken bazı polimerazları, PCR ürünleri 3 'uçları tek bir deoksiadenozin (A) kalıntı eklemek. Bu 3 'A kuyrukları TOPO TA için gerekli olanklonlama adımı. KAPA HiFi polimeraz 3 'A kuyrukları bırakmaz. A-tail, 72 ° C'de 30 dakika süreyle 3 mcL 10x Taq reaksiyon tamponu, 1 mcL 10 mM dNTP ve 1 birim Taq polimeraz 25 mcL jel saflaştırılmış PCR ürünü kuluçka PCR ürünleri.
- TOPO TA Klonlama kiti kullanılarak jel saflaştırılmış PCR ürünleri klonlama. Sağlanan E. TOPO reaksiyon ürünleri Dönüşümü coli DH5α-T1 R 100 mcg / ml ampisilin ve üretici tavsiyelerine göre 1.6 mg X-gal ile desteklenmiş içeren LB / Agar plakaları yetkili hücreleri ve plakası.
- Sıralama için ayrı ayrı koloniler gönder.
- Türleri ve mutasyonlar yerleri belirlemek için dizi analizi yapın.
9 - Temsilcisi Sonuçlar:
Önce de belirttiğim gibi, biz, hem de GFP yanı sıra bir puromycin direnç geninin ifade pozitif kontrol viral vektör kullanın. Genellikle iki günde% 50-75 GFP + hücrelertransfeksiyon sonra. Enfeksiyonlarda, genellikle% 50-70 oranında hücreler enfeksiyon + iki gün sonra ancak seçim öncesi GFP bakın. Seçimi tamamlandıktan sonra, hücrelerin>% 95 GFP +.
Temsilcisi deneyler olarak, eksprese YARDIM veya Ramos hücrelerinde tamir faktörü aşağı vurma etkilerini göstermektedir. Özellikle, biz Bosc 23 hücre içine retroviral ambalaj vektör pKat2 birlikte Thy1.1 bir IRES sitesi ile bağlantılı YARDIM retroviral aşırı ekspresyonu vektör transfekte. Virüs içeren medya süzüldükten sonra Ramos hücreleri enfekte etmek için kullanılır oldu. Her iki vahşi tip (WT) ve YARDIM eksprese (AID hi) hücreleri tek hücre (Şekil 3 QRT-PCR (Şekil 2) ve IgM FACS tarafından kaybı için gen ekspresyonu için analiz edildi ve bu noktada, tohumlari ve 3 hafta boyunca yetişen .) FACS boyama için, hücreler PE-etiketli α-insan IgM antikoru yanı sıra 1:400 sulandırılmış FITC etiketli α-sıçan CD90/mouse seyreltilmiş hem de 1:20 ile inkübe edildi.CD90.1 (Thy1.1) antikoru. Ayrı bir deneyde, ya ilgisiz bir shRNA (kontrol) veya karşı shRNA SHM karşı korumak için beklenen bir hi-fi DNA tamir faktörü içeren lentiviruses Bosc 23 hücreleri yapıldı ve ardından YARDIM hi klon Ramos hücrelerinin içine bulaşmış. Yine, gen ekspresyonu (Şekil 4) ve IgM kaybı (Şekil 5) 3 hafta sonra, tek bir hücre klonlar olarak incelendi. Tamir faktörü SHM sırasında mutasyonlar karşı koruma sağlamak için düşünülen bu yana, biz faktör yokluğunda IgM kaybı ve SHM bir artış görüyoruz. Biz nakavt, SHM ile ilişkili mutasyonlar üreten ilgili bir faktör olsaydı, bunun yerine IgM kaybı bir azalma gördük.
Beklendiği gibi, Mah-PCR sonuçları, YARDIM ifade aşağıdaki YARDIM aşırı ekspresyonu vektörü (Şekil 2) ile hücrelerin enfeksiyonu belirgin bir artış göstermektedir, bu faktör karşı hedef shRNA varlığında DNA tamir faktörü damla düzeyleri (Şekil 4 .) Çünkü bireysel clonees değişebilir, gen ekspresyon düzeylerinde bazı değişiklikler görebilirsiniz. Gen ekspresyonu değişebilir, çünkü daha fazla analiz planı her klon ifade onaylamak için gereklidir. Aynı gen karşı farklı shRNAs yanı sıra, bu nedenle en büyük etkiye sahip olduğunu belirlemek için çeşitli shRNAs ekranı olmalıdır gen ekspresyonu üzerinde farklı etkileri olabilir. Demonte de immün protein düzeyinde teyit edilebilir. Benzer şekilde, bireysel klonlar IgM kaybı seviyeleri büyük ölçüde değişebilir. Bazı klonlar bir IgM mutasyon erken hücre bölünmeleri birinde meydana gelen bir "jackpot" etkisi göstermektedir - örneğin, hücrelerin IgM oldu çünkü>% 50 IgM kaybı göreceksiniz - İki hücre aşamasında . Birkaç tek hücre klonları için medyan hesaplanırken bu klonların etkisi en aza indirilmiştir.
Şekil 1 şematik için transIgM kaybı infeksiyonu, enfeksiyon ve analizi. Ayrıntılar için metne bakınız.
Şekil 2 Ramos hücreleri YARDIM aşırı ekspresyonu. WT ve YARDIM hi Ramos hücreleri bireysel klonlar noktası YARDIM ifade QRT-PCR ile ölçüldü klonlanmış ve 3 hafta boyunca yetişen, tek bir hücre. GAPDH ifade normalleşmesi için kullanılmıştır. WT 1 ile kurulmuştur. Medyan değeri belirtilir. * P değeri <0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir.
WT hücrelere kıyasla Şekil 3 YARDIM hi hücrelerin IgM kaybı Artan. Yüzey IgM 3 haftalık bir zaman noktasında FACS tarafından ölçüldü ve IgM kaybı yüzde WT ve YARDIM hi hücreleri için hesaplanmıştır. (A) WT klon ve YARDIM hi klon Temsilcisi FACS arsa. YARDIM aşırı ekspresyonu vEctor YARDIM IRES sitesi üzerinden Thy1.1 ile bağlantılı, bu yüzden ifade Thy1.1 YARDIM ifade için bir vekil olarak kullanılır vardır. (B) IgM kaybı birkaç WT ve YARDIM hi klonlar kantitasyonu. Medyan değeri belirtilir. * P değeri <0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir.
Şekil 4 YARDIM hi hücreleri tamir faktörü demonte. Hücreler ya da ilgisiz bir shRNA kontrolü (kontrol) veya ilgi shRNA (shRNA) ve tek bir hücre numaralı seribaşı ile infekte edildi. 3 hafta sonra, bireysel klonlar gen ekspresyonu QRT-PCR ile ölçüldü. GAPDH ifade normalleşmesi için kullanılmıştır. WT 1 ile kurulmuştur. Medyan değeri belirtilir. * P değeri <0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir.
Şekil 5. Artan IgM kaybıYARDIM hi bir onarım faktör-devrildi seviyeleri ile hücreleri. 3 haftalık bir zaman noktasında FACS çeşitli klonlar Yüzey IgM ölçüldü ve hücreleri hala eksprese YARDIM IgM kaybı yüzdesi hesaplanır. Medyan değeri belirtilir. * P değeri <0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir.
Ig genleri 19 Tablo 1. Primer dizileri sürekli bölge Cμ, ağır zincir V bölgesi (V H), ve hafif zincir V bölgesi (V L).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Daha önce tartışıldığı üzere, antikor çeşitlendirilmesi için hücre hattı modelleri, antikor çeşitlendirilmesi sırasında farklı adımlar etkiler roman proteinleri tespit etmek için popüler bir başlangıç noktası haline gelmiştir. Biz burada, Ramos, B-hücre hattı viral enfeksiyon ya knock-aşağı veya eksprese proteinlerine kullanmak için bir yöntem mevcut ve sonra SHM üzerindeki etkisini incelemek.
Bu çalışmalar için, biz WT Ramos ve YARDIM hi Ramos hücreleri kullanır. YARDIM hi hücreleri YARDIM ifade etkileyen faktörler hariç WT hücreleri hedefleme ya da YARDIM oluşturulan lezyonların tamiri YARDIM ifade yanı sıra yer alan faktörleri incelemek için kullanılabilir.
SHM başlangıçta IgM + hücreleri bir nüfusa IgM kaybı için assaying burada ölçülür, bu da dikkate alınmalıdır. Alternatif olarak, IgM ile başlamak mümkündür. Hücreleri ve reversion tayininde IgM + hücreler bir kazanç için 23 bakmak </ P>
Farklı seçim belirteçleri (örneğin puromycin, hygromycin, GFP veya Thy1.1) kullanarak, biz de aynı protokol ile aynı anda birden fazla enfeksiyonların gerçekleştirebilirsiniz. Ancak, biz bulduk, iki farklı antibiyotik seçimi belirteçleri, hücrelerin değişim hassasiyetleri kullanırken. Aynı anda iki antibiyotik seçimi için koşulları optimize etmek için ek öldürmek eğrileri gerçekleştirmek için gerekli olacaktır. Biz iki farklı faktörler ya da başka bir faktör artı bir aşırı ekspresyonu, vb bir knock-down çift knock-çıkışlar kolaylıkla üretebilirsiniz
Biz aynı zamanda B-hücre-line modeller için bu protokol adapte var. Örneğin CH12F3-2 hücreleri (KSS incelemek için kullanılan bir fare B-hücre hattı) 26,27, aynı enfeksiyon adımları, enfeksiyon gününde seribaşı 1 x 10 6 CH12F3-2 hücreleri (varyasyon bulaştırmak için kullanılır . adım 4.1). Bu hücreler puromycin 1 mcg / ml ile seçilir. Benzer şekilde, aynı protokolü deYARDIM başlatılan gen dönüşüm için bir hücre hattı modeli - tavuk DT40 hücreler için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
PMSCV YARDIM-I-Thy1.1 ve pKat2 vektörler DG Schatz ve pVSV-G, pRSV-Rev bir tür hediye ve pMDLg / pRRE vektörler BR Cullen bir tür hediye edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Suggested reagents - most of these may be substituted with similar products from other vendors. | |||
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Biosciences | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Corporation | 4604 | |
| Agar | TEKnova, Inc. | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche Group | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth - Luria) Powder | Difco Laboratories | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma-Aldrich | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega Corp. | A2495 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega Corp. | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
References
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
- Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
- Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
- Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
- Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
- Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
- Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
- Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
- Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
- Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
- Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
- Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
- Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
- Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
- Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
- Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
- Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
- Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
- Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
- Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
- Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
- Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
- Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
