Bioengineering

सेल फ्यूजन की जांच के लिए एक Cre Lox पी पुनर्संयोजन दृष्टिकोण Vivo में Published: January 4, 2012 doi: 10.3791/3581

DOI

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Anthony J. Sprangers¹, Brian T. Freeman¹, Nicholas A. Kouris¹, Brenda M. Ogle²

¹Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, ²Department of Biomedical Engineering, Materials Science Program, Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison

Summary

एक समय पर रहने वाले जीवों में सेल संलयन ट्रैक विधि वर्णित है. दृष्टिकोण Cre - का इस्तेमाल

Protocol

1. दाता सेल अभिकर्मक
हार्वेस्ट mesenchymal स्टेम सेल (, MSCs, H1 भ्रूण स्टेम कोशिकाओं कृपया डॉ. Peiman Hematti द्वारा दान से प्राप्त वैकल्पिक रूप से, किसी भी vivo में फ्यूज धारणा प्रजातियों में से किसी भी सेल प्रकार नियोजित किया जा सकता है) 70 जब - 80% 1X trypsin के साथ मिला हुआ (Mediatech, Manassas 5 मिनट के लिए) VA. α सदस्य पूरा मध्यम (एंटीबायोटिक मुक्त, Invitrogen, Carlsbad ^सीए) 18 के साथ trypsin निष्क्रिय. 5 मिनट के लिए 300 XG अपकेंद्रित्र.
ध्यान से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन) और फिर निलंबित गोली 1X पीबीएस के 1 एमएल में और एक hemacytometer का उपयोग कोशिकाओं गिनती.
स्थानांतरण 1.5 x 10 एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब ⁶ कोशिकाओं. 5 मिनट के लिए 300 XG अपकेंद्रित्र.
ध्यान से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन). आर बफर (नियॉन अभिकर्मक सिस्टम, Invitrogen) और 6 μg (2 μg / 5.0 x 10 ⁵ कोशिकाओं) के 300 μL में Resuspend गोली p231 pCMVe betaAc बंद करो-Luc (Addgene, कैम्ब्रिज, एमए). जगह ई बफर के 3 एमएल (Invitrogen electroporation डॉकिंग पोर्ट प्रति निर्माता प्रोटोकॉल (नियॉन अभिकर्मक सिस्टम, Invitrogen) में).
एक 100 μL नियॉन pipet टिप सेल प्लाज्मिड समाधान स्थानांतरण और एमएस 20 और 1500 वोल्ट का एक परिमाण के एक स्पंद अवधि के साथ electroporate. प्लेस 15 एमएल शंक्वाकार 9.7 एमएल α सदस्य पूरा मध्यम युक्त ट्यूब में कोशिकाओं electroporated.
10 एमएल की कुल मात्रा उपज 1.5 दो अतिरिक्त समय और पूल ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं कदम दोहराएँ. एक T175 10 एमएल α सदस्य पूरा मध्यम युक्त कुप्पी के लिए 10 एमएल सेल निलंबन (1.5 ^{x 6} कोशिकाओं 10) जोड़ें . Electroporation के बाद सेल व्यवहार्यता लगभग 30% है, 4.5 लगभग x 10 T175 ⁵ प्रति व्यवहार्य कोशिकाओं उपज.
Α सदस्य अभिकर्मक निम्नलिखित पूरा मध्यम 24 घंटे बदलें.
80% सहधारा (~ 2 - - 3 दिन के बाद electroporation) हार्वेस्ट 70 जब कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट. सेल गिनती का उपयोग कर एक hemacytometer प्रदर्शन और 1.0 x 10 ⁶ के एक एकाग्रता में कोशिकाओं resuspendα सदस्य पूरा मध्यम की μL cells/50. न्यूनतम समय कोशिकाओं को निलंबन में खर्च इंजेक्शन के लिए कोशिका मृत्यु से पहले कम.
2. Intramyocardial इंजेक्शन
अनिवार्यता से हर कोशिका में व्यक्त Cre recombinase ((सीएमवी - रचनात्मक) B6.C टीजी 1Cgn / जम्मू, जैक्सन प्रयोगशाला, बार हार्बर करने के लिए इंजीनियर ट्रांसजेनिक चूहों पर isoflurane (फीनिक्स फार्मास्यूटिकल्स, Inc, सेंट जोसेफ, एमओ) द्वारा प्रेरित संज्ञाहरण, ME).
सीने में क्षेत्र से बाल बाल कतरनी या रासायनिक बाल हटानेवाला का उपयोग निकालें.
150 μL की एक स्ट्रोक की मात्रा के साथ 130 प्रति मिनट साँस - एक 18 गेज (Becton Dickinson एंड कंपनी, फ्रेंकलिन Lakes न्यू जर्सी) कैथेटर और माउस वेंटीलेटर पर जगह 120 के साथ नली लगाना.
जिससे एक thoracotomy उत्पादन चौथे पसलियों के बीच अंतरिक्ष में पार्श्व चीरा करें.
दिल Visualizing, दो ट्रांसफ़ेक्ट सेल निलंबन के 25 μL इंजेक्शन एक 1 एमएल (Temuro मेडिकल निगम, सोमरसेट, न्यू जर्सी) सिरिंज और 28 गेज सुई (Bect का उपयोग करपर डिकिंसन और सह, फ्रेंकलिन Lakes न्यू जर्सी). Intramyocardial इंजेक्शन आसानी और अंग को अत्यधिक नुकसान को रोकने, सुई ~ सिर 90 डिग्री मोड़.
इंजेक्शन के बाद, absorbable sutures के (जैसे, vicryl) का उपयोग करने के लिए पसलियों और मांसपेशियों परतों बंद. सीवन त्वचा 4-0 नायलॉन या रेशम का उपयोग बंद कर दिया.
संज्ञाहरण और extubate से उबरने के लिए माउस को अनुमति दें.
नियंत्रण समूहों Cre केवल, Cre चूहों untransfected कोशिकाओं और जंगली प्रकार ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (वैकल्पिक रूप से, Cre चूहों ट्रांसफ़ेक्ट प्रवण फ्यूज नहीं कोशिकाओं प्राप्त) प्राप्त चूहों के एक ही एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मध्यम इंजेक्शन प्राप्त चूहों को शामिल करना चाहिए.
3. Biophotonic इमेजिंग
पांच से पंद्रह मिनट पहले इमेजिंग, intraperitoneally (आईपी) 15 मिलीग्राम / एमएल डी Luciferin (कैलिपर लाइफ साइंसेज, Hopkinton, एमए) के माउस शरीर के वजन के प्रति ग्राम 10 μL इंजेक्षन.
4% पर शामिल होने के लिए प्रेरित isoflurane के माध्यम से चूहों पर संज्ञाहरण- 1 घ रखरखाव के लिए 2%.
प्लेस facemask 1 प्रशासन के साथ इमेजिंग बॉक्स में लापरवाह चूहों रखरखाव संज्ञाहरण (Xenogen Biophotonic इमेजिंग सिस्टम, Hopkinton, एमए) के लिए 2 isoflurane%. कई चूहों समवर्ती imaged किया जा सकता है. छवि नकली नियंत्रण माउस luminescent संकेत के आसान तुलना करने के लिए प्रयोगात्मक चूहों के साथ.
लिविंग छवि सॉफ्टवेयर (Xenogen) का प्रयोग, उचित जोखिम समय (आमतौर पर 60 सेकंड, परिणाम देखें) निर्धारित किया है. सेट करने के लिए चूहों को फिट और इमेजिंग भर में क्षेत्र के अनुरूप रखने संवेदनशीलता में परिवर्तन को रोकने के लिए छवि के क्षेत्र. 4.5 सेमी विषय ऊंचाई सेट.
दृश्य क्षेत्र के भीतर luminescence तीव्रता माउस या चूहों के लिए संगत संकेत अधिग्रहण और असंशोधित छवि फ़ाइलों को बचाने. प्रक्रिया छवियों को एक नियंत्रण या unmanipulated माउस को इसी पृष्ठभूमि संकेत हटाने के लिए. पृष्ठभूमि ऊपर तीव्रता मूल्यों जानवर के भीतर इनकार कोशिकाओं के अनुरूप. तीव्रता विश्लेषण लिविंग छवि (Xenogen) सॉफ्टवेयर या खुला स्रोत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर आयोजित किया जा सकता है. टीypically, ब्याज की एक क्षेत्र (आरओआई) जानवरों और प्रयोगों के बीच तीव्रता डेटा की तुलना करने के लिए चयनित है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
Xenogen Biophotonic इमेजिंग प्रणाली की संवेदनशीलता, एक सेल लाइन है जो अनिवार्यता से luciferase व्यक्त (231 - ल्यूक - D3H1, Xenogen) C57/Bl6 चूहों (जैक्सन प्रयोगशाला) की मायोकार्डियम दिया गया था निर्धारित करने के लिए. कक्ष 1 एक्स की सांद्रता में अंतःक्षिप्त थे 10 ^6, 1 x 10, ³ या 1 x 10 ¹ कोशिकाओं सेल प्रसव के बाद छह घंटे, चूहों luciferin साथ intraperitoneally अंतःक्षिप्त थे और Xenogen प्रणाली का उपयोग imaged किया. एक विशिष्ट संकेत १,००० कोशिकाओं (2 6 imaged चूहों, चित्रा 2) के साथ पता लगाया जा सकता है, लेकिन पता लगाने 10,000 कोशिकाओं (6 6 imaged चूहों के) के साथ और अधिक विश्वसनीय था. महत्वपूर्ण बात, इस अध्ययन में यह भी luciferase व्यक्त कोशिकाओं और संकेत तीव्रता की संख्या के बीच किसी न किसी संबंध की स्थापना सेवा.

और Cre-व्यक्त चूहों की मायोकार्डियम दिया . सेल प्रसव के बाद लगभग एक सप्ताह, चूहों पहले डी luciferin इंजेक्शन बिना Xenogen प्रणाली का उपयोग imaged थे. एंजाइमी सब्सट्रेट के बिना उम्मीद, नहीं तीव्रता संकेत (चित्रा 3) पता चला था . अगला, डी luciferin intraperitoneally और एक luciferase तीव्रता के संगत संकेत इंजेक्ट किया गया था और इस प्रकार सेल संलयन दो चार परीक्षण चूहों में पता चला था. इसी प्रकार का एक संकेत के बाद एक सप्ताह (चित्रा 3) का पता चला था, इस मामले में सुझाव है एमएससी युग्मित संलयन उत्पादों vivo में रखा जा सकता है, अध्ययन करने के लिए दिल और आसपास के ऊतकों के मूल्यांकन के लिए अनुमति देने के लिए समाप्त किया गया, लेकिन एक कल्पना सकता दीर्घकालीन विश्लेषण और अधिक लगातार इमेजिंग रखरखाव, प्रसार, ट्रैकचूहों में शायद संलयन उत्पादों के प्रवास.

चित्रा 1. Vivo में पता लगाएँ सेल फ्यूजन तकनीक के योजनाबद्ध यदि बीच विलय Cre व्यक्त माउस कोशिकाओं और प्रतिरोपित floxed luciferase होता है प्लाज्मिड व्यक्त कोशिकाओं, luciferase व्यक्त किया जाएगा. Luciferase माउस में enzymatic सब्सट्रेट, डी luciferin, इंजेक्शन और फिर इमेजिंग माउस Xenogen Biophotonic इमेजिंग सिस्टम (19 से अनुकूलित) का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है

चित्रा 2. का पता लगाने की संवेदनशीलता luciferase व्यक्त biophotonic इमेजिंग के साथ हृदय ऊतक में कोशिकाओं. विभिन्न कुल सेल नंबर पर C57/Bl6 चूहों के intramyocardial स्थान के लिए एक सेल लाइन है जो अनिवार्यता से luciferase व्यक्त (231 - ल्यूक - D3H1, Xenogen) दिया गया था. चूहों के प्रतिनिधि छवियों फिर1 x 10 ^6, 1 ³ एक्स 10 और 1 x 10 ¹ कोशिकाओं (दाएं से बाएं) ceiving दिखाए जाते हैं, इमेजिंग इंजेक्शन के बाद लगभग 6 घंटे आयोजित किया गया.

चित्रा 3. सेल फ्यूजन की सांकेतिक Vivo Luminescence में की मात्रा का ठहराव MSCs प्लाज्मिड LoxP बंद करो LoxP-luciferase और Cre-व्यक्त चूहों की मायोकार्डियम दिया साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे. सेल प्रसव के बाद लगभग एक सप्ताह और दो सप्ताह, Cre चूहों Xenogen Biophotonic इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करने के लिए सेल संलयन का संकेत luminescence की तीव्रता को मापने imaged थे. (ए) और दिखावा और चूहों 1-4 की luminescence की तस्वीर और तीव्रता के सेल प्रसव के बाद 17 दिनों ओवरले (दाएं से बाएं). (बी) दिखावा और 1-4 चूहों के luminescence की तीव्रता (दाएं से बाएं) सेल प्रसव के बाद 17 दिनों. ब्याज की एक क्षेत्र (पीला) चुना गया था इंजेक्शन साइट और तीव्रता एल इसीevels ImageJ (मुक्त स्रोत) ²⁰ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारित किया गया है. (सी) luminescence की तीव्रता नकली माउस पर ब्याज के सभी प्रयोगात्मक शर्तों के लिए एक ही क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत था. एक सप्ताह में, चूहों 3 और 4 सकारात्मक luminescence एक माउस सेल और प्रतिरोपित एमएससी की सहज संलयन सुझाव संकेत दिखाया. संकेत दो सप्ताह में 3 माउस में बनी. 3 माउस को इसी संकेत के अंग विशेष स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए, वक्ष गुहा उजागर किया गया था और प्राथमिक अंगों excised और imaged. (डी) तस्वीर की तीव्रता और माउस 3 के luminescence के ओवरले. छोटी आंत में तीव्रता संकेत के नोट स्थानीयकरण. (ई) 3 माउस के luminescence की तीव्रता. (एफ) तस्वीर की तीव्रता और नकली माउस के luminescence के ओवरले. (G) नकली माउस के luminescence की तीव्रता.

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Discussion

विधि यहाँ की अनुमति देता है वर्णित है, पहली बार के लिए, छोटे जानवरों सहित जीवों में असतत पहचान और सेल संलयन अस्थायी विश्लेषण,. बाद biophotonic छवि विश्लेषण के साथ दृष्टिकोण Cre - LoxP पुनर्संयोजन को जोड़ती है. दृष्टिकोण न केवल सेल सेल संलयन पर नज़र रखने के लिए उत्तरदायी है, लेकिन यह भी वायरस सेल संलयन और वायरल संक्रमण पर नज़र रखने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है. छवि विश्लेषण तेजी है और यह छवि एक साथ कई छोटे जानवरों को संभव है संलयन की जांच उनके इसी microenvironments में विशेष सेल भागीदारों के विलय की आवृत्ति और LoxP बंद करो LoxP-luciferase प्लाज्मिड के अभिकर्मक की क्षमता सीमित है. इस प्रकार, इष्टतम परिणामों संलयन LoxP बंद करो LoxP-luciferase अनुक्रम का एक एकीकृत रूप से युक्त भागीदारों के साथ प्राप्त होगा . इसके अलावा, जीवों छवि के लिए स्थिर हो और इसलिए संज्ञाहरण छोटे जानवरों के लिए आवश्यक है करना चाहिए .

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए उदारता से H1, MSCs और डॉ. टिम हैकर, डा. Gouqing गीत और विस्कॉन्सिन कार्डियोवास्कुलर फिजियोलॉजी के विश्वविद्यालय के सुश्री जिल कोच उपलब्ध कराने के लिए डा. Peiman Hemmati (मेडिसिन विभाग, मैडिसन विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय) का धन्यवाद करना चाहते हैं माउस सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए कोर सुविधा. इस काम ब्रायन फ्रीमैन और NIH R21 HL089679 एक स्नातकोत्तर अनुसंधान फैलोशिप के माध्यम से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000
Neon 100 μL Kit	Invitrogen	MPK10025	Contains R and E Buffer
a-MEM powder	Invitrogen	12000-022
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03
B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J	Jackson Laboratory	006054
Trypsin 10X	Fisher Scientific	MT-25-054-Cl
L-Glutamine	Fisher Scientific	25030-081
D-Luciferin	Caliper Life Sciences	122796
Xenogen Biophotonic Imaging System	Caliper Life Sciences	IVIS Spectrum
Sodium Biocarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Non-essential Amino Acids	Invitrogen	11140-050