Summary
Метод для отслеживания слияния клеток в живом организме с течением времени описывается. Подход использует Cre-
Protocol
1. Трансфекция клетки-донора
- Урожай мезенхимальные стволовые клетки (МСК, полученных из H1 эмбриональных стволовых клеток любезно пожертвовал д-р Пейман Hematti; альтернативно, любого типа клеток какого-либо вида гипотетически предохранитель в естественных условиях могут быть использованы), когда 70 - 80%, сливающийся с 1X трипсина (Mediatech, Манассас В.А.) в течение 5 мин. Деактивировать трипсина с α-MEM полной среде (антибиотик бесплатно, Invitrogen, Карловы Вары CA) 18. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 мин.
- Тщательно аспирата супернатант и вновь приостановить гранул в 1 мл 1X PBS и считать клетки, используя hemacytometer.
- Передача 1,5 х 10 6 клеток в 1,5 мл трубки центрифуги. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 мин.
- Тщательно аспирата супернатант. Ресуспендируют осадок в 300 мкл буфера R (Neon трансфекции системы, Invitrogen) и 6 мкг (2 мкг / 5,0 х 10 5 клеток) P231 pCMVe-betaAc-СТОП-Люк (Addgene, Кембридж, Массачусетс). Место 3 мл буфера E (InvitrOgen) к порту электропорации стыковки в соответствии с протоколом производителя (Neon системы Трансфекция, Invitrogen).
- Передача клеточной плазмиды решение 100 мкл кончика пипетки Неон и electroporate с длительностью импульса 20 мс и величиной 1500 вольт. Место электропорации клеток в 15 мл коническую пробирку, содержащую 9,7 мл α-MEM полной среде.
- Повторите шаг 1,5 еще два раза и бассейн трансфицированных клеток для получения общего объема 10 мл. Добавить 10 мл клеточной суспензии (1,5 х 10 6 клеток), чтобы T175 колбу, содержащую 10 мл α-MEM полной среде. Жизнеспособность клеток после электропорации составляет около 30%, чтобы получить примерно 4,5 х 10 5 жизнеспособных клеток на T175.
- Изменение α-MEM полной среде 24 часа после трансфекции.
- Урожай трансфицированных клеток, когда 70 - 80% сливной (~ 2 - 3 дня после электропорации). Выполните клеток использованием hemacytometer и ресуспендируйте клетки в концентрации 1,0 · 10 6cells/50 мкл α-MEM полной среде. Свернуть клетки времени проводят во взвешенном состоянии, чтобы уменьшить гибель клеток перед инъекцией.
2. Intramyocardial инъекций
- Вызвать наркозом изофлуран (Phoenix Pharmaceuticals, Inc, Санкт-Джозеф, штат Миссури) на трансгенных мышей разработаны для конститутивно выражают Cre рекомбиназы в каждой клетке (B6.C-TG (ЦМВ-CRE) 1Cgn / J, лаборатории Джексона, Бар-Харбор, ME).
- Удалить волосы с груди регионе с помощью машинки для стрижки волос или для удаления химических волос.
- Интубировать с 18 калибр катетера (Becton Dickinson & Co, Франклин озер Нью-Джерси) и место на мышь вентилятором на 120 - 130 вдохов в минуту с инсультом объеме 150 мкл.
- Сделать боковой разрез через четвертом межреберье таким образом производя торакотомии.
- Визуализация сердца, сделать два 25 мкл инъекции трансфицированных суспензии клеток с использованием 1 мл шприц (Temuro Medical Corporation, Сомерсет, штат Нью-Джерси) и 28 иглы (Bectна Дикинсон & Co, Франклин озер Нью-Джерси). Чтобы облегчить intramyocardial впрыска и предотвратить чрезмерное повреждение органа, согните иглу головы ~ 90 градусов.
- После инъекции, используя рассасывающиеся нити (например, Викрил), чтобы закрыть ребра и мышечные слои. Шовный кожи закрыт с помощью 4-0 нейлона или шелка.
- Разрешить мыши, чтобы оправиться от наркоза и экстубации.
- Контрольные группы должны включать Cre мышей, получавших инъекции только средний, Cre мышей, получавших такую же концентрацию untransfected клеток и мышей дикого типа получения трансфицированных клеток (в качестве альтернативы Cre мышей, получавших трансфекции клетки не склонны к предохранитель).
3. Биофотонный изображений
- От пяти до пятнадцати минут, прежде чем изображения, внутрибрюшинно (IP) вводят 10 мкл на грамм мыши массы тела от 15 мг / мл D-люциферин (суппорт Life Sciences, Хопкинтон, Массачусетс).
- Вызвать анестезии на мышах с помощью изофлуран на уровне 4% для индукционныхг 1 - 2% на техническое обслуживание.
- Место мышей спине в области обработки изображений коробки с маской управляющей 1 - 2% изофлуран для поддержания анестезии (Xenogen Биофотонный системы Imaging, Хопкинтон, Массачусетс). Некоторые мыши могут быть отображены одновременно. Изображение фиктивный управления мышью с экспериментальным мышам для легкого сравнения люминесцентного сигнала.
- Использование живой образ программного обеспечения (Xenogen), установить соответствующее время экспозиции (обычно 60 сек, см. результаты). Установить область изображения в соответствии с мышами и сохранить площадь постоянной в течение всего изображения, чтобы предотвратить изменения в чувствительности. Установить предмет высотой в 4,5 см.
- Приобретать интенсивности люминесценции сигнал, соответствующий мыши или мышей в поле зрения и сохранения неизмененных файлов изображений. Обработать изображения, чтобы удалить фон сигнал, соответствующий контроль или unmanipulated мыши. Интенсивность значения выше фона соответствуют плавленого клеток в животных. Интенсивность анализ может быть проведен с использованием живой образ программного обеспечения (Xenogen) или с открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа изображений. Тypically, область интереса (ROI) выбран для сравнения интенсивности данных между животными и экспериментов.
4. Представитель Результаты
Для определения чувствительности Xenogen Биофотонный системы Imaging, клеточная линия которого конститутивно выражает люциферазы (231-LUC-D3H1, Xenogen) был доставлен в миокарде C57/Bl6 мышей (Jackson Laboratory). Клетки вводили в концентрации 1 х 10 6, 1 х 10 3, или 1 х 10 1 клеток. Через шесть часов после доставки ячейки, мышам вводили внутрибрюшинно люциферин и отображаемого использованием Xenogen системы. Определенный сигнал могут быть обнаружены с 1000 клеток (2 из 6 мышей отображаемого, Рисунок 2), но обнаружение была более надежной с 10000 клеток (6 из 6 мышей отображаемого). Важно, что это исследование также призван способствовать налаживанию грубая корреляция между числом люциферазы экспрессирующих клеток и интенсивности сигнала.
Cre экспрессией мышей. Примерно через неделю после доставки ячейки, мыши были впервые отображаемого использованием Xenogen системы без D-люциферин инъекции. Как и ожидалось, без ферментативной субстрата, интенсивность сигнала не было обнаружено (рис. 3). Затем, D-люциферин вводили внутрибрюшинно и сигнал, соответствующий люциферазы интенсивности и, следовательно, слияние клеток был обнаружен в двух из четырех мышей испытания. Аналогичный сигнал был обнаружен неделю спустя (рис. 3), предполагая, MSC-связанных продуктов плавления может быть сохранен в естественных условиях. В этом случае исследование было прекращено, чтобы учесть оценку сердце и окружающие ткани, но можно представить себе долгосрочные анализы и более частые изображения отслеживать техническое обслуживание, распространениег, возможно, миграции продуктов синтеза в организме мышей.
Рисунок 1. Схема Техника для обнаружения слияния клеток в живом организме. Если слияние Cre-экспрессирующих клеток мыши и пересадили клетки, экспрессирующие плазмиды floxed люциферазы происходит, люциферазы выражена не будет. Люциферазы могут быть обнаружены путем введения ферментативной подложки, D-люциферин, в мыши, а затем изображение мыши, используя Xenogen Биофотонный-изображений (Адаптировано из 19)
Рисунок 2. Чувствительность обнаружения люциферазы-экспрессирующих клеток в сердечной ткани с Биофотонный изображений. Клеточная линия которого конститутивно выражает люциферазы (231-LUC-D3H1, Xenogen) был доставлен в intramyocardial пространство C57/Bl6 мышей на различных общего количества клеток. Представитель изображения мышей повторноприемной 1 х 10 6, 1 х 10 3 и 1 х 10 1 клеток (слева направо) отображаются, работы с изображениями было проведено около 6 часов после инъекции.
Рисунок 3. Количественная В Vivo Люминесценция Свидетельством слияния клеток. МСК были трансфицированных LoxP-Stop-LoxP-люциферазы плазмиды и доставлены в миокарде Cre экспрессией мышей. Примерно неделю и через две недели после доставки ячейки, Cre мышей были обследованы использованием Xenogen Биофотонный Система визуализации для измерения интенсивности люминесценции указывает на слияние клеток. (А) Наложение фотографии и интенсивность свечения притворство и мышей 1-4 (слева направо) через 17 дней после доставки ячейки. (В) Интенсивность свечения притворство и мышей 1-4 (слева направо) через 17 дней после доставки ячейки. Интересующей нас области был выбран (желтый), соответствующие места инъекции и интенсивность лevels определяли с помощью ImageJ (бесплатный источник) программного обеспечения 20. (C) Интенсивность свечения была нормализована к той же области интереса на фиктивный мыши для всех экспериментальных условиях. На одну неделю, мышей 3 и 4 показало положительный сигнал люминесценции свидетельствует спонтанные слияния клетка мыши и трансплантированных МСК. Сигнал упорно мыши 3 на две недели. Для определения конкретных органов локализации сигнала, соответствующего мыши 3, грудной полости, был разоблачен и первичные органы вырезали и образ. (D) Наложение фотографии и интенсивность свечения мыши 3. Обратите внимание, локализации интенсивности сигнала в тонком кишечнике. (E) Интенсивность свечения мыши 3. (F) Наложение фотографии и интенсивность свечения фиктивный мыши. (G) Интенсивность свечения фиктивный мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь метод позволяет, в первый раз, дискретные идентификации и временной анализ слияния клеток в организме, в том числе мелких животных. Подход сочетает Cre-LoxP рекомбинации с последующей Биофотонный анализа изображений. Подход поддаются отслеживанию не только клеточного слияния клеток, но и вирус-клеточного слияния и так могли бы оказаться полезными для слежения за вирусными инфекциями. Анализ изображений происходит быстро и можно изображение несколько мелких животных одновременно. Обнаружение плавления ограничен частотой слияния частности партнерами ячейки в соответствующие им микросреды и эффективность трансфекции LoxP-Stop-LoxP-люциферазы плазмиды. Таким образом, оптимальные результаты были бы получены с партнерами слияние содержащих интегрированную форму LoxP-Stop-LoxP-люциферазы последовательности. Кроме того, организмы должны быть стационарными, чтобы изображение и так анестезии требуется для мелких животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Пейман Хеммати (Департамент медицины, Университет Висконсин-Мэдисон) для предоставления щедро H1 МСК, и доктор Тим Хакер, доктор Gouqing песни и г-жа Джилл Кох из университета Висконсина сердечно-сосудистой физиологии Основной фонд для выполнения операции мыши. Работа выполнена при поддержке Национального научного фонда через стипендий Исследование Брайана Фримен и НИЗ R21 HL089679.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 |
References
- Bernirschke, K. K. P. Pathology of the Human Placenta. , Springer. New York. (2000).
- Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).
- Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia. Placenta. 20, 531-539 (1999).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia. Placenta. 21, 597-602 (2000).
- Ogle, B. M. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo. FASEB. J. 18, 548-550 (2004).
- Nygren, J. M. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 10, 494-501 (2004).
- Nygren, J. M. Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion. Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).
- Kutschka, I. Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts. Circulation. 114, I174-I180 (2006).
- Min, J. J. In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium. Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).
- Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice. Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).
- Weir, L. R. Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity. Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).
- Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice. Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).
- Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice. Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).
- Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).
- Zhu, L. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).
- Noiseux, N. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).
- Ajiki, T. Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site. Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).
- Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
