Summary
Een methode om celfusie track in levende organismen na verloop van tijd wordt beschreven. De aanpak maakt gebruik van Cre-
Abstract
Het vermogen van twee of meer cellen van hetzelfde type te fuseren is gebruikt in meercelligen doorheen de evolutie van vele complexe organen, waaronder het skelet spieren, botten en placenta vormen. Hedendaagse studies tonen fusie van cellen van hetzelfde type verleent verbeterde functie. Bijvoorbeeld, wanneer de trofoblast cellen van de placenta zekering te vormen van de syncytiotrophoblast, de syncytiotrophoblast is beter in staat om voedingsstoffen en hormonen in de moeder en foetus barrière dan niet-gefuseerde trophoblasts 1-4 vervoer. Meer recente studies laten zien fusie van cellen van verschillende types kunnen lot van de cel direct. De 'terugkeer' of wijziging van lot van de cel door een fusie werd ooit gedacht worden beperkt tot celkweek systemen. Maar de komst van de stamceltransplantatie geleid tot de ontdekking door ons en anderen die stamcellen kunnen met somatische cellen zekering in vivo en dat fusie vergemakkelijkt stamcellen differentiatie 5-7. Zo, celfusie is een gereguleerd proces capable van de bevordering van cel overleving en differentiatie en dus kan worden van essentieel belang voor de ontwikkeling, het herstel van weefsels en zelfs de pathogenese van de ziekte.
Het beperken van de studie van de cel fusie, is het gebrek aan geschikte technologie 1) nauwkeurig te identificeren fusie producten en 2) volgen fusie-producten in de tijd. Hier presenteren we een nieuwe benadering voor zowel de beperkingen aan te pakken via inductie van bioluminescentie bij fusie (figuur 1);. Bioluminescentie kan worden gedetecteerd met een hoge gevoeligheid in vivo 8-15 We maken gebruik van een construct dat codeert voor de vuurvlieg luciferase (Photinus pyralis) gen geplaatst grenzend aan een stopcodon geflankeerd door loxP sequenties. Bij de cellen die dit gen fuseren met cellen die het Cre recombinase eiwit, de loxP sites zijn gesplitst en het stopsignaal wordt weggesneden waardoor de transcriptie van luciferase. Omdat het signaal is induciBLE, de incidentie van vals-positieve signalen is zeer laag. In tegenstelling tot bestaande methoden die het Cre / loxP systeem 16, 17 gebruiken, hebben wij opgenomen een "levend" detectiesignaal en daarmee betalen voor de eerste keer de kans om de kinetiek van celfusie track in vivo.
Om aan te tonen van de aanpak, muizen alom uiten van Cre-recombinase diende als ontvangers van stamcellen getransfecteerd met een luciferase te bouwen om stroomafwaarts van een floxed stopcodon uit te drukken. Stamcellen werden getransplanteerd via intramyocardial injectie en na transplantatie intravitale beeldanalyse werd uitgevoerd om de aanwezigheid van spoor fusie producten in het hart en de omliggende weefsels in de tijd. Deze aanpak kan worden aangepast aan de celfusie te analyseren in elk weefseltype in elk stadium van ontwikkeling, ziekte of volwassen weefsel te herstellen.
Protocol
1. Donor celtransfectie
- Oogst mesenchymale stamcellen (MSC's, afgeleid van H1 embryonale stamcellen gedoneerd door Dr Peiman Hematti, als alternatief, elk celtype van elke soort hypothese te fuseren in vivo kunnen worden gebruikt) bij 70 - 80% samenvloeiing met 1X trypsine (Mediatech, Manassas VA) gedurende 5 minuten. Inactiveer trypsine met α-MEM compleet medium (antibiotica vrij, Invitrogen, Carlsbad CA) 18. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten.
- Zorgvuldig aspireren supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml 1X PBS en te tellen cellen met behulp van een hemacytometer.
- Transfer 1.5 x 10 6 cellen om een 1,5 ml centrifugebuis. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten.
- Zorgvuldig aspireren supernatant. Resuspendeer pellet in 300 ui van R Buffer (Neon Transfectie System, Invitrogen) en 6 ug (2 ug / 5,0 x 10 5 cellen) van de p231 pCMVe-betaAc-STOP-luc (Addgene, Cambridge, MA). Plaats 3 mL van E Buffer (InvitrOgen) in de elektroporatie docking port per protocol van de fabrikant (Neon Transfectie System, Invitrogen).
- Transfer cel-plasmide oplossing voor een 100 ul Neon pipet en electroporate met een pulsduur van 20 ms en een omvang van 1500 volt. Plaats geëlektroporeerd cellen in een 15 ml conische buis met 9,7 ml α-MEM compleet medium.
- Herhaal stap 1.5 nog twee keer en het zwembad getransfecteerde cellen tot een totaal volume van 10 ml te verkrijgen. Voeg de 10 ml celsuspensie (1,5 x 10 6 cellen) om een T175 fles met 10 ml α-MEM compleet medium. Levensvatbaarheid van de cellen na elektroporatie is ongeveer 30%, tot een opbrengst van circa 4,5 x 10 5 levensvatbare cellen per T175.
- Verandering α-MEM complete medium 24 uur na transfectie.
- Oogst getransfecteerde cellen bij 70 - 80% samenvloeiing (~ 2 - 3 dagen na elektroporatie). Voer celgetal met behulp van een hemacytometer en resuspendeer de cellen bij een concentratie van 1,0 x 10 6cells/50 ul van α-MEM compleet medium. Minimaliseren van de tijd door te brengen cellen in suspensie tot celdood alvorens terug te brengen tot injectie.
2. Intramyocardial Injectie
- Induceren verdoving door isofluraan (Phoenix Pharmaceuticals, Inc, St. Joseph, MO) van transgene muizen ontwikkeld om constitutief te uiten Cre recombinase in elke cel (B6.C-Tg (CMV-CRE) 1Cgn / J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME).
- Verwijder het haar van de borst regio met behulp van tondeuses of chemische hair remover.
- Intuberen met een 18 gauge katheter (Becton Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ) en leg ze op de muis ventilator op 120 tot 130 ademhalingen per minuut, met een slagvolume van 150 ul.
- Maak laterale incisie in de vierde intercostale ruimte waardoor een thoracotomie.
- Visualiseren van het hart, maken twee 25 pi injecties van getransfecteerde cel suspensie op met een 1 ml spuit (Temuro Medical Corporation, Somerset, NJ) en 28 gauge naald (Bectop Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ). Om het gemak van de intramyocardial injectie en het voorkomen van overmatige schade aan het orgaan, buig de naald kop ~ 90 graden.
- Na de injectie, gebruik van resorbeerbare hechtingen (bijvoorbeeld Vicryl) aan de ribben en de spieren lagen te sluiten. Hechtdraad de huid gesloten met 4-0 nylon of zijde.
- Laat de muis om te herstellen van anesthesie en extuberen.
- Controlegroep moet Cre muizen die medium injecties alleen, Cre muizen die dezelfde concentratie van ongetransfecteerde cellen en wild-type muizen die getransfecteerde cellen (als alternatief, Cre muizen die getransfecteerde cellen niet gevoelig voor zekering).
3. Biophotonic Imaging
- Vijf tot vijftien minuten voor beeldvorming, intraperitoneaal (IP) injecteren 10 pi per gram van de muis lichaamsgewicht van 15 mg / ml D-Luciferine (Remklauw Life Sciences, Hopkinton, MA).
- Veroorzaken anesthesie op muizen via isofluraan op 4% voor inductie eend 1 - 2% voor onderhoud.
- Plaats muizen liggende in de beeldvorming doos met gezichtsmasker toedienen van 1 - 2% isofluraan voor onderhoud anesthesie (Xenogen Biophotonic Imaging System, Hopkinton, MA). Meerdere muizen kunnen gelijktijdig worden afgebeeld. Afbeelding sham control muis met experimentele muizen voor een eenvoudige vergelijking van de chemiluminescentie-signaal.
- Met behulp van Living Image software (Xenogen), stel de juiste belichting tijd (meestal 60 sec, zie resultaten). Set gebied van het beeld aan muizen fit en houd gebied consequent door beeldvorming op veranderingen in de gevoeligheid te voorkomen. Zet onderwerp hoogte van 4,5 cm.
- Verwerven luminescentie-intensiteit signaal dat overeenkomt met de muis of muizen binnen het zicht veld en op te slaan ongewijzigde beeldbestanden. Beelden verwerken op de achtergrond signaal overeenkomt met een controle of ongemanipuleerde muis te verwijderen. Intensiteit waarden boven achtergrond komen overeen met gefuseerde cellen in het dier. Intensiteit analyse kan worden uitgevoerd met behulp van Living Image software (Xenogen) of open source software voor beeldanalyse. Typically, een regio van belang (ROI) is geselecteerd om de intensiteit gegevens te vergelijken tussen dieren en experimenten.
4. Representatieve resultaten
Voor het bepalen van de gevoeligheid van de Xenogen Biophotonic Imaging System, een cellijn, die constitutief uitdrukt luciferase (231-LUC-D3H1, Xenogen) werd geleverd aan het myocard van C57/Bl6 muizen (Jackson Laboratory). Cellen werden ingespoten bij concentraties van 1 x 10 6, 1 x 10 3, of 1 x 10 1-cellen. Zes uur na de levering cel, werden de muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met luciferine en beeld gebracht met behulp van de Xenogen systeem. Een specifiek signaal kon worden gedetecteerd met 1.000 cellen (2 van 6 muizen afgebeeld, figuur 2), maar detectie werd betrouwbaarder met 10.000 cellen (6 van 6 muizen afgebeeld). Belangrijk is dat dit onderzoek diende ook om een ruwe correlatie tussen het aantal luciferase-expressie cellen en intensiteit van het signaal vast te stellen.
Cre-expressie muizen. Ongeveer een week na de levering cel, werden de muizen eerste beeld gebracht met behulp van de Xenogen systeem zonder D-luciferine injectie. Zoals verwacht, zonder dat de enzymatische substraat, was er geen intensiteit signaal wordt gedetecteerd (Figuur 3). Vervolgens werd D-luciferine intraperitoneaal geïnjecteerd en een signaal dat overeenkomt met luciferase steunintensiteit en dus celfusie werd aangetroffen in twee van de vier geteste muizen. Een soortgelijk signaal was gedetecteerd een week later (figuur 3), wat suggereert MSC-gekoppelde fusie producten kunnen worden gehandhaafd in vivo. In dit geval, de studie werd beëindigd om voor de evaluatie van het hart en het omringende weefsel, maar men kon Envision op langere termijn analyses en vaker beeldvorming om het onderhoud, de proliferatie spoor eend misschien migratie van fusie-producten in muizen.
Figuur 1. Schematische voorstelling van Technique to Cell Fusion detecteren in vivo. Als fusie tussen Cre expressie muis cellen en getransplanteerde cellen die een floxed luciferase plasmide optreedt, luciferase wordt uitgedrukt. Luciferase kan worden gedetecteerd door het injecteren van de enzymatische substraat, D-luciferine, in de muis en vervolgens beeldvorming van de muis met behulp van een Xenogen Biophotonic Imaging System (Aangepast uit 19)
Figuur 2. Gevoeligheid van detectie van luciferase-expressie cellen in hartweefsel met biofotonische beeldvorming. Een cel lijn die constitutief uitdrukt luciferase (231-LUC-D3H1, Xenogen) werd geleverd aan de intramyocardial ruimte van C57/Bl6 muizen op verschillende totale cel nummers. Representatieve beelden van muizen receiving 1 x 10 6, 1 x 10 3 en 1 x 10 1 cellen (van links naar rechts) worden weergegeven, werd de beeldvorming uitgevoerd ongeveer 6 uur na de injectie.
Figuur 3. Kwantificering van in vivo Luminescentie Indicatieve van Cell Fusion. MSC's werden getransfecteerd met de loxP-Stop-loxP-Luciferase plasmide en geleverd aan de hartspier van Cre-expressie muizen. Ongeveer een week en twee weken na aflevering cel, werden Cre muizen beeld gebracht met behulp van de Xenogen Biophotonic Imaging Systeem om de intensiteit van de luminescentie indicatie van celfusie te meten. (A) Overlay van de foto en de intensiteit van de luminescentie van sham en muizen 1-4 (van links naar rechts) 17 dagen na aflevering cel. (B) intensiteit van luminescentie van sham en muizen 1-4 (van links naar rechts) 17 dagen na aflevering cel. Een regio van belang werd geselecteerd (geel) die overeenkomt met de plaats van injectie en intensiteit levels werden bepaald met behulp van ImageJ (gratis source) software 20. (C) intensiteit van de luminescentie werd genormaliseerd tot dezelfde regio van de rente op sham muis voor alle experimentele condities. Op een week, muizen 3 en 4 toonde een positieve luminescentiesignaal suggereert spontane fusie van een muis getransplanteerd cel en MSC. Het signaal bleef in de muis 3 op twee weken. Voor het bepalen van orgaan-specifieke lokalisatie van het signaal dat overeenkomt met de muis 3, was de borstholte blootgesteld en primaire organen uitgesneden en afgebeeld. (D) Overlay van de foto en de intensiteit van de luminescentie van muis 3. Let op lokalisatie van intensiteit signaal in de dunne darm. (E) intensiteit van de luminescentie van muis 3. (F) Overlay van de foto en de intensiteit van de luminescentie van sham muis. (G) intensiteit van luminescentie van sham muis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode die hier beschreven staat, voor de eerste keer, discrete identificatie en temporele analyse van de celfusie in organismen, met inbegrip van kleine dieren. De aanpak combineert Cre-loxP recombinatie met daaropvolgend biofotonische beeldanalyse. De aanpak is vatbaar voor het bijhouden van niet alleen de cel-cel fusie, maar ook virus-cel fusie en zo kan nuttig zijn voor het bijhouden van virale infecties. Beeldanalyse is snel en het is mogelijk om de afbeelding meerdere kleine dieren tegelijk. Detectie van fusie wordt beperkt door de frequentie van de fusie van bepaalde cel partners in hun overeenkomstige micro-omgevingen en door de efficiëntie van transfectie van de loxP-Stop-loxP-Luciferase plasmide. Zo zou optimale resultaten worden verkregen met de fusiepartners met een geïntegreerde vorm van de loxP-Stop-loxP-Luciferase volgorde. Daarnaast moet de organismen stationaire om beeld en zo anesthesie noodzakelijk is voor kleine dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr Peiman Hemmati (Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison) bedanken voor ruim het verstrekken van de H1 MSC's, en Dr Tim Hacker, Dr Gouqing Song en mevrouw Jill Koch van de Universiteit van Wisconsin Cardiovasculaire Fysiologie Core Faciliteit voor het uitvoeren van de muis operaties. Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation door middel van een Graduate Research Fellowship aan Brian Freeman en NIH R21 HL089679.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 |
References
- Bernirschke, K. K. P. Pathology of the Human Placenta. , Springer. New York. (2000).
- Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).
- Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia. Placenta. 20, 531-539 (1999).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia. Placenta. 21, 597-602 (2000).
- Ogle, B. M. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo. FASEB. J. 18, 548-550 (2004).
- Nygren, J. M. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 10, 494-501 (2004).
- Nygren, J. M. Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion. Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).
- Kutschka, I. Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts. Circulation. 114, I174-I180 (2006).
- Min, J. J. In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium. Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).
- Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice. Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).
- Weir, L. R. Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity. Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).
- Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice. Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).
- Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice. Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).
- Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).
- Zhu, L. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).
- Noiseux, N. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).
- Ajiki, T. Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site. Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).
- Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
