Summary
En metode til at spore celle fusion i levende organismer over tid er beskrevet. Den fremgangsmåde benytter Cre-
Abstract
Muligheden af to eller flere celler af samme type til at smelte er blevet udnyttet i metazoans hele evolutionen til at danne mange komplekse organer, herunder skelet muskler, knogler og moderkage. Moderne undersøgelser viser sammensmeltning af celler af samme type, giver forbedret funktion. For eksempel, når trofoblast cellerne i moderkagen sikringen til at danne syncytiotrophoblast den syncytiotrophoblast er bedre i stand til at transportere næringsstoffer og hormoner på tværs af maternel-føtal barriere end kondenseret trophoblasts 1-4. Nyere undersøgelser viser, sammensmeltning af celler af forskellige typer kan direkte celle skæbne. Den "reversion" eller ændring af celle skæbne ved fusion blev engang anset for at være begrænset til cellekultur systemer. Men fremkomsten af stamcelletransplantation førte til opdagelsen af os og andre, at stamceller kan smelte sammen med somatiske celler in vivo, og at fusion letter stamceller differentiering 5-7. Således Cellefusion er et reguleret proces, capable fremme cellernes overlevelse og differentiering og dermed kan være af central betydning for udvikling, reparation af væv og endda patogenesen af sygdommen.
Begrænsning studiet af cellen fusion, er mangel på passende teknologi, der 1) præcist at identificere fusion produkter og til 2) track fusion produkter over tid. Her præsenterer vi en ny tilgang til at løse både begrænsninger via induktion af bioluminescens på fusion (figur 1);. Bioluminescens kan detekteres med høj følsomhed in vivo 8-15 Vi benytter en konstruktion indkodning af ildflue luciferase (Photinus pyralis) genet placeret ved siden af et stop codon flankeret af LoxP sekvenser. Når celler, der udtrykker dette gen sikring med celler, der udtrykker Cre recombinase protein, er de LoxP steder kløvet og stop signalet er fjernet så transskription af luciferase. Fordi signalet er induciBLE, forekomsten af falsk-positive signaler er meget lav. I modsætning til eksisterende metoder, som udnytter Cre / LoxP-system 16, 17, har vi indarbejdet et "levende" afsløring signal og dermed har råd til for første gang mulighed for at spore kinetik cellefusions in vivo.
For at demonstrere den tilgang, mus allestedsnærværende udtrykker Cre recombinase tjente som modtagere af stamceller transficeret med en konstruktion til at udtrykke luciferase nedstrøms en floxed stopper codon. Stamceller er blevet transplanteret via intramyocardial injektion og efter transplantationen intravital billede analyse blev udført for at spore tilstedeværelsen af fusion produkter i hjertet og det omgivende væv over tid. Denne strategi kunne tilpasses til at analysere cellefusions i enhver vævstype på ethvert udviklingstrin, sygdom eller voksent væv reparation.
Protocol
1. Donor Cell transfektion
- Harvest mesenchymale stamceller (MSC, der stammer fra H1 embryonale stamceller, venligst doneret af Dr. Peiman Hematti, alternativt kan enhver celle type af enhver art hypotese at sammensmelte in vivo være ansat), når 70 til 80% sammenflydende med 1X trypsin (Mediatech, Manassas VA) i 5 min. inaktivere trypsin med α-MEM komplette medium (antibiotika gratis, Invitrogen, Carlsbad CA) 18. Centrifuger ved 300 xgi 5 min.
- Omhyggeligt aspirer supernatant og resuspender pellet i 1 ml 1X PBS og tælle celler ved hjælp af en hemacytometer.
- Overfør 1,5 x 10 6 celler til et 1,5 mL centrifugerør. Centrifuger ved 300 xgi 5 min.
- Omhyggeligt aspirer supernatant. Resuspender pellet i 300 μL af R Buffer (Neon transfektion System, Invitrogen) og 6 mikrogram (2 mg / 5,0 x 10 5 celler) af p231 pCMVe-betaAc-STOP-Luc (Addgene, Cambridge, MA). Anbringes 3 ml E Buffer (Invitrogen) ind i elektroporation docking port pr producentens protokol (Neon transfektion System, Invitrogen).
- Overførsel celle-plasmid-løsning til en 100 μL Neon pipette spids og electroporate med en impulsvarighed på 20 ms og en størrelse på 1500 volt. Placer electroporated celler i en 15 ml konisk rør, der indeholder 9,7 ml α-MEM komplette medium.
- Gentag trin 1,5 yderligere to gange og pool transfekterede celler til at give en samlet volumen på 10 ml. Tilsæt 10 mL cellesuspensionen (1,5 x 10 6 celler) til en T175 kolbe, som indeholder 10 mL α-MEM komplette medium. Cellernes levedygtighed efter elektroporation er ca 30%, til at give ca 4,5 x 10 5 levedygtige celler pr T175.
- Skift α-MEM komplette medium 24 timer efter transfektion.
- Harvest transfekterede celler, når 70 til 80% sammenflydende (~ 2 - 3 dage efter elektroporation). Udfør celletallet ved hjælp af en hemacytometer og udeluk cellerne ved en koncentration på 1,0 x 10 6cells/50 μL af α-MEM komplette medium. Minimer tid celler tilbringer i suspension at reducere celledød før injektion.
2. Intramyocardial Injection
- Inducere anæstesi ved isofluran (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., St. Joseph, MO) om transgene mus manipuleret til at konstitutivt udtrykker Cre recombinase i hver celle (B6.C-Tg (CMV-CRE) 1Cgn / J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME).
- Fjerne hår fra brystregionen bruge hårklippemaskiner eller kemisk hår remover.
- Intubere med en 18 gauge kateter (Becton Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ) og sted på musen ventilator på 120 til 130 åndedrag per minut med en slagvolumen på 150 μL.
- Gør lateral snit på tværs af den fjerde interkostale mellemrum og derved producere en torakotomi.
- Visualisere hjertet, to 25 μL injektioner af transficeret cellesuspension med en 1 mL sprøjte (Temuro Medical Corporation, Somerset, NJ) og 28 gauge kanyle (Bect gøreom Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ). For at lette intramyocardial indsprøjtning og forhindre for store skader på orglet, bøje nålen hovedet ~ 90 grader.
- Efter injektion, absorberbare suturer (f.eks vicryl) bruger til at lukke ribben og muskler lag. Sutur huden lukkes med 4-0 nylon eller silke.
- Lad musen til at komme sig efter anæstesi og extubate.
- Kontrol grupper bør omfatte Cre mus, der fik medium injektioner kun, Cre mus, der fik den samme koncentration af untransfected celler og vild-type mus, der fik transfekterede celler (alternativt, Cre mus, der fik transfekterede celler ikke tilbøjelige til at smelte).
3. Biophotonic Imaging
- Fem til femten minutter før billedbehandling, intraperitonealt (IP) injicere 10 μL pr gram musen kropsvægt på 15 mg / ml D-Luciferin (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
- Inducere anæstesi på mus via isofluran på 4% til induktion end 1 - 2% for vedligeholdelse.
- Placer mus liggende i billedbehandling æske med ansigtsmaske administrere 1 - 2% isofluran til vedligeholdelse af anæstesi (Xenogen Biophotonic Imaging System, Hopkinton, MA). Flere mus kan være afbildet samtidigt. Billede humbug styre musen med eksperimenterende mus til nem sammenligning af selvlysende signal.
- Brug Living Billede software (Xenogen), der passende eksponeringstid (typisk 60 sek, se resultater). Sæt område af billedet til at passe mus og holde området konsekvent i hele billedbehandling for at forhindre ændringer i følsomhed. Sæt emne højde på 4,5 cm.
- Erhverve luminescens intensitet signal, der svarer til mus eller mus i feltet Visning og gemme umodificeret billedfiler. Behandle billeder til at fjerne baggrunden signal, der svarer til et kontrolelement eller umanipulerede mus. Intensitet værdier over baggrunden svarer til smeltet celler i dyret. Intensitet analyse kan udføres med Living Billede software (Xenogen) eller open source billede analyse software. Typically, en region of interest (ROI) er valgt at sammenligne intensiteten af data mellem dyr og eksperimenter.
4. Repræsentative resultater
For at bestemme følsomheden af de Xenogen Biophotonic Imaging System, en cellelinie, der konstitutivt udtrykker luciferase (231-Luc-D3H1, Xenogen) blev leveret til myokardiet af C57/Bl6 mus (Jackson Laboratory). Cellerne blev injiceret ved koncentrationer på 1 x 10 6, 1 x 10 3, eller 1 x 10 1 celler. Seks timer efter celle levering, blev mus injiceret intraperitonealt med luciferin og filmede med de Xenogen systemet. Et specifikt signal kunne detekteres med 1.000 celler (2 af 6 mus afbildet, figur 2), men detektion var mere pålidelig med 10.000 celler (6 af 6 mus afbildet). Vigtigere er det, denne undersøgelse også tjent til at etablere en grov korrelation mellem antallet af luciferase-udtrykkende celler og signal intensitet.
Cre-udtrykkende mus. Omkring en uge efter celle levering, blev mus first filmede med de Xenogen systemet uden D-luciferin injektion. Som forventet, uden at den enzymatiske substrat, var ingen intensitet signal modtages (Figur 3). Dernæst var D-luciferin injiceret intraperitonealt og et signal svarende til luciferase intensitet og dermed cellefusions blev påvist i to af fire testede mus. En lignende signal blev fundet en uge senere (Figur 3), hvilket tyder på MSC-koblede fusion produkter kan opretholdes in vivo. I dette tilfælde, blev undersøgelsen afsluttet at give mulighed for vurdering af hjerte og omgivende væv, men man kunne forestille sig på længere sigt analyser og hyppigere billedbehandling til at spore vedligeholdelse, spredningen end måske migration af fusion produkter i mus.
Figur 1. Skematisk af teknik til at Detect Cell Fusion in vivo. Hvis fusion mellem Cre-udtrykkende muse celler og transplanterede celler, der udtrykker en floxed luciferase plasmid opstår, vil luciferase komme til udtryk. Luciferase kan påvises ved at indsprøjte enzymatiske substrat, D-luciferin, ind i musen, og derefter billedbehandling musen ved hjælp af en Xenogen Biophotonic Imaging System (Tilpasset fra 19)
Figur 2. Følsomhed påvisning af luciferase-udtrykkende celler i hjertets væv med BioPhotonic billeddannelse. En celle linje, som konstitutivt udtrykker luciferase (231-Luc-D3H1, Xenogen) blev leveret til intramyocardial rum C57/Bl6 mus på forskellige alt celle numre. Repræsentant billeder af mus receiving 1 x 10 6, 1 x 10 3 og 1 x 10 1 celler (fra venstre mod højre) er vist, blev scanning gennemført ca 6 timer efter injektion.
Figur 3. Kvantificering af in vivo Luminescence Vejledende af Cell Fusion. MSC blev tilført de LoxP-Stop-LoxP-luciferase plasmid og leveret til myokardiet af Cre-udtrykkende mus. Cirka en uge og to uger efter celle levering, blev Cre mus filmede med de Xenogen Biophotonic Imaging System til at måle intensiteten af luminescens vejledende for celle fusion. (A) Overlay for fotografi og intensiteten af luminescens af shampoo og mus 1-4 (venstre mod højre) 17 dage efter celle levering. (B) Intensitet af luminescens af shampoo og mus 1-4 (venstre mod højre) 17 dage efter celle levering. En region af interesse blev valgt (gul) svarende til injektionsstedet og intensitet levels blev bestemt ved hjælp ImageJ (gratis kilde) software 20. (C) Intensitet af luminescens blev normaliseret i forhold til den samme region i renter på falske mus for alle forsøgsbetingelser. På en uge, viste, mus 3 og 4 positive luminescens signal tyder spontane sammensmeltning af en mus celle og transplanterede MSC. Signalet varede i mus 3 på to uger. For at afgøre organ-specifikke lokalisering af det signal, der svarer til musens 3, blev brysthulen udsatte og primære organer, skåret og afbildet. (D) Overlay for fotografi og intensiteten af luminescens af mus 3. Bemærk lokalisering af intensitet signal i tyndtarmen. (E) Intensitet af luminescens af mus 3. (F) Overlay for fotografi og intensiteten af luminescens af falske mus. (G) Intensitet af luminescens af falske mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet her tillader det, for første gang, diskret identifikation og tidsmæssig analyse af cellefusions i organismer, herunder små dyr. Den tilgang kombinerer Cre-LoxP rekombination med efterfølgende BioPhotonic billedanalyse. Den fremgangsmåde er modtagelig for sporing ikke kun celle-celle fusion, men også virus-celle fusion og så kunne vise sig nyttigt til sporing af virusinfektioner. Billede analyse er hurtigt og det er muligt at forestille sig mange små dyr samtidigt. Påvisning af fusion er begrænset af hyppigheden af sammensmeltning af bestemt celle partnere i deres tilsvarende mikromiljøer og ved effektiviteten af transfektion af LoxP-Stop-LoxP-luciferase plasmid. Således ville optimale resultater opnås med fusion partnere, som indeholder en integreret form for LoxP-Stop-LoxP-luciferase sekvens. Desuden skal de organismer være stationære til billede og så anæstesi er nødvendig for smådyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Peiman Hemmati (Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison) for generøst at give H1 MSC, og Dr. Tim Hacker, Dr. Gouqing Song og Ms Jill Koch fra University of Wisconsin Cardiovascular Physiology Core facilitet for at udføre mus operationer. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation gennem en Graduate Research Fellowship til Brian Freeman og NIH R21 HL089679.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 |
References
- Bernirschke, K. K. P. Pathology of the Human Placenta. , Springer. New York. (2000).
- Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).
- Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia. Placenta. 20, 531-539 (1999).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia. Placenta. 21, 597-602 (2000).
- Ogle, B. M. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo. FASEB. J. 18, 548-550 (2004).
- Nygren, J. M. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 10, 494-501 (2004).
- Nygren, J. M. Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion. Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).
- Kutschka, I. Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts. Circulation. 114, I174-I180 (2006).
- Min, J. J. In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium. Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).
- Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice. Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).
- Weir, L. R. Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity. Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).
- Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice. Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).
- Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice. Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).
- Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).
- Zhu, L. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).
- Noiseux, N. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).
- Ajiki, T. Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site. Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).
- Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
