Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En Cre-Lox P Rekombination metoden för detektion av cellfusion In Vivo Published: January 4, 2012 doi: 10.3791/3581
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Biomedical Engineering, Materials Science Program, Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison

Summary

En metod för att spåra Cellfusion i levande organismer över tid beskrivs. Den metod som använder Cre-

Abstract

Förmågan hos två eller flera celler av samma typ att säkringen har använts i metazoans genom evolutionen för att bilda många komplexa organ, inklusive skelettmuskel, ben och moderkakan. Samtida studier visar fusion av celler av samma typ som ger ökad funktion. Till exempel, när trofoblasten cellerna i moderkakan säkring för att bilda syncytiotrophoblast är syncytiotrophoblast bättre kunna transportera näringsämnen och hormoner över moder och foster barriär än icke kondenserad trophoblasts 1-4. Nyare studier visar sammansmältning av celler av olika typer kan direkt cell öde. Den "reversion" eller modifiering av cell öde genom fusion var en gång tänkt att vara begränsad till system cellkultur. Men tillkomsten av stamcellstransplantation ledde till upptäckten av oss och andra som stamceller kan smälta samman med somatiska celler in vivo och att fusion underlättar stamceller differentiering 5-7. Således är Cellfusion en reglerad process Capable främja cellens överlevnad och differentiering och därmed kan vara av central betydelse för utvecklingen, reparation av vävnad och till och med patogenesen av sjukdomar.

Begränsa studien av cellfusion, är bristen på lämplig teknik för att 1) ​​korrekt identifiera fusion produkter och 2) produkter spåra fusion över tiden. Här presenterar vi en ny metod för att behandla både begränsningar via induktion av mareld vid fusion (figur 1). Mareld kan detekteras med hög känslighet in vivo 8-15 Vi använder en konstruktion kodning för Firefly luciferas (Photinus pyralis) gen placeras nära ett stopp kodon flankeras av LoxP sekvenser. När celler som uttrycker denna gen säkring med celler som uttrycker Cre recombinase protein, är de LoxP platser klyvs och stoppsignal är censurerade så att transkription av luciferas. Eftersom signalen induciBLE, är förekomsten av falskt positiva signaler mycket låg. Till skillnad från existerande metoder som utnyttjar Cre / LoxP systemet 16, 17, har vi bildat en "levande" upptäckt signalen och därmed ger för första gången möjlighet att spåra kinetik cellfusion in vivo.

För att visa den metod som serveras möss ubiquitously uttrycka Cre recombinase som mottagare av stamceller transfekterade med en konstruktion för att uttrycka luciferas nedströms en floxed stop kodon. Transplanterades stamceller via intramyocardial injektion och efter transplantation intravital bildanalys utfördes för att spåra förekomsten av fusion produkter i hjärtat och omgivande vävnader över tid. Detta tillvägagångssätt skulle kunna anpassas för att analysera Cellfusion i någon vävnadstyp i något stadium av utveckling, sjukdom eller en vuxen vävnad reparera.

Protocol

1. Donor Cell Transfektion

  1. Harvest mesenkymala stamceller (MSC, som härrör från H1 embryonala stamceller vänligt skänkts av Dr Peiman Hematti, alternativt kan alla celltyper av alla arter hypotes att smälta in vivo användas) när 70 - 80% konfluenta med 1X trypsin (Mediatech, Manassas VA) i 5 min. Inaktivera trypsin med α-MEM komplett medium (antibiotika gratis, Invitrogen, Carlsbad CA) 18. Centrifugera vid 300 xgi 5 minuter.
  2. Försiktigt aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml 1X PBS och räkna celler med hjälp av en hemacytometer.
  3. Överför 1,5 x 10 6 celler till ett 1,5 ml centrifugrör. Centrifugera vid 300 xgi 5 minuter.
  4. Försiktigt aspirera supernatanten. Resuspendera pelleten i 300 mikroliter av R Buffer (Neon Transfektion System, Invitrogen) och 6 mikrogram (2 mikrogram / ​​5,0 x 10 5 celler) för P231 pCMVe-betaAc-STOP-Luc (Addgene, Cambridge, MA). Plats 3 ml E Buffer (InvitrOgen) i elektroporation dockningsport per tillverkarens protokollet (Neon Transfektion System, Invitrogen).
  5. Överföring cell-plasmid lösningen till en 100 mikroliter Neon pipettspetsen och electroporate med en pulslängd på 20 ms och en magnitud på 1500 volt. Placera electroporated celler i ett 15 ml koniskt rör som innehåller 9,7 ml α-MEM komplett medium.
  6. Upprepa steg 1,5 ytterligare två gånger och pool transfekterade celler för att ge en total volym på 10 ml. Tillsätt 10 fjädring ml cell (1,5 x 10 6 celler) till en T175 kolv som innehåller 10 ml α-MEM komplett medium. Cellviabiliteten efter elektroporation är ca 30%, att ge cirka 4,5 x 10 5 livskraftiga celler per T175.
  7. Ändra α-MEM komplett medelhög 24 timmar efter transfektion.
  8. Harvest transfekterade celler när 70 - 80% konfluenta (~ 2 - 3 dagar efter elektroporation). Utför celler med hjälp av en hemacytometer och återsuspendera cellerna vid en koncentration av 1,0 x 10 6cells/50 mikroliter av α-MEM komplett medium. Minimera tiden celler tillbringar i suspension att minska celldöd före injektion.

2. Intramyocardial Injection

  1. Inducera anestesi med isofluran (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., St Joseph, MO) på transgena möss konstruerad för att konstitutivt uttryck Cre recombinase i varje cell (B6.C-Tg (CMV-CRE) 1Cgn / J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME).
  2. Ta bort hår från bröstregionen med hårklippningsmaskiner eller kemisk hår remover.
  3. Intuberas med en 18 gauge kateter (Becton Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ) och lägg på musen respirator på 120 till 130 andetag per minut med en slagvolym på 150 mikroliter.
  4. Gör lateralt snitt över fjärde interkostalrummet vilket skulle skapa en torakotomi.
  5. Visualisera hjärtat, göra två 25 mikroliter injektioner av transfekterade cellsuspension använda en 1 ml spruta (Temuro Medical Corporation, Somerset, NJ) och 28 gauge nål (Bectom Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ). För att underlätta intramyocardial injektionen och förhindra alltför stora skador på organ, böja nålen huvudet ~ 90 grader.
  6. Efter injektionen använder absorberbara suturer (t.ex. vicryl) för att stänga revben och lager muskler. Sutur huden stängas med 4-0 nylon eller silke.
  7. Låt musen för att återhämta sig från anestesi och extubera.
  8. Kontroll grupper bör ingå Cre möss som fick medelhög injektioner endast Cre möss får samma koncentration av untransfected celler och vilda möss typ emot transfekterade celler (alternativt Cre möss som fick transfekterade cellerna inte benägen att säkring).

3. Biophotonic Imaging

  1. Fem till femton minuter innan bildbehandling, intraperitonealt (IP) Injicera 10 mikroliter per gram mus kroppsvikt på 15 mg / ml D-luciferin (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
  2. Inducera anestesi på möss via isofluran på 4% för induktion end 1 - 2% för underhåll.
  3. Placera möss liggande i bildbehandling låda med ansiktsmask administrera 1 - 2% isofluran för underhåll av anestesi (Xenogen Biophotonic Imaging System, Hopkinton, MA). Flera möss kan avbildas samtidigt. Bild bluff kontroll mus med experimentella möss för enkel jämförelse av självlysande signal.
  4. Använda programvara Living Image (Xenogen), fastställa lämpliga exponeringstid (typiskt 60 sek, se Resultat). Ställ område i bilden för att passa möss och hålla området konsekvent i bildbehandling för att förhindra ändringar i känslighet. Ställ ämne höjd på 4,5 cm.
  5. Förvärva signal luminiscens intensitet motsvarande musen eller mössen inom synhåll fältet och spara omodifierade bildfiler. Bearbeta bilder för att ta bort bakgrunden signal som motsvarar en kontroll eller unmanipulated musen. Intensitet värden över bakgrunden motsvarar smält celler i djuret. Intensitet analys kan göras med hjälp av programvara Living Image (Xenogen) eller open source bildanalys mjukvara. Typically, (ROI) ett område av intresse är vald att jämföra intensiteten data mellan djur och experiment.

4. Representativa resultat

För att bestämma känsligheten hos Xenogen Biophotonic Imaging System, en cellinje som konstitutivt uttryck luciferas (231-Luc-D3H1, Xenogen) levererades till hjärtmuskeln av C57/Bl6 möss (Jackson Laboratory). Celler injicerades i koncentrationer på 1 x 10 6, 1 x 10 3, eller 1 x 10 1 celler. Sex timmar efter cell leverans, möss injiceras intraperitonealt med luciferin och avbildas med Xenogen systemet. En särskild signal kunde detekteras med 1000 celler (2 av 6 möss avbildade, figur 2), men upptäckt var mer tillförlitlig med 10.000 celler (6 av 6 möss avbildas). Viktigt tjänade denna studie också att inrätta en grov korrelation mellan antalet luciferas-uttryckande celler och signalstyrka.

Cre-uttryck möss. Ungefär en vecka efter cell leverans, möss first avbildas med den Xenogen systemet utan D-luciferin injektion. Som väntat, utan att den enzymatiska substrat, ingen intensitet signal upptäckt (Figur 3). Därefter var D-luciferin injiceras intraperitonealt och en signal som motsvarar luciferas intensitet och därmed Cellfusion upptäcktes i två av fyra testade möss. En liknande signal upptäcktes en vecka senare (Figur 3), vilket tyder på MSC-kopplade fusion produkter kan upprätthållas in vivo. I detta fall var studien avslutades för att möjliggöra utvärdering av hjärtats och omgivande vävnad, men man kunde föreställa sig längre sikt analyser och mer frekventa bildbehandling för att spåra underhåll, spridning end migration kanske av fusion produkter hos möss.

Figur 1
Figur 1. Schematisk bild av teknik för att upptäcka Cell Fusion in vivo. Om fusion mellan Cre-uttryckande musceller och transplanterade celler som uttrycker en floxed luciferas plasmid inträffar kommer luciferas uttryckas. Luciferas kan upptäckas genom att injicera enzymatiska substrat, D-luciferin, i musen och sedan avbildning musen med hjälp av en Xenogen Biophotonic Imaging System (Från 19)

Figur 2
Figur 2. Känslighet för detektion av luciferas-uttryckande celler i hjärtvävnad med Biophotonic avbildning. En cell linje som konstitutivt uttryck luciferas (231-Luc-D3H1, Xenogen) levererades till intramyocardial utrymme C57/Bl6 möss vid olika totala cell nummer. Bilderna är av möss ärceiving 1 x 10 6, 1 x 10 3 och 1 x 10 1 celler (vänster till höger) visas var bildhantering genomfördes cirka 6 timmar efter injektionen.

Figur 3
Figur 3. Kvantifiering av in vivo Luminescence Vägledande för Cell Fusion. MSC var transfererats med LoxP-Stop-LoxP-luciferas plasmid och levereras till hjärtmuskeln av Cre-uttryck möss. Ungefär en vecka och två veckor efter cell leverans, var Cre möss avbildas med den Xenogen Biophotonic Imaging System för att mäta intensiteten i ljusflöde tecken på cellfusion. (A) överlagring av fotografi och intensitet ljusflöde av falska och möss 1-4 (vänster till höger) 17 dagar efter cell leverans. (B) intensitet ljusflöde av falska och möss 1-4 (vänster till höger) 17 dagar efter cell leverans. En region av intresse valdes (gul) som motsvarar injektionsstället och intensitet levels bestämdes med hjälp av ImageJ (fri källkod) program 20. (C) intensitet luminiscens normaliserades till samma region av ränta på falska mus för alla experimentella förhållanden. På en vecka visade möss 3 och 4 positiva luminiscens signaler tyder på spontan fusion av en mus cell och transplanterade MSC. Signalen envisades med musen 3 på två veckor. För att avgöra organspecifika lokalisering av den signal som motsvarar mus 3 var brösthålan exponerade och primära organen som censurerade och avbildat. (D) överlagring av fotografi och intensitet ljusflöde av mus 3. Notera lokalisering av intensitet signal i tunntarmen. (E) intensitet ljusflöde av mus 3. (F) överlagring av fotografi och intensitet ljusflöde av falska musen. (G) intensitet ljusflöde av falska musen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metod som beskrivs här tillåter för första gången, diskret identifiering och temporal analys av cellfusion i organismer, inklusive små djur. Den metod som kombinerar Cre-LoxP rekombination med efterföljande Biophotonic bildanalys. Tillvägagångssättet är mottaglig för spårning inte bara cell-cell fusion, men även virus-cell fusion och detta kan visa sig användbart för att spåra virusinfektioner. Bildanalys är snabb och det är möjligt att bild flera små djur samtidigt. Upptäckt av fusion begränsas av frekvensen av fusion av viss cell partner i deras motsvarande mikromiljöer och av effektiviteten i transfektion av LoxP-Stop-LoxP-luciferas plasmid. Således skulle ett optimalt resultat uppnås med fusion partner som innehåller en integrerad form av LoxP-Stop-LoxP-luciferas sekvens. Dessutom måste de organismer stå stilla för att bilden och så anestesi krävs för smådjur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr Peiman Hemmati (Institutionen för medicin, University of Wisconsin-Madison) för generöst ge H1 MSC, och Dr Tim Hacker, Dr Gouqing Song och Ms Jill Koch vid University of Wisconsin Kardiovaskulär fysiologi Core Facility för att utföra mus operationer. Detta arbete stöddes av National Science Foundation genom en Graduate Research Fellowship till Brian Freeman och NIH R21 HL089679.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neon Transfection System Invitrogen MPK5000
Neon 100 μL Kit Invitrogen MPK10025 Contains R and E Buffer
a-MEM powder Invitrogen 12000-022
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03
B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J Jackson Laboratory 006054
Trypsin 10X Fisher Scientific MT-25-054-Cl
L-Glutamine Fisher Scientific 25030-081
D-Luciferin Caliper Life Sciences 122796
Xenogen Biophotonic Imaging System Caliper Life Sciences IVIS Spectrum
Sodium Biocarbonate Sigma-Aldrich S6014-500G
Non-essential Amino Acids Invitrogen 11140-050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernirschke, K. K. P. Pathology of the Human Placenta. , Springer. New York. (2000).
  2. Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).
  3. Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia. Placenta. 20, 531-539 (1999).
  4. Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia. Placenta. 21, 597-602 (2000).
  5. Ogle, B. M. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo. FASEB. J. 18, 548-550 (2004).
  6. Nygren, J. M. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 10, 494-501 (2004).
  7. Nygren, J. M. Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion. Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).
  8. Kutschka, I. Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts. Circulation. 114, I174-I180 (2006).
  9. Min, J. J. In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium. Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).
  10. Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice. Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).
  11. Weir, L. R. Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity. Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).
  12. Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice. Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).
  13. Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice. Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).
  14. Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).
  15. Zhu, L. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).
  16. Noiseux, N. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).
  17. Ajiki, T. Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site. Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).
  18. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).
  19. Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).
  20. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).

Tags

Bioteknik Cellfusion stamceller fusogen skapar recombinase Biophotonic bildbehandling cellulär transplantation
En Cre-Lox P Rekombination metoden för detektion av cellfusion<em> In Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sprangers, A. J., Freeman, B. T.,… More

Sprangers, A. J., Freeman, B. T., Kouris, N. A., Ogle, B. M. A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo. J. Vis. Exp. (59), e3581, doi:10.3791/3581 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter