Summary
ووصف طريقة لتعقب الخلية الانصهار في الكائنات الحية على مر الزمن. ويستخدم نهج لجنة المساواة العرقية.
Abstract
وقد استخدمت هذه القدرة من اثنين أو أكثر من الخلايا من نفس النوع على المزج بين التطور في جميع أنحاء metazoans لتشكيل أجهزة معقدة كثيرة ، بما في ذلك الهيكل العظمي والعضلات والعظام والمشيمة. الدراسات المعاصرة تثبت انصهار خلايا من نفس النوع تمنح وظيفة المحسنة. على سبيل المثال ، عندما خلايا الأرومة الغاذية من الصمامات المشيمة لتشكيل الأرومة الغاذية المخلوية ، والأرومة الغاذية المخلوية أقدر على نقل المواد الغذائية والهرمونات عبر حاجز الأم والجنين من غير مدمجة trophoblasts 1-4. المزيد من الدراسات الحديثة تظهر مزيجا من أنواع مختلفة من الخلايا يمكن أن يوجه مصير الخلية. وكان يعتقد مرة واحدة "الارتداد" أو تعديل مصير الخلية التي الانصهار إلى أن تقتصر على أنظمة الثقافة الخلية. بل أدى ظهور زرع الخلايا الجذعية لاكتشاف من قبلنا وغيرها من الجهات التي يمكن أن الخلايا الجذعية تندمج مع الخلايا الجسدية في الجسم الحي والتي تسهل الاندماج تمايز الخلايا الجذعية 5-7. وهكذا ، والانصهار الخلية هو تنظيم عملية جيمكن apable تعزيز بقاء الخلايا والتمايز ، وبالتالي يكون من الأهمية المركزية لإصلاح وتطوير الأنسجة وحتى التسبب في المرض.
الحد من الانصهار دراسة الخلية ، هو الافتقار إلى التكنولوجيا المناسبة ل1) تحديد المنتجات بدقة والانصهار 2) تتبع المنتجات الانصهار مع مرور الوقت. هنا نقدم منهجا جديدا لمعالجة كل القيود عن طريق تحريض تلألؤ بيولوجي على الانصهار (الشكل 1) ؛ ويمكن الكشف عن تلألؤ بيولوجي مع حساسية عالية في الجسم الحي 15/08 ونحن الاستفادة من بناء ترميز luciferase يراعة (Photinus البرالس) وضعت بالقرب من الجين a كودون وقف يحيط بها سلاسل LoxP عند التعبير عن هذه الخلايا بخلايا فتيل الجين التعبير عن بروتين recombinase لجنة المساواة العرقية ، والمشقوق المواقع LoxP ورفعه إشارة تكف عن السماح النسخ من luciferase. لأن الإشارة induciبلي ، من حدوث إشارات إيجابية كاذبة منخفض جدا. على عكس الطرق الحالية التي تستخدم نظام لجنة المساواة العرقية / LoxP 16 ، 17 ، أدخلنا إشارة "حية" الكشف وبالتالي تحمل للمرة الأولى الفرصة لتتبع حركية الانصهار خلية في الجسم الحي.
للتدليل على النهج ، معربا عن الفئران بتواجد مطلق لجنة المساواة العرقية recombinase بمثابة المستفيدين من الخلايا الجذعية transfected مع بناء للتعبير عن المصب luciferase من كودون وقف floxed. تم زرع الخلايا الجذعية عن طريق الحقن intramyocardial وبعد إجراء زرع تحليل الصور intravital لتتبع وجود المنتجات الانصهار في القلب والأنسجة المحيطة بها على مر الزمن. ويمكن تكييف هذا النهج لتحليل خلايا الانصهار في أي نوع النسيج في أي مرحلة من مراحل المرض ، وتطوير أو إصلاح الأنسجة الكبار.
Protocol
1. خلية المانحة ترنسفكأيشن
- حصاد الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCS ، والمستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية H1 التكرم تبرعت من قبل الدكتور بيمان Hematti ؛ بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أي نوع من الخلايا من أي نوع الافتراض على المزج في الجسم الحي) عند 70-80 ٪ متموجة مع التربسين 1X (Mediatech ، ماناساس VA) لمدة 5 دقائق. تعطيل التربسين مع α - MEM المتوسطة كاملة (مجانا المضادات الحيوية ، Invitrogen ، كارلسباد كاليفورنيا) 18. الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح بعناية وطاف بيليه اعادة تعليق في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- نقل 1.5 × 10 6 خلايا لأنبوب الطرد المركزي مل 1.5. الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف بعناية. Resuspend بيليه في 300 ميليلتر من الاحتياطي R (النيون نظام ترنسفكأيشن ، Invitrogen) و 6 ميكروغرام (2 ميكروغرام / 5.0 × 10 5 خلايا) من p231 - pCMVe betaAc توقف لوك (Addgene ، كامبريدج ، MA). 3 مل من مكان مؤقت E (Invitrogen) في ميناء لرسو السفن في electroporation بروتوكول الصانع (نظام ترنسفكأيشن النيون ، Invitrogen).
- نقل الخلايا البلازميد حل ل100 ميكرولتر نيون طرف الماصة وelectroporate مع مدة نبضة من 20 مللي وقوته من 1500 فولت. electroporated مكان الخلايا المخروطية في أنبوب 15 مل تحتوي على 9.7 مل α - MEM المتوسطة كاملة.
- كرر الخطوة 1،5 مرتين إضافية وتجمع الخلايا transfected لانتاج وحدة تخزين ما مجموعه 10 مل. إضافة خلية 10 مل تعليق (1.5 × 10 6 خلايا) إلى قارورة تحتوي على 10 مل T175 α - MEM المتوسطة كاملة. بقاء الخلية بعد electroporation ما يقرب من 30 ٪ ، والعائد حوالي 4.5 × 10 5 خلايا قابلة للحياة في T175.
- تغيير α - MEM الكامل المتوسطة 24 ساعة التالية ترنسفكأيشن.
- transfected حصاد الخلايا عند 70-80 ٪ متموجة (~ 2 -- 3 أيام بعد electroporation). تنفيذ عدد خلايا باستخدام عدادة الكريات وresuspend الخلايا بتركيز 1.0 × 10 6cells/50 ميكرولتر من α - MEM المتوسطة كاملة. خلايا تقليل الوقت تقضيه في تعليق للحد من موت الخلايا قبل الحقن.
2. Intramyocardial حقن
- تحريض التخدير بواسطة isoflurane (فينيكس صيدلة ، وشركة ، القديس يوسف ، MO) على الفئران المعدلة وراثيا هندسيا لجنة المساواة العرقية constitutively recombinase صريح في كل خلية (B6.C - TG (CMV - لجنة المساواة العرقية) 1Cgn / J ، مختبر جاكسون ، بار هاربور ، ME).
- إزالة الشعر من منطقة الصدر باستخدام آلات قص الشعر أو كيميائية مزيل الشعر.
- Intubate مع القسطرة قياس 18 (بيكتون ديكنسون وشركاه ، وفرانكلين البحيرات نيو جيرسي) ووضعت على جهاز التنفس الصناعي في الماوس 120-130 الأنفاس في الدقيقة الواحدة مع حجم المخ من 150 ميكروليتر.
- جعل شق الوحشي عبر الفضاء الوربي fourth بالتالي إنتاج بضع الصدر.
- تصور القلب ، وتجعل منهما 25 ميكرولتر من حقن الخلايا تعليق transfected باستخدام حقنة 1 مل (Temuro الطبية مؤسسة ، سومرست ، نيو جيرسي) و 28 إبرة قياس (Bectعلى ديكنسون وشركاه ، وفرانكلين البحيرات نيوجيرسي). لتخفيف الحقن intramyocardial ومنع الضرر المفرط للهيئة ، ينحني الرأس إبرة ~ 90 درجة.
- بعد الحقن ، واستخدام الخيوط الجراحية القابلة للامتصاص (مثل vicryl) لإغلاق الأضلاع وطبقات العضلات. مغلق خياطة الجلد باستخدام النايلون أو الحرير 4-0.
- تسمح الماوس للتعافي من التخدير وينزع الأنبوب.
- وينبغي أن تشمل جماعات مكافحة الفئران لجنة المساواة العرقية تلقي الحقن المتوسطة فقط ، والفئران لجنة المساواة العرقية تلقي نفس التركيز من خلايا الفئران ونوع untransfected البرية الخلايا المستقبلة transfected (بدلا من ذلك ، تلقي لجنة المساواة العرقية خلايا الفئران transfected يست عرضة للمصهر).
3. Biophotonic التصوير
- خمس وخمس عشرة دقيقة قبل التصوير ، intraperitoneally (IP) ضخ 10 ميكرولتر لكل غرام من وزن الجسم الماوس من 15 ملغ / مل مد Luciferin (الفرجار العلوم الحياتية ، Hopkinton ، MA).
- تحريض التخدير على الفئران عبر isoflurane عند 4 ٪ لتحريض anد 1 -- 2 ٪ للصيانة.
- الفئران مكان مستلق في مربع التصوير مع قناع المنفذة 1 -- 2 ٪ للتخدير isoflurane الصيانة (نظام التصوير Xenogen Biophotonic ، Hopkinton ، MA). ولا يمكن تصوير الفئران عدة بشكل متزامن. صورة الفأر السيطرة زائفة مع فئران التجارب للمقارنة سهلة للإشارة الانارة.
- باستخدام البرمجيات الحية صورة (Xenogen) ، مجموعة مناسبة زمن التعرض (عادة 60 ثانية ، انظر النتائج). تعيين مجال الصورة لتناسب الفئران وإبقاء منطقة ثابتة طوال التصوير لمنع التغييرات في الحساسية. تعيين الموضوع في ارتفاع 4.5 سم.
- يكتسب كثافة التلألؤ إشارة إلى المقابلة الماوس أو الفئران ضمن الحقل عرض وحفظ الملفات صورة معدلة. صور عملية لإزالة إشارة الخلفية المقابلة لسيطرة أو الماوس unmanipulated. قيم الكثافة أعلاه الخلفية تتوافق مع الخلايا تنصهر داخل الحيوان. ويمكن إجراء تحليل كثافة استخدام البرمجيات الحية صورة (Xenogen) أو فتح تحليل الصور برمجيات المصدر. T ypically ، وهي منطقة ذات الاهتمام (ROI) هو المحدد لمقارنة البيانات بين كثافة الحيوانات والتجارب.
4. ممثل النتائج
لتحديد حساسية نظام تصوير Xenogen Biophotonic ، خط الخلية التي تعبر عن constitutively luciferase (231 - D3H1 لوك ، Xenogen) تم تسليمها إلى عضلة القلب من C57/Bl6 الفئران (مختبر جاكسون). تم حقن الخلايا بتركيزات 1 × 10 6 ، 1 × 10 3 أو 1 × 10 1 الخلايا. ست ساعات بعد الولادة الخلية ، تم حقن الفئران مع intraperitoneally luciferin وتصويرها باستخدام نظام Xenogen. ويمكن الكشف عن وجود إشارة محددة مع الخلايا 1000 (2 من 6 الفئران المصورة ، والشكل 2) ، ولكن كان الكشف عن أكثر موثوقية مع 10000 الخلايا (6 من 6 الفئران المصورة). الأهم من ذلك ، عملت هذه الدراسة أيضا إلى إقامة علاقة تقريبية بين عدد من خلايا luciferase التعبير عن وكثافة الإشارة.
و> لإثبات فائدة من وصفها في بروتوكول اكتشاف وتتبع الانصهار الخلية ، transfected اللجان الدائمة مع البلازميد LoxP الشباك LoxP - Luciferase (Addgene) وتسليمها للعضلة القلب من لجنة المساواة العرقية ، معربا عن الفئران. حوالي اسبوع واحد بعد الولادة الخلية ، تم تصوير first الفئران باستخدام نظام Xenogen دون مد luciferin الحقن. وكما هو متوقع ، من دون الركيزة الأنزيمية ، الكشف عن أية إشارة كثافة (الشكل 3). المقبل ، تم حقن D - luciferin intraperitoneally وإشارة إلى كثافة luciferase المقابلة ، وبالتالي تم الكشف عن خلية انصهار في اثنين من أربعة الفئران التي تم اختبارها. تم الكشف عن إشارة مماثلة بعد أسبوع واحد (الشكل 3) ، وامكان الحفاظ على المنتجات الانصهار MSC - يقترن في الجسم الحي ، وفي هذه الحالة ، أنهيت دراسة للسماح لتقييم القلب والأنسجة المحيطة بها ، ولكن واحدة يمكن أن نتصور على المدى الطويل التحليلات والتصوير أكثر تواترا لتتبع الصيانة ، وانتشار anد الهجرة ربما من المنتجات الانصهار في الفئران.
الشكل 1. التخطيطي للتقنية لكشف خلية الانصهار في الجسم الحي ، وإذا الانصهار بين لجنة المساواة العرقية ، معربا عن خلايا فأر والخلايا المزروعة تعبر عن البلازميد floxed luciferase حدوث ذلك ، سوف يتم التعبير عن luciferase. يمكن اكتشافه عن طريق حقن Luciferase الركيزة الأنزيمية ، D - luciferin ، في الماوس ثم التصوير الماوس باستخدام نظام التصوير Xenogen Biophotonic (بتصرف من 19)
الشكل 2. حساسية الكشف عن luciferase ، معربا عن الخلايا في أنسجة القلب مع التصوير biophotonic. تم تسليم خط الخلية التي تعبر عن constitutively luciferase (231 - D3H1 لوك ، Xenogen) إلى الفضاء intramyocardial C57/Bl6 من الفئران في مختلف مجموع أرقام الخلية. صور ممثل إعادة الفئرانوكان يحصلوا 1 × 10 6 ، 1 × 10 3 و 1 × 10 1 الخلايا (من اليسار إلى اليمين) وترد ، أجرى التصوير حوالي 6 ساعات بعد الحقن.
الشكل 3. وكانت transfected الكمي للفي التلألؤ فيفو إرشادية فيوجن الخلية. اللجان الدائمة مع LoxP الشباك Luciferase - LoxP البلازميد وتسليمها للعضلة القلب من لجنة المساواة العرقية ، معربا عن الفئران. حوالي اسبوع واحد وأسبوعين بعد الولادة الخلية ، تم تصوير الفئران لجنة المساواة العرقية باستخدام نظام التصوير Xenogen Biophotonic لقياس كثافة التلألؤ الإرشادية للانصهار الخلية. (أ) من تراكب الصورة وشدة التلألؤ من الشام والفئران 1-4 (من اليسار إلى اليمين) 17 يوما بعد الولادة الخلية. (ب) من شدة التلألؤ من الشام والفئران 1-4 (من اليسار إلى اليمين) 17 يوما بعد الولادة الخلية. وتم اختيار منطقة الفائدة (الصفراء) المقابلة لموقع الحقن ، وكثافة لوتم تحديد evels باستخدام ImageJ (مصدر مجاني) برنامج 20. (C) وتطبيع كثافة التلألؤ إلى نفس المنطقة لسعر الفائدة على الماوس صورية لجميع الظروف التجريبية. في أسبوع واحد ، وأظهرت الفئران 3 و 4 إشارة إيجابية التلألؤ اقتراح الاندماج التلقائي للخلية الماوس وMSC المزروعة. استمرت في إشارة الماوس 3 في غضون اسبوعين. لتحديد الجهاز محددة توطين إشارة إلى المقابلة الماوس 3 ، تعرضت التجويف الصدري وأجهزة تصوير ورفعه الابتدائي. (د) تراكب من الصور الفوتوغرافية وشدة التلألؤ من الماوس 3. التعريب علما إشارة كثافة في الأمعاء الدقيقة. (E) شدة التلألؤ من الماوس 3. (F) تراكب من الصور الفوتوغرافية وشدة التلألؤ من الماوس صورية. (ز) من شدة التلألؤ من الماوس صورية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصف الأسلوب هنا يسمح ، للمرة الأولى ، وتحديد وتحليل منفصلة الزماني للانصهار الخلية في الكائنات الحية ، بما في ذلك الحيوانات الصغيرة. نهج يجمع بين لجنة المساواة العرقية ، مع إعادة التركيب LoxP اللاحقة biophotonic تحليل الصور. هذا النهج هو قابلة للتتبع ليس فقط الخلايا خلايا الانصهار ، والانصهار ، بل أيضا الفيروس الخلية وهكذا يمكن أن تكون مفيدة لتتبع حالات العدوى الفيروسية. تحليل الصور سريع وأنه من الممكن للحيوانات صورة صغيرة متعددة في وقت واحد. يقتصر الكشف عن الانصهار من وتيرة الاندماج من الشركاء خلية معينة في microenvironments يناظرها وكفاءة ترنسفكأيشن من البلازميد LoxP الشباك LoxP - Luciferase. وبالتالي ، سيكون الحصول على أفضل النتائج مع الشركاء الانصهار تحتوي على نموذج متكامل لتسلسل LoxP الشباك LoxP - Luciferase. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون الكائنات الحية لصورة ثابتة وهكذا هو مطلوب لتخدير الحيوانات الصغيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور بيمان Hemmati (قسم الطب في جامعة ويسكونسن ماديسون) لتوفير بسخاء H1 اللجان الدائمة ، والدكتور تيم هاكر ، والدكتور سونغ Gouqing والسيدة جيل كوخ من جامعة ويسكونسن فسيولوجيا القلب والأوعية الدموية مرفق الأساسية لأداء جراحات الماوس. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية من خلال زمالة بحوث الدراسات العليا لفريمان بريان والمعاهد الوطنية للصحة HL089679 R21.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 |
References
- Bernirschke, K. K. P. Pathology of the Human Placenta. , Springer. New York. (2000).
- Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).
- Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia. Placenta. 20, 531-539 (1999).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia. Placenta. 21, 597-602 (2000).
- Ogle, B. M. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo. FASEB. J. 18, 548-550 (2004).
- Nygren, J. M. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 10, 494-501 (2004).
- Nygren, J. M. Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion. Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).
- Kutschka, I. Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts. Circulation. 114, I174-I180 (2006).
- Min, J. J. In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium. Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).
- Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice. Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).
- Weir, L. R. Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity. Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).
- Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice. Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).
- Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice. Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).
- Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).
- Zhu, L. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).
- Noiseux, N. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).
- Ajiki, T. Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site. Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).
- Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
