Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

En Cre-LOX P Rekombinasjon Approach for påvisning av Cell Fusion In Vivo doi: 10.3791/3581 Published: January 4, 2012

Summary

En metode for å spore celle fusion i levende organismer over tid er beskrevet. Tilnærmingen benytter Cre-

Abstract

Muligheten av to eller flere celler av samme type til sikringen har vært benyttet i metazoans gjennom evolusjonen til å danne mange komplekse organer, inkludert skjelettmuskulatur, bein og morkake. Moderne studier viser sammensmelting av celler av samme type som gir forbedret funksjon. For eksempel når trophoblast cellene i morkaken sikringen å danne syncytiotrophoblast er syncytiotrophoblast bedre i stand til å transportere næringsstoffer og hormoner over maternal-føtal barriere enn unfused trophoblasts 1-4. Nyere studier viser sammensmelting av celler av ulike typer kan direkte celle skjebne. Den "hjemfall" eller modifisering av celler skjebne ved fusjon en gang var tenkt å være begrenset til celle kultur systemer. Men ankomsten av stamcelletransplantasjon førte til oppdagelsen av oss og andre at stamceller kan sikringen med somatiske celler in vivo og at fusion forenkler stamcelleforskningen differensiering 5-7. Dermed er celle fusjon en regulert prosess capable fremme celle overlevelse og differensiering, og dermed kunne være av sentral betydning for utvikling, reparasjon av vev og selv de patogenesen av sykdommen.

Begrense studie av celle fusion, er mangel på riktig teknologi til 1) nøyaktig identifisere fusjon produkter og til 2) spore fusion produkter over tid. Her presenterer vi en ny tilnærming for å håndtere både begrensninger via induksjon av bioluminesens ved fusjon (figur 1);. Bioluminesens kan oppdages med høy følsomhet in vivo 8-15 benytter vi en konstruksjon koding ildfluen luciferase (Photinus pyralis) genet plassert i tilknytning til en stopp kodon flankert av LoxP sekvenser. Når cellene uttrykker dette genet sikringen med celler som uttrykker Cre recombinase protein, er LoxP nettsteder kløyvde og stoppsignal er excised tillate transkripsjon av luciferase. Fordi signalet er induciBle, er forekomsten av falske positive signaler svært lav. I motsetning til eksisterende metoder som utnytter Cre / LoxP 16 system, 17, har vi innarbeidet et "levende" deteksjon signal og dermed råd for første gang muligheten til å spore kinetikken av celle fusjon in vivo.

Å demonstrere tilnærming, mus overalt uttrykke Cre recombinase fungerte som mottakere av stamceller transfektert med en konstruksjon for å uttrykke luciferase nedstrøms av et floxed stopp kodon. Stamceller ble transplantert via intramyocardial injeksjon og etter transplantasjonen intravital bildeanalyse ble gjennomført for å spore tilstedeværelsen av fusion produkter i hjertet og omkringliggende vev over tid. Denne tilnærmingen kan tilpasses til å analysere celle fusion i alle vevstype på ethvert stadium av utvikling, sykdom eller voksen vev reparasjon.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Donor Cell Transfeksjon

  1. Høste stamceller (MSCS, utledet fra H1 embryonale stamceller vennlig donert av Dr. Peiman Hematti, alternativt kan hvilken som helst celletype av enhver art hypothesized til sikring in vivo være ansatt) når 70 - 80% confluent med 1X trypsin (Mediatech, Manassas VA) for 5 min. inaktivere trypsin med α-MEM komplett medium (antibiotika gratis, Invitrogen, Carlsbad CA) 18. Sentrifuger ved 300 xg i 5 min.
  2. Nøye aspirer supernatanten og re-suspendere pellet i 1 mL 1X PBS og telle celler ved hjelp av en hemacytometer.
  3. Overfør 1,5 x 10 6 celler til et 1,5 ml sentrifugerør. Sentrifuger ved 300 xg i 5 min.
  4. Nøye aspirer supernatant. Resuspender pellet i 300 mL av R buffer (Neon Transfeksjon System, Invitrogen) og 6 mikrogram (2 mikrogram / ​​5,0 x 10 5 celler) av p231 pCMVe-betaAc-STOP-luc (Addgene, Cambridge, MA). Plasser 3 mL E buffer (Invitrogen) i electroporation dokkingporten per produsentens protokoll (Neon Transfeksjon System, Invitrogen).
  5. Transfer celle-plasmid løsningen til en 100 mL Neon pipettér spissen og electroporate med en puls varighet på 20 ms og en magnitude på 1500 volt. Plasser electroporated celler inn i en 15 ml konisk rør som inneholder 9,7 ml α-MEM komplett medium.
  6. Gjenta steg 1,5 ytterligere to ganger og pool transfektert celler til å gi et totalt volum på 10 ml. Tilsett 10 ml cellesuspensjonen (1,5 x 10 6 celler) til en T175 flaske inneholder 10 ml α-MEM komplett medium. Celleviabilitet etter electroporation er ca 30%, for å gi ca 4,5 x 10 5 levedyktige celler per T175.
  7. Endre α-MEM komplett medium 24 timer etter transfeksjon.
  8. Høste transfektert celler når 70 - 80% confluent (~ 2 - 3 dager etter electroporation). Utfør celletall ved hjelp av en hemacytometer og resuspender cellene i en konsentrasjon på 1,0 x 10 6cells/50 mL av α-MEM komplett medium. Minimer tid celler tilbringer i suspensjon for å redusere celledød før injeksjon.

2. Intramyocardial Injection

  1. Fremkall anestesi med isofluran (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., St. Joseph, MO) på transgene mus konstruert for å konstitutivt uttrykke Cre recombinase i hver celle (B6.C-Tg (CMV-CRE) 1Cgn / J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME).
  2. Fjern hår fra bryst regionen bruker hårklippere eller kjemiske hår remover.
  3. Intubate med en 18 gauge kateter (Becton Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ) og plass på mus ventilator på 120-130 åndedrag per minutt med et slagvolum på 150 mL.
  4. Gjør lateral snitt tvers fjerde interkostalrom dermed produsere en torakotomi.
  5. Visualisere hjertet, lage to 25 mL injeksjoner av transfektert cellesuspensjon hjelp av en 1 ml sprøyte (Temuro Medical Corporation, Somerset, NJ) og 28 gauge nål (Bectpå Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ). Å lette intramyocardial injeksjon og hindre unødig skade på organ, bøye nålen hodet ~ 90 grader.
  6. Etter injeksjon, bruk absorberbare suturer (f.eks vicryl) for å lukke ribbeina og muskel lag. Sutur huden lukkes med 4-0 nylon eller silke.
  7. La musen til å gjenopprette fra anestesi og extubate.
  8. Kontroll grupper bør omfatte Cre mus som fikk middels injeksjoner bare, Cre mus som fikk den samme konsentrasjonen av untransfected celler og villtype mus som fikk tilført celler (alternativt, Cre mus som fikk tilført cellene ikke utsatt for sikring).

3. Biophotonic Imaging

  1. Fem til femten minutter før imaging, intraperitonealt (IP) injisere 10 mL per gram av mus kroppsvekt på 15 mg / ml D-Luciferin (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
  2. Fremkall anestesi på mus via isofluran på 4% for induksjon end 1 - 2% for vedlikehold.
  3. Plasser mus liggende i bildebehandling boks med ansiktsmaske administrasjon 1 - 2% isofluran for vedlikehold anestesi (Xenogen Biophotonic Imaging System, Hopkinton, MA). Flere mus kan avbildes samtidig. Bilde sham kontroll mus med eksperimentell mus for enkel sammenligning av selvlysende signal.
  4. Ved hjelp av levende bilde programvaren (Xenogen), sett passende eksponeringstid (typisk 60 sek, se resultater). Still område av bildet til å passe mus og holde området konsekvent gjennom bildebehandling for å hindre endringer i følsomheten. Sett emne høyde på 4,5 cm.
  5. Skaff luminescence intensitet signal tilsvarende mus eller mus innen utsikten feltet og lagre umodifiserte bildefiler. Process bilder å fjerne bakgrunn signal som tilsvarer en kontroll eller unmanipulated mus. Intensity verdier over bakgrunnen tilsvare smeltet cellene i dyret. Intensity analyse kan utføres ved hjelp av levende bilde programvare (Xenogen) eller open source bildeanalyse programvare. Typically, en region av interesse (ROI) er valgt å sammenligne intensitet data mellom dyr og eksperimenter.

Fire. Representant Resultater

For å bestemme sensitiviteten til Xenogen Biophotonic Imaging System, en cellelinje som konstitutivt uttrykker luciferase (231-Luc-D3H1, Xenogen) ble levert til hjertemuskelen av C57/Bl6 mus (Jackson Laboratory). Celler ble injisert ved konsentrasjoner på 1 x 10 6, 1 x 10 3 eller 1 x 10 1 celler. Seks timer etter celle levering, ble musene injisert intraperitonealt med luciferin og avbildes med Xenogen systemet. En konkret signal kunne påvises med 1.000 celler (2 av 6 mus fotografert, figur 2), men påvisning var mer pålitelig med 10.000 celler (6 av 6 mus avbildes). Viktigere, denne studien også serveres til å etablere en grov sammenheng mellom antall luciferase-uttrykke celler og signal intensitet.

Cre-uttrykke mus. Omtrent en uke etter celle levering, ble musene første avbildes med Xenogen systemet uten D-luciferin injeksjon. Som forventet, uten enzymatisk underlaget, var ingen intensitet signal oppdages (figur 3). Deretter var D-luciferin injisert intraperitonealt og et signal tilsvarende luciferase intensitet og dermed celle fusjon ble oppdaget i to av fire mus testet. En lignende signal ble oppdaget en uke senere (figur 3), noe som tyder MSC-coupled fusion produkter kan opprettholdes in vivo. I dette tilfellet ble studien avsluttet for å tillate evaluering av hjerte og omkringliggende vev, men man kunne se for seg langsiktige analyser og hyppigere bildebehandling for å spore vedlikehold, spredning ettd kanskje migrasjon av fusion produkter i mus.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av teknikk for å oppdage Cell Fusion In Vivo. Dersom fusjon mellom Cre-uttrykke musen celler og transplanterte cellene uttrykker en floxed luciferase plasmid skjer, vil luciferase komme til uttrykk. Luciferase kan oppdages ved å injisere den enzymatiske underlaget, D-luciferin, inn musen og deretter bildeteknologi musa ved hjelp av en Xenogen Biophotonic Imaging System (Tilpasset fra 19)

Figur 2
Figur 2. Sensitivitet for påvisning av luciferase-uttrykke celler i hjertets vev med Biophotonic bildebehandling. En celle linje som konstitutivt uttrykker luciferase (231-Luc-D3H1, Xenogen) ble levert til intramyocardial løpet av C57/Bl6 mus ved forskjellige total celle tall. Representative bilder av mus receiving 1 x 10 6, 1 x 10 3 og 1 x 10 1 celler (venstre til høyre) er vist, ble bildebehandling gjennomført ca 6 timer etter injeksjon.

Figur 3
Figur 3. Kvantifisering av In Vivo Luminescence Omtrentlig of Cell Fusion. MSCS var transfektert med LoxP-Stop-LoxP-luciferase plasmid og levert til hjertemuskelen av Cre-uttrykke mus. Omtrent en uke og to uker etter celle levering, var Cre mus avbildes med Xenogen Biophotonic Imaging System for å måle intensiteten av luminescence indikasjon på celle fusjon. (A) Overlegg av fotografi og intensitet av luminescence av forloren og mus 1-4 (venstre til høyre) 17 dager etter celle levering. (B) Intensity av luminescence av forloren og mus 1-4 (venstre til høyre) 17 dager etter celle levering. En region av interesse ble valgt (gul) tilsvarende injeksjonsstedet og intensitet levels ble bestemt med ImageJ (gratis kilde) programvare 20. (C) Intensity av luminescence ble normalisert til den samme regionen renter på humbug musen for alle eksperimentelle forhold. På én uke, viste mus 3 og 4 positive luminescence signal som tyder på spontan fusjon av en mus celle og transplantert MSC. Signalet vedvarte i mus 3 på to uker. Å bestemme organspesifikk lokalisering av signalet tilsvarende mus 3, ble brysthula eksponert og primære organer excised og avbildes. (D) Overlegg av fotografi og intensitet av luminescence av mus 3. Merk lokalisering av intensitet signal i tynntarmen. (E) Intensity av luminescence av mus 3. (F) Overlegg av fotografi og intensitet av luminescence av humbug mus. (G) Intensity av luminescence av humbug mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Metoden er beskrevet her gjør det for første gang, diskret identifisering og tidsmessige analyse av celle fusjon i organismer, inkludert små dyr. Tilnærmingen kombinerer Cre-LoxP rekombinasjon med påfølgende Biophotonic bildeanalyse. Tilnærmingen er mottagelig for sporing ikke bare celle-celle fusjon, men også virus-cell fusion og det kan vise seg nyttig for sporing av virusinfeksjoner. Bildeanalyse er rask og det er mulig å avbilde flere små dyr samtidig. Påvisning av fusion er begrenset av hyppigheten av sammensmeltingen av bestemt celle partnere i deres tilsvarende microenvironments og av effektiviteten av transfeksjon av LoxP-Stop-LoxP-luciferase plasmid. Dermed ville optimale resultater oppnås med fusion partnere som inneholder en integrert form av LoxP-Stop-LoxP-luciferase sekvens. I tillegg må organismene være stillestående til bilde og så anestesi er nødvendig for små dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke dr. Peiman Hemmati (Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison) for sjenerøst gi H1 MSCS, og Dr. Tim Hacker, Dr. Gouqing Song og Ms Jill Koch ved University of Wisconsin Cardiovascular Physiology Kjerne Facility for utføring mus surgeries. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation gjennom en Graduate Research Fellowship til Brian Freeman og NIH R21 HL089679.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neon Transfection System Invitrogen MPK5000
Neon 100 μL Kit Invitrogen MPK10025 Contains R and E Buffer
a-MEM powder Invitrogen 12000-022
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03
B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J Jackson Laboratory 006054
Trypsin 10X Fisher Scientific MT-25-054-Cl
L-Glutamine Fisher Scientific 25030-081
D-Luciferin Caliper Life Sciences 122796
Xenogen Biophotonic Imaging System Caliper Life Sciences IVIS Spectrum
Sodium Biocarbonate Sigma-Aldrich S6014-500G
Non-essential Amino Acids Invitrogen 11140-050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernirschke, K. K. P. Pathology of the Human Placenta. Springer. New York. (2000).
  2. Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).
  3. Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia. Placenta. 20, 531-539 (1999).
  4. Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia. Placenta. 21, 597-602 (2000).
  5. Ogle, B. M. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo. FASEB. J. 18, 548-550 (2004).
  6. Nygren, J. M. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 10, 494-501 (2004).
  7. Nygren, J. M. Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion. Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).
  8. Kutschka, I. Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts. Circulation. 114, I174-I180 (2006).
  9. Min, J. J. In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium. Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).
  10. Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice. Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).
  11. Weir, L. R. Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity. Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).
  12. Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice. Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).
  13. Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice. Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).
  14. Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).
  15. Zhu, L. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).
  16. Noiseux, N. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).
  17. Ajiki, T. Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site. Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).
  18. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).
  19. Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).
  20. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
En Cre-LOX P Rekombinasjon Approach for påvisning av Cell Fusion<em> In Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sprangers, A. J., Freeman, B. T., Kouris, N. A., Ogle, B. M. A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo. J. Vis. Exp. (59), e3581, doi:10.3791/3581 (2012).More

Sprangers, A. J., Freeman, B. T., Kouris, N. A., Ogle, B. M. A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo. J. Vis. Exp. (59), e3581, doi:10.3791/3581 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter