Summary
इस विधि कोशिकाओं का वास्तविक समय और के रूप में गति, विस्थापन, वेग और विभिन्न सेल प्रवास मापदंडों का मात्रात्मक मापन में निगरानी की अनुमति देता है. पारंपरिक तरीकों के विपरीत, यह वास्तविक समय दृष्टिकोण endpoint के मात्रात्मक प्रवास माप पर आधारित है, बजाय यह निगरानी और विभिन्न मापदंडों के लगातार गणना करने की अनुमति देता है.
Abstract
सेल प्रवास एक गतिशील प्रक्रिया है, जो भ्रूण विकास, ऊतकों की मरम्मत, प्रतिरक्षा प्रणाली समारोह, और ट्यूमर आक्रमण 1, 2 के लिए महत्वपूर्ण है. दिशात्मक प्रवास के दौरान, कोशिकाओं की प्रतिक्रिया में एक बाह्य chemotactic संकेत करने के लिए, या आंतरिक 3 बुनियादी गतिशीलता मशीनरी द्वारा प्रदान की संकेत के जवाब में तेजी से चलते हैं. यादृच्छिक प्रवास तब होता है जब एक सेल कम आंतरिक दिशात्मकता के पास है, कोशिकाओं को अपनी स्थानीय वातावरण का पता लगाने के लिए अनुमति देता है.
प्रारंभिक प्रतिक्रिया सेल में सेल प्रवास एक जटिल प्रक्रिया है, ध्रुवीकरण की प्रक्रिया और 2 प्रवास की दिशा में protrusions फैली हुई है. पारंपरिक Boyden कक्ष प्रवास परख के रूप में प्रवास को मापने के तरीकों इन विट्रो, जो एक अंत बिंदु परिणाम के रूप में प्रवास को मापने की अनुमति देता में chemotaxis को मापने के लिए एक आसान तरीका है. हालांकि, इस दृष्टिकोण न तो व्यक्तिगत प्रवास मानकों के माप की अनुमति देता है, और न ही यह visua करने के लिए अनुमति देते हैंlization की morphological परिवर्तन है कि सेल प्रवास के दौरान आए.
समय चूक माइक्रोस्कोपी यहाँ, हम एक तरीका है कि हमें वास्तविक समय में वीडियो का उपयोग कर पलायन कोशिकाओं पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है मौजूद है. सेल प्रवास और आक्रमण के बाद से कैंसर की पहचान कर रहे हैं, इस विधि कैंसर सेल और इन विट्रो में प्रवास आक्रमण का अध्ययन में लागू हो जाएगा. प्लेटलेट्स की यादृच्छिक प्रवास प्लेटलेट समारोह 4 के मानकों के रूप में माना गया है, इसलिए इस पद्धति भी प्लेटलेट कार्यों का अध्ययन करने में सहायक हो सकता है. इस परख तेजी से, विश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होने का लाभ है, और सेल नंबर का अनुकूलन करने की आवश्यकता नहीं है. आदेश में कोशिकाओं के लिए physiologically उपयुक्त परिस्थितियों को बनाए रखने के लिए, सीओ 2 की आपूर्ति और तापमान थर्मोस्टेट खुर्दबीन के साथ सुसज्जित है. सेल आंदोलन एक नियमित अंतराल पर खुर्दबीन के लिए फिट कैमरे का उपयोग कर के चित्र लेने के द्वारा नजर रखी है. सेल प्रवास औसत गति मापने और एक से गणना की जा सकती हैverage विस्थापन, जो Slidebook सॉफ्टवेयर द्वारा गणना की है.
Protocol
1. प्लेट की तैयारी कोलेजन के साथ लेपित
- 10 μg / Opti-Mem मीडिया में मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता कोलेजन पतला.
- कोलेजन के साथ प्रत्येक चरण 1 से अच्छी तरह से 1.5 मिलीग्राम को जोड़कर 6 अच्छी तरह प्लेटें कोट,. 4 में रात भर सेते हैं डिग्री सेल्सियस
- अगले दिन पर, प्लेट 1x फास्फेट के साथ 2 बार खारा (पीबीएस) बफर धोने और उन्हें पीबीएस में संग्रहीत.
2. सेल और एक 6 - अच्छी तरह से प्लेट पर तैयार सीडिंग
नोट: गर्म मीडिया और पीबीएस का प्रयोग सेल आंदोलन के लिए इष्टतम स्थितियों को सुनिश्चित करने के
- आगे बढ़ें एमडीए MB-231 (एक इनवेसिव स्तन कैंसर कोशिका लाइन) कम है Dulbecco 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के के. इस उदाहरण में, हम एमडीए MB-231 का उपयोग करें, लेकिन, इस विधि के किसी भी पक्षपाती कैंसर और गैर कैंसर कोशिका लाइनों के लिए लागू किया जा सकता है.
- कोशिकाओं को गर्म 1x पीबीएस के साथ दो बार और धो trypsinization द्वारा इकट्ठा. सु बनाने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच करेंकर रहे हैं कि कोशिकाओं को ठीक से से trypsin उपचार द्वारा अलग कर रहे हैं.
- 10% FBS साथ DMEM मध्यम जोड़कर कोशिकाओं को इकट्ठा करते हैं, धीरे से 5 मिनट के लिए नीचे 1000 ग्राम कोशिकाओं स्पिन. 10% FBS साथ में सेल DMEM मध्यम धीरे गोली Resuspend.
- Pipetting और नीचे धीरे से सेल गोली तोड़. यह महत्वपूर्ण है करने के लिए नीचे व्यक्ति की कोशिकाओं में सेल समूहों को तोड़ने के रूप में ज्यादा के रूप में संभव है.
- कोशिकाओं गिनती और 50,000 कोशिकाओं / DMEM मीडिया में मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10% FBS साथ पतला. प्रत्येक में अच्छी तरह से 2 मिलीग्राम बांटना.
- 37 ° C पर एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली रातोंरात सेते हैं, जब तक समय चूक माइक्रोस्कोपी शुरू.
- माइग्रेशन के लिए पर्याप्त स्थान सुनिश्चित करने के लिए, एक घाव एक विंदुक टिप का उपयोग कर बनाने के लिए, 1X पीबीएस के साथ थाली धोने के लिए (घाव का एक परिणाम के रूप में स्थापित) मलबे को हटाने और 10% FBS साथ DMEM जोड़ने. अस्थायी कोशिकाओं के लिए खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें. यदि कोशिकाओं की संख्या में चल रहे हैं, कपड़े धोने की प्रक्रिया को दोहराने. अब, थाली पर सेटअप करने के लिए तैयार हैछवि अधिग्रहण के लिए माइक्रोस्कोप.
3. खुर्दबीन और सेटअप स्वचालित छवि अधिग्रहण
वहाँ कई इमेजिंग सॉफ्टवेयर संकुल है कि स्वचालित छवि अधिग्रहण के लिए माइक्रोस्कोप नियंत्रण कर रहे हैं. यहाँ, हम Slidebook 5.0 इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और स्वचालित अधिग्रहण ओलिंप (IX81 ओलिंप) माइक्रोस्कोप, एक EM हमामात्सू C9100 कैमरा है, जो जहां अधिग्रहण की गति और न्यूनतम phototoxicity सर्वोपरि रहने कक्ष अनुप्रयोगों के लिए उत्कृष्ट है युग्मित पर प्रदर्शन कर रहे हैं. प्रणाली एक मंच शीर्ष पर्यावरण नियंत्रण कक्ष (Neue लाइव सेल) और एक स्वचालित XY मंच नियंत्रक पहले Proscan के के भी शामिल है. छवियाँ उज्ज्वल क्षेत्र मोड में एक 10X UPLANFL Ph1/0.30 उद्देश्य, एक परिभाषित समय अंतराल का उपयोग कर के साथ प्राप्त कर रहे हैं. निम्नलिखित प्रोटोकॉल छवि अधिग्रहण का वर्णन करता है.
- माइक्रोस्कोप, कैमरा, और जीना सेल इमेजिंग उपकरण पर बारी. सूक्ष्म स्तर पर थाली स्थिति. Neue लाइव सेल पर्यावरण के द्वारा प्लेट आवरणronmental नियंत्रण कक्ष है, जो एक सीओ 2 की आपूर्ति और तापमान सेंसरों के साथ जुड़ा हुआ है. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% से कम सीओ 2 थर्मोस्टेट सेट.
- SlideBook सॉफ्टवेयर पूरी तरह से स्वचालित उद्देश्य चयन, तरंगदैर्ध्य चयन और फ्लोरोसेंट और उज्ज्वल क्षेत्र तकनीकों के बीच आसान स्विचन की अनुमति देता है. आदेश में ध्यान केंद्रित नियंत्रण के विभिन्न मानकों सेट करने के लिए, खुला SlideBook सॉफ्टवेयर> क्लिक करके मेनू पट्टी> का चयन ध्यान केंद्रित नियंत्रण के लिए, जाओ>
और निम्नलिखित मापदंडों का चयन करें: - विंडो ड्रॉप डाउन से चयन द्वारा उद्देश्य बॉक्स, "उद्देश्य को परिभाषित. ध्यान दें कि हम एक चरण उद्देश्य का उपयोग कर रहे हैं और मैन्युअल रूप से संघनित्र में उपयुक्त चरण की अंगूठी का चयन. एक स्वचालित संघनित्र के साथ एक प्रणाली का उपयोग अगर, यह स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के माध्यम से निर्धारित किया जाएगा. वैकल्पिक रूप से, अगर न तो उद्देश्य बुर्ज न संघनित्र स्वचालित रहे हैं इन प्रत्येक पुस्तिका चयनित किया जाना चाहिएly.
- "फिल्टर सेट" बॉक्स में:
- सेटिंग्स का चयन करें या ड्रॉप डाउन बॉक्स से ऐपिस कैमरा प्रकाश पथ निर्देशित करने के लिए उपलब्ध फिल्टर (ऐपिस के लिए "लाइव", "हमारी प्रणाली में कैमरा के लिए widefield").
- Brightfield रोशनी के लिए उपयुक्त फिल्टर का चयन करें (हमारे सेट अप में, इस विकल्प "डीआईसी" लेबल है जो लिए brightfield प्रकाश पथ एक खुले स्थान का प्रतिनिधित्व करता है).
- पर ओपन तेज "पर क्लिक करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र शटर को खोलने के द्वारा प्रकाश स्रोत का चयन करें.
- आँख टुकड़ा के तहत नमूना देखने के लिए, बुर्ज पर उज्ज्वल क्षेत्र फिल्टर (स्थिति हमारी प्रणाली में "6") का चयन करें. शुरू ऐपिस के माध्यम से नमूना देखने के लिए उपयुक्त क्षेत्र को खोजने के लिए और ध्यान केंद्रित (3.2.1 करने के लिए 3.2.2.3 कदम) में नमूना लाने के बाद. छवि पर कब्जा हमारी प्रणाली में "1" की स्थिति के लिए कैमरे के लिए प्रकाश पथ बदलना फिल्टर बुर्ज हटो.
- स्वचालित मंच की अनुमति देता है अलग XY coordina का चयनछवि अधिग्रहण के दौरान ब्याज की कई क्षेत्रों पर कब्जा tes है. सॉफ्टवेयर में SlideBook, ध्यान केंद्रित नियंत्रण के लिए जाना, चुनें "XY", आँख टुकड़ा हालांकि विभिन्न पदों का चयन करें, तो छवि पर कब्जा (चित्रा 1) के लिए प्रत्येक स्थान में सेट बिंदु "लॉक क्लिक करें.
- ठीक धुन कि स्क्रीन पर देखा जा सकता है कैमरा छवि का ध्यान केंद्रित है. यह या तो माइक्रोस्कोप या कंप्यूटर नियंत्रण, जो ज्यादा बेहतर वेतन वृद्धि में फोकस समायोजित कर सकते हैं पर मैन्युअल नियंत्रण का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है.
- "फोकस नियंत्रण" विंडो में नियंत्रण का प्रयोग, मंच के z स्थिति को समायोजित. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, थाली के साथ संपर्क के पास फ्लैट सेलुलर protrusions पर ध्यान केंद्रित.
- स्लाइडर का उपयोग करने के लिए जोखिम बार समायोजित करने के लिए ध्यान केंद्रित के लिए एक उचित सीमा में हो ध्यान केंद्रित के साथ सहायता करने के लिए. ध्यान केंद्रित नियंत्रण> XY> यात्रा बिंदु के तहत यदि एकाधिक XY पदों पर चयनित किया गया है, प्रत्येक व्यक्ति की स्थिति के लिए ध्यान केंद्रित समायोजित. नोट: यह करने के लिए यकीन है कि वें बनाने के लिए किया जाता हैक्षेत्र में सही ढंग से एक इष्टतम स्नैपशॉट के लिए ध्यान केंद्रित कर रहे हैं.
- सॉफ्टवेयर का प्रयोग करने के लिए खिड़की पर कब्जा पैरामीटर सेट. SlideBook में, चयन करके कब्जा खोलें
मेनू पट्टी से. चित्र 2 देखें. हम तो निम्नलिखित मानकों की जाँच करें. - समय व्यतीत हो जाने के रूप में प्रकार> कैप्चर की जाँच करें.
- वाइड क्षेत्र: जिला उद्योग केंद्र (उज्ज्वल क्षेत्र छवि के लिए) फ़िल्टर सेट की जाँच करें.
- समय बिंदुओं की संख्या है कि (यह भिन्न कर सकते हैं, सेल के प्रकार पर निर्भर करता है) पर कब्जा कर लिया जाएगा "समय चूक पर कब्जा है. अवधि प्रयोग के लिए समय की कुल लंबाई है. समय की [मिसे (एमएस), सेकंड (), (एम) मिनट या घंटे (ज)] इकाइयों ड्रॉपडाउन मेनू से चुना जा सकता है.
- एक timepoint की शुरुआत और अगले timepoint की शुरुआत के बीच देरी "अंतराल" है. जैसा कि आप इन मूल्यों में से दो में लिखते हैं, तीसरा क्षेत्र स्वचालित रूप से गणना की जाएगी.
- एकाधिक XY पर कब्जा: "बहु का चयन करेंअधिक से अधिक 1 XY स्थिति के लिए सूची बिंदु ".
- फ़ाइल का नाम. दिए गए उदाहरण में, हम यह '231 नाम है '.
- एकाधिक छवियों के कारण कंप्यूटर के नीचे बंद अप्रत्याशित से बचने के लिए, "स्पूल विकल्प" फ़ाइल को बचाने का उपयोग करें. यह वैकल्पिक है, लेकिन यह अत्यधिक की सिफारिश की है. इस प्रयोजन के लिए, कब्जा के तहत विवाद> का चयन करें> उन्नत स्पूल> स्मृति पर कब्जा है और हर बार अंक के बाद स्पूल फ़ाइल को बचाने के. एल स्थान ब्राउज़ करने के लिए स्लाइड पुस्तक फ़ाइल (चित्रा 3) को बचाने के. बाद में निर्दिष्ट स्थान से उत्पन्न फिल्म आयात किया जा सकता है. माइक्रोस्कोप की स्थापना के चरणों में संक्षेप 3.1 फ़ाइल .
और निम्नलिखित मापदंडों का चयन करें: 
मेनू पट्टी से. चित्र 2 देखें. हम तो निम्नलिखित मानकों की जाँच करें. 4. छवि प्रसंस्करण और प्रवासन का विश्लेषण: स्पीड और विस्थापन की गणना
इस उदाहरण में, छवि प्रसंस्करण SlideBo द्वारा किया जाता है5 ठीक है, छह 5.0 सॉफ्टवेयर. इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण के लिए विभिन्न अन्य ऐसे कार्यक्रमों 7 ImageJ के रूप में कर रहे हैं.
- SlideBook समय विभिन्न बिंदुओं पर विभिन्न क्षेत्रों की छवियों से उत्पन्न फ़ाइलों का आयात. मेनू पट्टी करने के लिए जाओ> आयात> छवि के तहत> स्लाइड पुस्तक पर स्पूल> वांछित फ़ाइल (चित्रा 4a) का चयन करें.
- यहाँ हमारे लक्ष्य व्यक्ति की कोशिकाओं के आंदोलन को ट्रैक करने के लिए है. यह स्वचालित ट्रैकिंग या व्यक्तिगत ट्रैकिंग का उपयोग किया जा सकता है. उदाहरण में, हम पुस्तिका ट्रैकिंग का इस्तेमाल किया है, के बाद से इस सुविधा बाहर सत्तारूढ़ कलाकृतियों आसानी से है, जो स्वचालित ट्रैकिंग के साथ और अधिक मुश्किल है.
- SlideBook फ़ाइल है, जो हम प्रदर्शन पर नज़र रखने के खोलें. मेनू के तहत चुनें मास्क> कण ट्रैकिंग प्रोटोकॉल> सर्विस कण ट्रैकिंग प्रोटोकॉल (4b चित्रा). प्रारंभ और अंत समय अंक (चित्रा 4c) के साथ एक विंडो दिखाई देगा.
- Begiप्रत्येक सेल (नाभिक) के केंद्र पर क्लिक करके व्यक्ति की कोशिकाओं के आंदोलन को ट्रैक करने के लिए एन. ट्रैक हर फिल्म से लगभग 10 कोशिकाओं और कम से कम तीन अलग फिल्मों के विभिन्न स्थानों से चुना जा चाहिए इतना है कि लगभग 30 कोशिकाओं के प्रयोग से विश्लेषण किया जाएगा. प्रत्येक प्रयोग में तीन बार दोहराया जाना चाहिए. एक निष्पक्ष दृष्टिकोण की अनुमति के लिए, सामने से कुछ कोशिकाओं के रूप में अलग अलग स्थानों से कक्षों का चयन करें, मध्य, कोनों आदि "ठीक" क्लिक करें, एक बार ट्रैकिंग किया जाता है.
- यादृच्छिक प्रवास गति, वेग, या विस्थापन आदि में परिवर्तन को मापने के लिए डेटा मेनू के तहत,> का चयन मुखौटा> कण ट्रैकिंग कण> ट्रैकिंग प्रोटोकॉल का विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. ट्रैकिंग मापदंडों का चयन करें के रूप में वर्णित है, नीचे: (चित्रा 5a)
- साथ ट्रैक - पैरामीटर है कि आप ड्रॉपडाउन सूची से ट्रैक करना चाहते हैं. इस उदाहरण में, हम क्षेत्र के केंद्र का इस्तेमाल किया है (ओब के केंद्र के निर्देशांक) परियोजना.
- ट्रैक और जारी रखें "क्लिक करें. एक बार ट्रैकिंग पूरा हो गया है, यह स्वचालित रूप से अगले कदम के लिए अग्रिम जाएगा.
- प्रत्येक पथ के लिए वांछित के रूप में आँकड़े, विस्थापन और औसत गति (चित्रा 5b देखें) चुनें:
- औसत रफ़्तार कुल दूरी की यात्रा की है कि दूरी की यात्रा करने के लिए आवश्यक समय से विभाजित.
- कुल विस्थापन - वस्तु से कूच कुल दूरी.
- पर क्लिक करें "की गणना करें और जारी रखें" यदि आप अगले कदम के लिए प्रगति करना चाहते हैं, या बस चुनें "गणना करें" यदि आप अगले कदम के लिए जा रहा बिना अपने आँकड़ों को देखने की इच्छा. एक फाइल उत्पन्न किया जा सकता है जो पाठ फ़ाइल के रूप में सहेजा जा सकता है और बाद में Excel के लिए निर्यात किया जा सकता है.
- आदेश में स्वचालित ट्रैकिंग प्रोटोकॉल का उपयोग की वस्तुओं को ट्रैक करने के लिए, पहले एक मुखौटा पैदा हो गया है.
- मास्क> अनुभाग> छवि एक खंड विंडो प्रकट होता है का चयन करें> का चयन करें जब तक सीमा हासिल की है जैसे कि सितम्बरदूसरों से एक वस्तु arating> क्लिक करें ठीक> लागू (चित्र 5c देखें). 4.5.1 चरण में ही है.
- ऑब्जेक्ट्स से छोटे निकालें इस बॉक्स की जांच करने के लिए चुनिंदा वस्तुओं को दिए गए आकार की तुलना में छोटे हटाने के. संपादित करें क्षेत्र में आकार दर्ज करें और इकाई के रूप में या तो माइक्रोन या पिक्सल का चयन करें. यह करने के लिए अक्सर मलबे की वजह से कलाकृतियों को दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- न्यूनतम आंदोलन - समय अंक की न्यूनतम संख्या दर्ज करें कि में आदेश के लिए एक रास्ता निर्धारित लगाया जाना चाहिए.
- अधिकतम आंदोलन - अधिकतम आंदोलन दर्ज करें कि आप एक समय बिंदु से किसी भी वस्तु से अगले करने के लिए उम्मीद है.
- डेटा का विश्लेषण करने के लिए पुस्तिका ट्रैकिंग के रूप में एक ही (4.6.2 के लिए 4.5.2 चरण देखें).
5. प्रतिनिधि परिणाम
एक यादृच्छिक प्रवास विश्लेषण का एक उदाहरण के रूप में गति और विस्थापन (चित्रा 6) के मामले में मात्रा. फ़ाइल टी निर्यात के बादओ एक्सेल, डेटा का उपयोग कर एक बॉक्स और मूँछे साजिश साजिश रची है. सांख्यिकीय विश्लेषण और परीक्षण और नियंत्रण के बीच औसत गति विस्थापन की तुलना मान - व्हिटनी परीक्षण का उपयोग कर किया जाता है. परीक्षण नमूना के रूप में नियंत्रण की तुलना में औसत गति में वृद्धि से पता चलता है. परीक्षण नमूना कुल विस्थापन के रूप में नियंत्रण की तुलना में वृद्धि से पता चलता है.
कोलेजन पर नियंत्रण और परीक्षण की मूवी: एमडीए MB-231 नियंत्रण और परीक्षण कोशिकाओं को एमडीए MB-231 रातोंरात वरीयता प्राप्त थे. समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी ओलिंप माइक्रोस्कोप के द्वारा किया गया था, एक कैमरा EM-हमामात्सू युग्मित. छवियाँ 18 घंटे की कुल के लिए एक यादृच्छिक प्रवास के दौरान 1 घंटे के अंतराल पर लिया जाता है. 1 मूवी और नियंत्रण और परीक्षण के नमूने के लिए यादृच्छिक प्रवास के 2 मूवी देखने के लिए कृपया.
माइक्रोस्कोप सेटअप:
चित्रा 1 छवि के लिए एकाधिक अंक की स्थापना. पर कब्जा.
चित्रा 2 कब्जा नियंत्रण चित्रण कदम. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
चित्रा 3. कैसे एकाधिक छवियों को बचाने के लिए.
सहायता "dflinebreak> छवि प्रसंस्करण और प्रवास के विश्लेषण.
चित्रा 4a. डेटा विश्लेषण के लिए छवि आयात के लिए.
चित्रा 4b. कण ट्रैकिंग प्रोटोकॉल का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करने के लिए कदम.
चित्रा 4c. विंडो चित्रण ट्रैक किए गए कणों के पथ लंबाई.
डेटा विश्लेषण के कदम.
आंकड़ा 5a. कण ट्रैकिंग प्रोटोकॉल के मापदंडों चित्रण कदम.
आंकड़ा 5b पथ आँकड़े का चयन करने के लिए विश्लेषण किया जा.
चित्रा 5c के लिए स्वचालित ट्रैकिंग प्रोटोकॉल के लिए मुखौटा बनाने के लिए कदम है.
आंकड़ा 6 औसत गति (चित्रा) 6a और विस्थापन (चित्रा 6b) एक मूंछ साजिश में साजिश रची है. परीक्षण नमूना गति और विस्थापन की वृद्धि से पता चलता है के रूप में नियंत्रित करने के लिए की तुलना करें.
सिनेमा
1 फिल्म. नियंत्रण कक्ष के प्रवास. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
2 फिल्म. परीक्षण कोशिकाओं के प्रवास. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
एमडीए MB-231 नियंत्रण और परीक्षण एमडीए MB - 231 कोशिकाओं को कम से रात भर के लिए कोलेजन पर वरीयता प्राप्त थे. समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी ओलिंप माइक्रोस्कोप के द्वारा किया गया था, एक कैमरा EM-हमामात्सू युग्मित. छवियाँ 1hour के 18 घंटे के लिए एक यादृच्छिक प्रवास के दौरान अंतराल पर लिया जाता है. कृपया यादृच्छिक प्रवास के नियंत्रण और परीक्षण के लिए फिल्में देखना.
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Discussion
वास्तविक समय यादृच्छिक प्रवास परख सही, गति और विस्थापन के रूप में सेल प्रवास मापदंडों का संवेदनशील विश्लेषण, सक्षम बनाता है. इस विधि के लिए अंत बिंदु माप मूल्य के लिए ही सीमित नहीं है, इसलिए इसे और अधिक मात्रात्मक है. के बाद से, कोशिकाओं के के सीरम साथ सामान्य DMEM माध्यम से निगरानी कर रहे हैं, यह सीरम मुक्त मीडिया में लंबे समय तक ऊष्मायन के हानिकारक प्रभाव को कम कर देता है. यह दिखाया गया है कि कोशिकाओं के प्रवास के स्वरूपण और 8 बुनियाद, इस प्रकार, इस पद्धति के लिए प्रवास पर अलग substrata के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ सेल संपर्कों को तोड़ने पर निर्भर करता है.
एक महत्वपूर्ण कदम के तापमान के 37 डिग्री सेल्सियस और 5% से कम सीओ 2 के लिए उचित नियंत्रण शामिल के इष्टतम प्रवास सुनिश्चित करने के. परख लचीलापन परमिट के लिए वांछित समय अंक पर प्रवासी प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने, तथापि, यह समय अंक की संख्या को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है. उदाहरण के लिए, कुछ प्रवास दर कम होने की कोशिकाओं के लिए एक लो के लिए नजर रखी जा सकता हैnger समय के रूप में उच्च प्रवास दर वाले कोशिकाओं की तुलना में.
ट्यूमर का microenvironment carcinogenesis में महत्वपूर्ण कारकों में से एक है. Endothelial कोशिकाओं, stromal और भड़काऊ 9 कोशिकाओं के रूप में चारों ओर की कोशिकाओं के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत से कैंसर परिणाम है. इस परख के लिए अध्ययन कैसे ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवास microenvironment से प्रभावित कर रहे हैं करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. मायनों में इसे हासिल किया जा सकता है की एक fluorescently लेबल ट्यूमर द्वार और endothelial कोशिकाओं के रूप में विभिन्न कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी में विकसित कोशिकाओं के प्रवास का अध्ययन कर रहा है. यह विधि भी वास्तविक समय में घाव भरने का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
समय चूक माइक्रोस्कोपी सेल आक्रमण, कोशिका विभाजन, apoptosis और lamellipodial गतिशीलता और उच्च संकल्प लेंस का उपयोग फोकल आसंजन गतिशीलता की निगरानी करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
इस विधि की सीमाओं में से एक है कि यह अनुमति नहीं है migra की निगरानीvivo में tion. के बाद से वहाँ नहीं उपलब्ध उपकरण है कि शरीर में वास्तविक समय प्रवास के उपाय कर सकते हैं, परख के इस प्रकार vivo प्रवास के लिए उपयुक्त नहीं है. यह भी हमें जैव रासायनिक मशीनरी और संकेत घटक है कि सेल प्रवास में महत्वपूर्ण हैं को स्पष्ट करने के लिए अनुमति नहीं है. आदेश में संकेत दे रास्ते का पता करने के लिए, यह आवश्यक है करने के लिए जैव रासायनिक प्रयोगों प्रदर्शन. समूहों है कि यादृच्छिक प्रवास 6, 10-14 के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है के लिए संदर्भ देखें.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों के प्रयोग के साथ प्रारंभिक मदद अमांडा Struckhoff के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. इस काम 5RO1CA115706 NIH से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus Corporation | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior Scientific | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
References
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
- Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
- Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
- Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
- Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
- Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
- Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
- Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
- Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).
