Summary
这种方法允许在不同的细胞迁移参数，如速度，位移和速度的实时性和定量测量细胞的监测。实时方式与传统方法不同的是，这不是基于端点的定量迁移测量;相反，它允许不同的参数，不断监测和计算。
Abstract
细胞迁移是一个动态的过程，这是非常重要的胚胎发育，组织修复，免疫系统的功能，与肿瘤的侵袭1，2。在定向迁移，细胞外趋化信号的响应，或响应内在线索3的基本动力机械提供快速移动。随机迁移发生时，细胞具有低固有的方向性，使细胞探索当地环境。
细胞迁移是一个复杂的过程，在最初的反应细胞，经过极化和中迁移的方向延伸的突起。传统的方法来衡量，如Boyden小室迁移实验迁移是一个简单的方法来衡量在体外 ，从而使一个终点的结果作为衡量迁移的趋化。不过，这种做法既不允许个体迁移参数的测量，也不允许到visualization的细胞在迁移过程中经历的形态学变化。
在这里，我们提出了一种方法，使我们能够监测细胞迁移，在实际使用视频时间 - 时间的推移显微镜。由于细胞迁移和侵袭癌的标志，这种方法适用于研究癌症细胞迁移和体外侵袭。随机迁移的血小板已考虑为血小板功能的4参数之一，因此这种方法也可以是血小板功能的研究很有帮助。此法的优点是快速，可靠，重现性好，不需要手机号码的优化。为了维持细胞生理适当的条件下，在显微镜配备CO 2供应和温控器。细胞的运动进行监测使用安装在显微镜定期相机拍照。细胞迁移可以通过测量平均时速和计算verage位移，这是由Slidebook软件计算。
Protocol
1。胶原涂层板的制备
- 胶原蛋白稀释到终浓度为10微克/毫升的Opti-MEM媒体。
- 大衣胶原的6孔板，从第1步，每孔加入1.5毫升。孵育过夜在4°C
- 翌日，1X磷酸的2倍缓冲液（PBS）洗板，将它们存储在PBS。
2。在6孔板细胞的制备及幼苗
注：用温水媒体和PBS，以确保细胞运动的最佳条件
- 成长的MDA-MB-231（浸润性乳腺癌细胞株）在杜尔贝科的改良Eagle培养基（DMEM培养基），10％胎牛血清（FBS），人口稀少。在这个例子中，我们使用的MDA-MB-231，然而，这种方法可以应用到任何附着的癌变和非癌变细胞株。
- 温暖1X PBS洗涤细胞两次和收集由胰蛋白酶。检查细胞在显微镜下，使苏重新正确胰蛋白酶处理细胞分离。
- 收集细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，轻轻地旋转5分钟，在1000Ğ细胞。重悬于含10％胎牛血清的DMEM培养基中的细胞沉淀轻轻。
- 移液器上下轻轻打破细胞沉淀。重要的是尽可能地分解成单个细胞的细胞团。
- 计数细胞，并与10％胎牛血清的DMEM培养基50,000个细胞/毫升的终浓度稀释。免除2毫升到每口井。
- 板在37°C，在组织文化的孵化器孵育过夜，直到出发的时间推移显微镜。
- 迁移，以确保足够的空间，创建一个伤口，用枪头，用1X PBS洗板清除杂物（如伤口形成），并加入含10％胎牛血清的DMEM培养液。检查显微镜下的浮动细胞。如果大量的细胞是浮动的，重复洗涤过程。现在，该板块是准备上的设置显微镜图像采集。
3。显微镜的安装和自动图像采集
有几个控制自动图像采集显微镜的成像软件包。在这里，我们使用Slidebook 5.0图像处理软件和1奥林巴斯显微镜（奥林巴斯IX81）耦合到EM-滨松C9100相机，这是极好的活细胞应用是最重要的收购速度和最小的光毒性，进行自动采集。该系统包括一个舞台上方的环境控制腔（NEUE活细胞）和自动化的XY平台控制器（之前Proscan的）。一个10X UPLANFL Ph1/0.30目标，在明亮的场模式使用规定的时间间隔，图像采集。以下协议描述的图像采集。
- 打开显微镜，照相机，和活细胞成像设备。定位板在微观阶段。覆盖板的“新活细胞ENVIronmental控室，这是一个CO 2供应和温度传感器连接。温控器设置在37°C和5％的CO 2。
- SlideBook软件可以完全自动化的目标选择，波长选择和荧光和亮场技术之间轻松切换。为了设置不同的参数控制的重点，开放SlideBook软件>去菜单栏>选择重点控制，通过点击>
并选择以下参数： - 在“目标”框中，“确定从下拉窗口下拉选择的目标。请注意，我们使用了一个阶段的目标和冷凝器手动选择适当的阶段环。如果使用了自动冷凝器系统，这将自动设置通过软件程序。另外，如果既不客观，炮塔也冷凝器自动化这些应该每个人都可以选择手动LY。
- 在“过滤设置”框：
- 选择“设置”直接光路目镜或相机从下拉框可用的过滤器（“活”的目镜，“广角”相机在我们的系统）。
- 明照明选择适当的过滤器（在我们的设置，此选项被标记为“DIC的”明光路为代表的开放位置）。
- 选择“开亮”点击打开明亮的领域快门的光源。
- 要查看下眼片样品，选择明亮的领域炮塔上的过滤器（在我们的系统中的位置“6”）。在最初通过目镜观察样品，找到合适的领域，并带来成焦点（步骤3.2.1 3.2.2.3）的样品。将过滤器的炮塔改变光路图像采集（位置“1”在我们的系统）的相机。
- 自动化阶段允许选择不同的XY coordina附加费捕捉图像采集过程中利益的多个领域。在SlideBook软件，到重点控制，选择“XY”，选择不同的岗位虽然眼睛片，然后按一下“设定点”锁定在每个位置图像采集（ 图1）。
- 微调的摄像机图像，在屏幕上观看的焦点。这可以通过使用手动控制，在显微镜或电脑控制，可在更精细的增量调整的重点。
- “焦点控制”窗口中使用的控制，调整z位置的阶段。为达到最佳效果，重点对附近的板接触的扁平细胞突起。
- 为了帮助重点使用滑块来调整曝光时间，在适当的范围内为重点。如果多个XY位置已选定，为每个位置调整的重点：重点控制>的XY>访问点下。注：这样做是为了确保，日领域是正确的集中最优的快照。
- 使用该软件来设置捕获窗口的参数。在SlideBook，打开所选择的捕捉
从菜单栏。 见图2。然后，我们检查以下参数。 - 检查捕获类型>随着时间的推移。
- 检查过滤器设置：大视野：迪爱生（亮场图像）。
- “时间流逝捕获”是时间点的数量，将捕获的（它可以有所不同，取决于细胞类型）。时间是实验的时间总长度。从下拉菜单中可以选择的时间单位毫秒（ms），秒（s），分钟（m）或小时（h）] [。
- “间隔”是延迟之间的一个时间点开始，在接下来的时间点开始。当你输入两个值，第三个字段将自动计算。
- 多个XY采集：选择“多点名单“超过1 XY位置。
- 命名该文件。在给定的例子，我们把它命名为'231'。
- 为了避免意外关闭计算机由于多个图像，使用“假脱机选项”保存文件。它是可选的，但它是强烈建议。为此，捕捉下contro升> 选择高级 > 阀芯 > 捕获到内存中，并保存后各时间点假脱机文件。浏览的位置来保存幻灯片书文件（ 图3）。后来从指定的位置，可以导入生成的电影。显微镜安装步骤已在文件3.1总结。
并选择以下参数： 
从菜单栏。 见图2。然后，我们检查以下参数。 4。迁移：计算速度和位移的图像处理和分析
在这个例子中，是通过图像处理SlideBo确定5，6 5.0软件。还有许多其他方案，如ImageJ的7图像处理和分析。
- 导入SlideBook来自不同领域的图像生成的文件在不同的时间点。转到菜单栏下图片>导入> 幻灯片书阀芯 >选择所需的文件（ 图4a）。
- 在这里，我们的目标是跟踪单个细胞的运动。这是可以做到使用自动跟踪或个人跟踪。在这个例子中，我们用手动跟踪，因为这有利于排除工件容易，这是自动跟踪更加困难。
- 打开的SlideBook文件，其中我们要进行跟踪。下菜单：选择面膜 > 粒子跟踪协议 > 手册粒子跟踪议定书“（图4b）。将出现一个窗口，开始和结束的时间点（ 图4c）。
- begin来跟踪单个细胞的运动，通过点击每个细胞（核）的中心。跟踪约10个单元，从每部电影，至少有三个不同的电影，从不同的地点应选择大约30个细胞，使将会从一个实验分析。每次实验应重复三次。允许不偏不倚的态度，选择不同的位置，如从前面的一些细胞的细胞中间，弯道等点击“OK”，一旦进行跟踪。
- 随机迁移可以通过测量速度，速度或位移等的变化，要分析的数据，根据菜单> 选择面膜 > 粒子跟踪粒子跟踪协议分析。选择跟踪参数描述如下：（ 图5a）：
- 跟踪 - 您希望跟踪从下拉列表中选择参数。在这个例子中，我们已经使用， 中心区 （OB中心的坐标Ject的）。
- 点击“跟踪，并继续”。一旦跟踪完成后，会自动前进到下一步。
- 选择所需的统计为每个路径，如位移和平均速度（ 见图5b）：
- 平均时速 -总行驶距离除以前往距离所需的时间。
- 总排量 -对象行驶总距离。
- 点击“计算，并继续”如果你想进步的下一步，或者干脆选择“计算”，如果你想查看您的统计资料，而不去下一步。将生成的文件可以保存为文本文件，以后可以导出到Excel。
- 为了追踪物体使用自动跟踪协议，第一个面膜被创建。
- 选择面膜>图像分割>段的窗口会出现选择，直到达到阈值，这样九月从别人arating一个对象>单击“应用>确定（ 见图5c）。 4.5.1步骤是相同的。
- 删除对象小于 - 检查此框有选择地删除对象而不是一个给定的尺寸较小。在编辑栏输入的大小和选择任一微米为单位的像素。这是用来消除经常由碎片引起的工件。
- 最小的运动 - 进入时间点的最低数量，必须跟踪，以确定路径。
- 最大的移动 - 输入您希望从任何给定的对象从一个时间点到下一个最大的运动。
- 的数据进行分析的步骤是相同的手动跟踪（见步骤4.5.2至4.6.2）。
5。代表结果
随机迁移分析的一个例子，作为量化的速度和位移（ 图6）。在导出文件ţØExcel中，数据是用一个盒子和晶须阴谋策划。使用Mann-Whitney检验进行统计分析，比较，总的测试和控制之间的位移和平均速度。测试样品显示平均速度比对照增加。测试样品显示与对照相比，在总排量的增加。
电影：控制和测试控制MDA-MB-231和测试的MDA-MB-231细胞接种在胶原过夜。时间推移视频显微镜是由奥林巴斯显微镜，耦合电磁滨松相机。图像采取随机迁移期间共有18个小时的时间间隔为1小时。请参阅控制和测试样本的随机迁移的电影1，电影2。
显微镜下的设置：
图1。设置图像的多点捕获。
图2描绘捕获控制的步骤。 点击这里查看大图 。
图3。如何保存多张图片。
dflinebreak“> 迁移的图像处理和分析。
图4a。导入图像数据分析的步骤。
图4b。对数据进行分析，使用粒子追踪协议的步骤。
图4c。窗口描绘跟踪粒子的路径长度。
数据分析的步骤。
图5a。描绘的粒子跟踪协议参数的步骤。
图5b。选择路径统计进行分析。
图5c。步骤创建自动跟踪协议的面具。
图6。平均时速（ 图6a）和位移（ 图6b）绘制在晶须情节。测试样品显示了增长的速度和位移作为比较控制。
电影
电影1。控制细胞的迁移。 点击这里查看电影 。
电影2。测试细胞迁移。 点击这里查看电影 。
人烟稀少控制的MDA-MB-231和测试的MDA-MB-231细胞接种过夜的胶原蛋白。时间推移视频显微镜是由奥林巴斯显微镜，耦合电磁滨松相机。在18个小时的时间间隔在随机迁移的1小时图像。为控制和测试，请参阅随机迁移的电影。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
实时随机的移民法能够准确，灵敏的细胞迁移的参数，如速度和位移分析。此方法不仅限于结束点的测量值，因此它是更多的量化。由于细胞在正常培养液血清培养基监测，它减少了有害影响较长的潜伏期在无血清媒体。它已被证明的格式和基质8，因此，这种方法可以用来研究不同基质对移民的影响，打破了细胞接触依赖的细胞迁移。
的关键步骤之一，包括适当的控制温度为37°C和5％的CO 2，以确保最佳迁移。该法允许灵活性，以监视迁徙反应所需的时间点，但是，它可能需要优化的时间点。例如，一些细胞迁移率较低，可能要为劳监测nger时间相比，细胞具有较高的迁移率。
肿瘤微环境是致癌的重要因素之一。从癌肿瘤细胞周围的细胞，如内皮细胞，间质炎性细胞和9互动结果。此法可进行修改，以研究如何对肿瘤细胞迁移的微环境的影响。它可以实现的方式之一是通过研究荧光标记的肿瘤细胞生长在不同的细胞，如气孔和内皮细胞混合的人口迁移。这种方法还可以用于研究实时伤口愈合。
可以修改时间推移显微镜监测细胞浸润，细胞分裂，细胞凋亡和lamellipodial动力学和粘着动力学，使用更高的分辨率镜头。
这种方法的局限性之一是，它不允许监测的偏移TION 在体内 。由于没有设备，可以测量在体内的实时迁移，这种类型的检测是不适合在体内的迁移。它也不会允许我们澄清的生化机械和信号是在细胞迁移的重要组成部分。为了解决信号通路，这是必须执行的生化实验。看到，这种方法用于随机迁移6，10-14组参考。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢阿曼达Struckhoff与实验的初始帮助。这项工作是从5RO1CA115706 NIH的拨款支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus Corporation | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior Scientific | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
References
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
- Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
- Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
- Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
- Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
- Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
- Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
- Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
- Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).
