Summary
Cette méthode permet le suivi des cellules en temps réel et des mesures quantitatives de différents paramètres de migration cellulaires tels que la vitesse, le déplacement et la vitesse. Contrairement aux méthodes traditionnelles, cette approche temps réel n'est pas basée sur des mesures quantitatives de point de terminaison de migration, mais plutôt il permet de surveiller et de calcul des paramètres différents en permanence.
Abstract
La migration cellulaire est un processus dynamique, ce qui est important pour le développement embryonnaire, la réparation des tissus, la fonction du système immunitaire, et l'invasion tumorale 1, 2. Lors de la migration directionnelle, les cellules se déplacent rapidement en réponse à un signal chimiotactique extracellulaire, ou en réponse à des signaux intrinsèques 3 prévus par le mécanisme de base motilité. La migration aléatoire se produit lorsque une cellule possède une faible directivité intrinsèque, permettant aux cellules d'explorer leur environnement local.
La migration cellulaire est un processus complexe, dans la cellule de réponse initial est soumise à la polarisation et s'étend saillies dans le sens de la migration 2. Les méthodes traditionnelles de mesure de la migration, comme le test de migration Boyden chambre est une méthode simple pour mesurer la chimiotaxie in vitro, qui permet de mesurer la migration comme un résultat point de fin. Cependant, cette approche ne permet ni la mesure des paramètres de migration individuels, elle ne permet pas de visualisation de changements morphologiques que la cellule subit lors de la migration.
Ici, nous présentons une méthode qui nous permet de contrôler les cellules migrent en temps réel en utilisant la vidéo - microscopie laps de temps. Depuis la migration et l'invasion cellulaire sont caractéristiques du cancer, cette méthode sera applicable dans l'étude de la migration des cellules cancéreuses et l'invasion in vitro. La migration aléatoire des plaquettes a été considéré comme l'un des paramètres de la fonction plaquettaire 4, d'où cette méthode pourrait également être utile dans l'étude des fonctions plaquettaires. Ce test présente l'avantage d'être rapide, fiable, reproductible, et ne nécessite pas d'optimisation du nombre de cellules. Afin de maintenir des conditions physiologiquement appropriées pour les cellules, le microscope est équipé d'alimentation en CO 2 et d'un thermostat de température. Le mouvement cellulaire est contrôlé par la prise de vue à l'aide d'une caméra montée sur le microscope à intervalles réguliers. La migration cellulaire peut être calculée en mesurant la vitesse moyenne et unedéplacement mo yen, qui est calculée par un logiciel Slidebook.
Protocol
1. Préparation de la plaque recouverte de collagène
- Diluer collagène à une concentration finale de 10 pg / ml dans Opti-Mem médias.
- Manteau plaques à 6 puits avec du collagène, en ajoutant 1,5 ml de l'étape 1 dans chaque puits. Incuber une nuit à 4 ° C.
- Le lendemain, laver la plaque 2 fois avec du phosphate de 1x solution saline tamponnée (PBS) et de les stocker dans du PBS.
2. Préparation des cellules et de semis sur une plaque à 6 puits
Note: Utiliser les médias chauds et PBS afin d'assurer des conditions optimales pour le mouvement des cellules
- Cultiver MDA-MB-231 (une ligne du sein invasif des cellules cancéreuses) faiblement dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin (FBS). Dans cet exemple, nous utilisons la MDA-MB-231; toutefois, cette méthode peut être appliquée à toutes les adhérentes et non cancéreuses des lignées de cellules cancéreuses.
- Laver les cellules deux fois avec du PBS 1x chaude et de recueillir par trypsinisation. Vérifiez les cellules sous un microscope à faire sure que les cellules soient correctement détachée par traitement à la trypsine.
- Recueillir les cellules en ajoutant du milieu DMEM avec 10% de FBS, essorer délicatement vers le bas les cellules à 1000 g pendant 5 minutes. Remettre en suspension le culot cellulaire en douceur dans un milieu DMEM avec 10% de FBS.
- Briser le culot cellulaire par aspiration et refoulement en douceur. Il est important de briser des amas de cellules en cellules individuelles autant que possible.
- Compter les cellules et diluer à une concentration finale de 50.000 cellules / ml dans du milieu DMEM avec 10% de FBS. Distribuer 2 ml dans chaque puits.
- Incuber la plaque à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire du jour au lendemain, jusqu'à ce qu'ils commencent la microscopie time-lapse.
- Pour assurer suffisamment d'espace pour la migration, créer une plaie à l'aide d'une pipette, laver la plaque avec du PBS 1X pour enlever les débris (formé à la suite de la blessure) et ajouter du DMEM avec 10% de FBS. Vérifiez sous le microscope des cellules flottantes. Si un grand nombre de cellules sont flottantes, répétez la procédure de lavage. Maintenant, la plaque est prête à être installé sur leMicroscope d'acquisition d'images.
3. Configuration microscope et d'acquisition d'images automatisé
Il existe plusieurs logiciels d'imagerie qui contrôlent le microscope pour l'acquisition automatique d'images. Ici, nous utilisons le logiciel d'imagerie Slidebook 5,0 et acquisitions automatiques sont effectués sur un microscope Olympus (Olympus IX81), couplé à une caméra Hamamatsu C9100 EM-, qui est excellent pour des cellules vivantes applications où la vitesse d'acquisition et de la phototoxicité minimale est primordiale. Le système comprend une étape supérieure de la chambre de contrôle de l'environnement (Neue cellules vivantes) et un contrôleur automatisé stade XY (Avant Proscan). Les images sont acquises avec un objectif 10X UPLANFL Ph1/0.30, en mode champ clair, en utilisant un intervalle de temps défini. Le protocole suivant décrit l'acquisition de l'image.
- Tourner sur le microscope, la caméra et appareil d'imagerie cellulaire en direct. Positionner la plaque sur la scène microscopique. Recouvrir la plaque par la Neue environnement Live Cellchambre de commande environnementale qui est relié avec une alimentation en CO 2 et des capteurs de température. Réglez le thermostat à 37 ° C et le CO 2 à 5%.
- SlideBook logiciel permet la sélection objective entièrement automatisé, la sélection de longueur d'onde et la commutation facile entre les techniques de terrain fluorescents et lumineux. Afin de mettre en place les différents paramètres de commande de focalisation, ouvert SlideBook logiciels> aller à la barre de menu de contrôle> sélectionnez accent, en cliquant sur>
et sélectionnez les paramètres suivants: - Dans la «boîte Objectif," définir l'objectif de la sélection dans le menu déroulant la fenêtre. Notez que nous utilisons un objectif de phase et ont sélectionné manuellement la bague de phase appropriée dans le condenseur. Si vous utilisez un système avec un condenseur automatisé, ce sera automatiquement réglé par l'intermédiaire du logiciel. Alternativement, si ni objectif, ni tourelle du condenseur sont automatisées ceux-ci devraient être sélectionnés de chaque manuelment.
- Dans le "jeu de filtres" boîte:
- Sélectionnez les paramètres pour diriger le faisceau lumineux soit l'oculaire ou un appareil photo à partir du menu déroulant pour voir les filtres disponibles ("live" pour oculaire, "Widefield" pour la caméra dans notre système).
- Sélectionnez le filtre approprié pour fond clair d'éclairage (dans notre jeu en place, cette option est étiqueté «DIC», qui représente une position ouverte pour le trajet de la lumière en fond clair).
- Sélectionnez la source de lumière en cliquant sur "Ouvrir Bright" pour ouvrir l'obturateur sur fond clair.
- Pour voir l'échantillon sous l'oculaire, sélectionnez le filtre à fond clair (position «6» dans notre système) sur la tourelle. Après avoir d'abord visualiser l'échantillon à travers l'oculaire de trouver des champs appropriés et mettre l'échantillon en mise au point (étapes 3.2.1 à 3.2.2.3). Déplacer la tourelle de filtre à changer le trajet de la lumière à la caméra pour la capture d'image (position "1" dans notre système).
- L'étape automatisée permet la sélection des différents XY coordinationTes à capturer plusieurs champs d'intérêt lors de l'acquisition de l'image. Dans le logiciel SlideBook, aller à la commande de focalisation, sélectionnez "XY", sélectionnez différentes positions quoique la pièce des yeux, puis cliquez sur "set point" verrou à chaque endroit de capture d'images (Figure 1).
- Ajustez la mise au point de l'image de la caméra qui est affichée sur l'écran. Cela peut être accompli soit en utilisant les commandes manuelles sur le microscope ou des contrôles informatiques, qui peut ajuster la mise au point par incréments beaucoup plus fines.
- Utilisation des commandes dans le "concentrer les contrôles" fenêtre, ajuster la position z de la scène. Pour de meilleurs résultats, concentrez-vous sur le plat saillies cellulaires près du contact avec la plaque.
- Pour aider à se concentrer utiliser le curseur pour ajuster les temps d'exposition pour être dans une gamme appropriée de se concentrer. Si plusieurs postes XY ont été sélectionnés, la mise au point pour chaque position individuelle: Sous le contrôle accent> XY point de visite>. Note: ceci est fait pour s'assurer, eau champs sont correctement porté pour un aperçu optimal.
- Utilisez le logiciel pour configurer les paramètres fenêtre de capture. En SlideBook, ouvrez la capture en sélectionnant
à partir de la barre de menu. Voir la figure 2. Nous vérifions ensuite les paramètres suivants. - Vérifiez Capture> type laps de temps.
- Vérifiez ensemble Filtre: Large champ: DIC (pour l'image en champ clair).
- "Capture laps de temps" est le nombre de points dans le temps qui va être capturée (elle peut varier, en fonction du type de cellule). Durée est la longueur totale de temps pour l'expérience. Unités de temps [en millisecondes (ms), secondes (s), minutes (M) ou d'heures (h)] peut être sélectionnée dans le menu déroulant.
- «Intervalle» est le délai entre le début d'un point de temps et le début de l'instant suivant. Comme vous le tapez dans deux de ces valeurs, le troisième champ sera calculé automatiquement.
- Multiple capture XY: sélectionnez "multiliste des points "pour plus de 1 position XY.
- Nommez le fichier. Dans l'exemple donné, nous l'avons nommé '231 '.
- Pour éviter l'arrêt inattendu de l'ordinateur en raison de plusieurs images, utilisez l'option «bobine» pour enregistrer le fichier. Il est facultatif, mais il est fortement recommandé. A cet effet, en vertu de la capture contro l> sélectionnez Avancé> Bobine> Capturer à la mémoire et enregistrer dans le fichier spool après chaque points dans le temps. Parcourir l'emplacement pour enregistrer le fichier de carnet d'diapositive (figure 3). Le film a généré peut être importé plus tard de l'endroit désigné. Les étapes de configuration microscope a été résumée dans le fichier 3,1 .
et sélectionnez les paramètres suivants: 
à partir de la barre de menu. Voir la figure 2. Nous vérifions ensuite les paramètres suivants. 4. Traitement de l'image et de l'analyse de la migration: Calcul de la vitesse et le déplacement
Dans cet exemple, le traitement des images se fait par SlideBook 5, 6 5.0 du logiciel. Il existe plusieurs autres programmes tels que ImageJ 7 pour le traitement d'image et de l'analyse.
- Importez les fichiers générés à partir d'images SlideBook de différents domaines à des moments différents. Aller à la barre de menu> sous Image> Importer livre> Diaporama bobine> sélectionner le fichier désiré (figure 4a).
- Voici notre objectif est de suivre le mouvement des cellules individuelles. Il peut être fait en utilisant le suivi automatique ou suivi individuel. Dans l'exemple, nous avons utilisé un suivi manuel, car cela facilite exclure les artefacts facilement, ce qui est plus difficile avec un suivi automatisé.
- Ouvrez le fichier SlideBook, dans laquelle nous devons effectuer un suivi. Sous le menu: Sélectionnez Masque> Protocole de suivi des particules> Protocole de particules manuel de suivi (figure 4b). Une fenêtre apparaîtra avec des points de début et de fin (Figure 4c).
- Begin pour suivre le mouvement de cellules individuelles, en suivant le centre de chaque cellule (noyau). Suivre environ 10 cellules de chaque film et au moins trois films différents doivent être sélectionnés à partir d'emplacements différents de sorte que d'environ 30 cellules seront analysées à partir d'une expérience. Chaque expérience doit être répétée trois fois. Pour permettre une approche impartiale, sélectionnez les cellules à partir de différents endroits tels que certaines cellules de front, middle, etc coins Cliquez sur "OK", une fois le suivi est fait.
- La migration aléatoire peut être analysé en mesurant les changements dans la vitesse, etc, la vitesse ou de déplacement Pour analyser les données, sous le menu> Masque de sélection> Suivi de particules> protocole de suivi des particules. Sélectionnez les paramètres de suivi tel que décrit ci-dessous: (figure 5a):
- Suivre avec - Sélectionnez le paramètre que vous souhaitez suivre à partir de la liste déroulante. Dans cet exemple, nous avons utilisé, centre de la zone (les coordonnées du centre de l'Objet).
- Cliquez sur "suivre et continuer". Une fois que le suivi est terminé, cela va automatiquement passer à l'étape suivante.
- Choisissez les statistiques souhaitées pour chaque chemin, comme le déplacement et la vitesse moyenne (voir figure 5b):
- Vitesse moyenne - la distance totale parcourue divisée par le temps nécessaire pour parcourir cette distance.
- Déplacement Total - la distance totale parcourue par l'objet.
- Cliquez sur "Calculer et continuer» si vous souhaitez passer à l'étape suivante, ou sélectionnez simplement "Calculer" si vous souhaitez consulter vos statistiques, sans passer à l'étape suivante. Un fichier sera généré qui peut être enregistré en tant que fichier texte et peut ensuite être exportées vers Excel.
- Afin de suivre des objets en utilisant le protocole de suivi automatisé, tout d'abord un masque doit être créé.
- Sélectionnez le masque de l'image du segment>> une fenêtre du segment semble> sélectionner jusqu'à ce que seuil est atteint un tel que la SEParating un objet à partir d'autres> cliquez sur Appliquer> OK (voir la figure 5c). L'étape 4.5.1 est la même.
- Supprimer des objets plus petits que - Cochez cette case pour éliminer sélectivement les objets plus petits que la taille donnée. Entrez la taille dans le champ d'édition et choisissez soit microns ou pixels que l'appareil. Il est utilisé pour supprimer les artefacts souvent causés par des débris.
- Mouvement minimum - entrez le nombre minimum de points dans le temps qui doivent être suivis afin de déterminer un chemin.
- Mouvement maximum - Entrer dans le mouvement maximal que vous attendez de n'importe quel objet donné d'un point de temps à l'autre.
- Étapes à suivre pour analyser les données sont les mêmes que le suivi manuel (voir les étapes 4.5.2 à 4.6.2).
5. Les résultats représentatifs
Un exemple d'une analyse de la migration aléatoire, telle que quantifiée en termes de vitesse et de déplacement (figure 6). Après avoir exporté la t fichiero Excel, les données sont tracées à l'aide d'une boîte et l'intrigue moustaches. L'analyse statistique comparant déplacement total et la vitesse moyenne entre le test et le contrôle est effectué en utilisant de Mann-Whitney. L'échantillon d'essai montre une augmentation de la vitesse moyenne par rapport à la commande. L'échantillon d'essai montre une augmentation de la cylindrée totale par rapport à la commande.
Film de contrôle et d'essai: contrôle MDA-MB-231 et le test MDA-MB-231 cellules ont été ensemencées sur du collagène durant la nuit. La vidéo-microscopie time-lapse a été réalisée au microscope Olympus, couplé à une caméra EM-Hamamatsu. Les images sont prises à un intervalle de 1 heure pour un total de 18 heures lors de la migration aléatoire. S'il vous plaît voir le film 1 et Vidéo 2 de la migration aléatoire pour le contrôle et les échantillons d'essai.
Microscope configuration:
Figure 1. Mise en place de multiples points de l'image capturer.
Figure 2. Étapes illustrant le contrôle de capture. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Comment enregistrer plusieurs images.
dflinebreak "> Traitement de l'image et l'analyse de la migration.
La figure 4a. Étapes pour importer l'image pour l'analyse des données.
La figure 4b. Des mesures pour analyser les données en utilisant le protocole de suivi des particules.
Figure 4c. Longueur de chemin de fenêtre représentant de particules à chenilles.
Etapes de l'analyse des données.
La figure 5a. Étapes décrivant les paramètres de protocole de suivi de particules.
La figure 5b. Sélection des statistiques de chemin pour être analysé.
Figure 5c. Les étapes pour créer un masque pour le protocole de suivi automatisé.
Figure 6. La vitesse moyenne (Figure6a) et le déplacement (Figure 6b) est tracée dans un complot moustaches. L'échantillon d'essai montre une augmentation de la vitesse et le déplacement comme comparer à contrôler.
Films
Film 1. La migration des cellules de contrôle. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 2. La migration des cellules de test. Cliquez ici pour voir le film .
Contrôle MDA-MB-231 et le test MDA-MB-231 cellules ont été ensemencées à faible densité de collagène sur pour la nuit. La vidéo-microscopie time-lapse a été réalisée au microscope Olympus, couplé à une caméra EM-Hamamatsu. Les images sont prises à un intervalle de 1 heure pendant 18 heures lors de la migration aléatoire. S'il vous plaît voir les films de la migration aléatoire pour le contrôle et d'essai.
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Discussion
Le dosage en temps réel la migration aléatoire permet précis, sensible, l'analyse des paramètres de migration cellulaires tels que la vitesse et le déplacement. Cette méthode n'est pas limitée à la valeur finale de mesure de point, donc il est plus quantitative. Depuis, les cellules sont surveillés en milieu DMEM avec du sérum normal de; il réduit l'effet délétère de plus d'incubation dans le sérum des médias libres. Il a été montré que la migration des cellules dépend de la mise en forme et la rupture des contacts cellulaires avec le substrat 8, par conséquent, cette méthode pourrait être utilisée pour étudier l'effet de différents substrats sur la migration.
Une des étapes critiques implique un contrôle adéquat de la température à 37 ° C et le CO 2 à 5% pour assurer une migration optimale. Le test permet une certaine souplesse pour surveiller les réponses migratoires à des points de temps désirés, mais il peut exiger d'optimiser le nombre de points dans le temps. Par exemple, certaines cellules ayant les taux de migration plus faibles peuvent être surveillés pendant une longer temps par rapport à des cellules ayant les taux de migration plus élevés.
Le microenvironnement de la tumeur est l'un des facteurs cruciaux dans la cancérogenèse. Le cancer résulte de l'interaction des cellules tumorales avec les cellules environnantes telles que les cellules endothéliales, stromales et les cellules inflammatoires 9. Ce test peut être modifié pour étudier comment la migration des cellules tumorales sont influencés par le microenvironnement. Une des façons dont il peut être atteint est d'étudier la migration des cellules tumorales marquées par fluorescence cultivés dans une population mixte de cellules différentes telles que les cellules endothéliales et stomies. Cette méthode peut également être utilisé pour étudier la cicatrisation en temps réel.
Time-lapse microscopie pourrait être modifié pour suivre l'invasion des cellules, la division cellulaire, l'apoptose et de la dynamique et la dynamique lamellipodial d'adhésion focale utilisant des lentilles à plus haute résolution.
Une des limites de cette méthode est qu'elle ne permet pas le suivi de la migrationtion in vivo. Comme il n'y a aucun équipement disponible qui permet de mesurer la migration en temps réel dans le corps, ce type de dosage n'est pas adapté à la migration in vivo. Il ne nous permettent pas d'élucider les mécanismes biochimiques et éléments de signalisation qui sont importantes dans la migration cellulaire. Afin de répondre à des voies de signalisation, il est essentiel d'effectuer des expériences biochimiques. Voir les références pour les groupes qui ont utilisé cette méthode pour la migration aléatoire 6, 10-14.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Amanda Struckhoff pour l'aide initiale avec l'expérience. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH 5RO1CA115706.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus Corporation | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior Scientific | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
References
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