Summary
Este método permite la monitorización de las células en tiempo real y las mediciones cuantitativas de los diferentes parámetros de la migración, como la velocidad, el desplazamiento y la velocidad. A diferencia de los métodos tradicionales, este enfoque en tiempo real no se basa en las mediciones cuantitativas de migración de punto final, sino que permite el seguimiento y el cálculo de diferentes parámetros de forma continua.
Abstract
La migración celular es un proceso dinámico, que es importante para el desarrollo embrionario, la reparación de tejidos, la función del sistema inmune, y la invasión tumoral de 1, 2. Durante la migración direccional, las células se mueven rápidamente en respuesta a una señal quimiotáctica extracelular, o en respuesta a las señales intrínsecas 3 proporcionados por la maquinaria motilidad de base. La migración al azar se produce cuando una célula posee direccionalidad intrínseca baja, permitiendo que las células de explorar su medio ambiente local.
Migración celular es un proceso complejo, en la celda de la respuesta inicial se somete a la polarización y se extiende protuberancias en la dirección de migración 2. Los métodos tradicionales para medir la migración tal como el ensayo de migración de Boyden cámara es un método sencillo para medir la quimiotaxis in vitro, que permite medir la migración como un resultado punto final. Sin embargo, este enfoque no permite la medición de los parámetros individuales de migración, ni permite que Visualización de los cambios morfológicos que sufre durante la migración celular.
A continuación, presentamos un método que nos permite monitorear la migración de células en tiempo real mediante video - microscopía de lapso de tiempo. Dado que la migración celular y la invasión son el sello distintivo del cáncer, este método será de aplicación en el estudio de la migración de las células cancerosas y la invasión in vitro. Migración aleatoria de las plaquetas se ha considerado como uno de los parámetros de la función plaquetaria 4, por lo tanto, este método también podría ser útil en el estudio de las funciones plaquetarias. Este ensayo tiene la ventaja de ser rápido, reproducible, fiable y no requiere la optimización del número de células. Con el fin de mantener las condiciones fisiológicamente adecuados para las células, el microscopio está equipado con CO 2 de suministro y el termostato de la temperatura. Movimiento de las células es controlado por la toma de fotografías con una cámara instalada en el microscopio, a intervalos regulares. Migración de la célula puede ser calculado por la medición de velocidad media y unael desplazamiento PROMEDIO, que se calcula por el software Slidebook.
Protocol
1. Preparación de la placa recubierta de colágeno
- Diluir colágeno a una concentración final de 10 mg / ml en medio Opti-Mem medios.
- Escudo 6 y placas con colágeno, mediante la adición de 1,5 ml de la etapa 1 a cada pocillo. Incubar toda la noche a 4 ° C.
- Al día siguiente, se lava la placa 2 veces con fosfato 1x buffer salino (PBS) y almacenarlos en PBS.
2. Preparación y la siembra de células en una placa de 6 pocillos
Nota: Utilizar los medios cálidos y PBS para garantizar las condiciones óptimas para el movimiento celular
- Crecer MDA-MB-231 (un cáncer invasivo de mama línea celular) escasamente en Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) con fetal al 10% de suero bovino (FBS). En este ejemplo, se utiliza el MDA-MB-231, sin embargo, este método puede ser aplicado a todas las líneas de células adherentes cancerosas y no cancerosas.
- Lave las células dos veces con PBS caliente 1x y cobrar por tripsinización. Revise las células bajo un microscopio para hacer Sure que las células estén debidamente separados por tratamiento con tripsina.
- Recoger las células mediante la adición de medio DMEM con FBS al 10%, de girar suavemente las células a 1000 g durante 5 minutos. Resuspender el sedimento celular suavemente en medio DMEM con FBS al 10%.
- Romper el pellet de células pipeteando arriba y hacia abajo con suavidad. Es importante para romper grupos de células en células individuales tanto como sea posible.
- Cuenta las células y se diluye hasta una concentración final de 50.000 células / ml en medio DMEM con FBS al 10%. Dispensar 2 ml en cada pocillo.
- Incubar la placa a 37 ° C en un incubador de cultivo de tejido durante la noche, hasta que empiece la microscopía de lapso de tiempo.
- Para asegurar un amplio espacio para la migración, crear una herida utilizando una punta de pipeta, lavar la placa con 1X PBS para eliminar los desechos (formado como resultado de la herida) y añadir DMEM con FBS al 10%. Revise debajo del microscopio para detectar células flotantes. Si un gran número de células son flotantes, repita el procedimiento de lavado. Ahora, la placa está lista para ser montado en elmicroscopio para la adquisición de la imagen.
3. Microscopio de instalación y adquisición de imágenes automatizada
Hay varios paquetes de software de imagen que controlan el microscopio para la adquisición de imagen automatizado. Aquí, nosotros usamos Slidebook 5,0 software de imágenes y adquisiciones automáticas se realizan en un microscopio Olympus (Olympus IX81), acoplado a una cámara de EM-Hamamatsu C9100, que es excelente para células vivas, las aplicaciones donde la velocidad de adquisición y fototoxicidad mínima es de suma importancia. El sistema incluye una etapa superior de la cámara de control ambiental (Neue células vivas) y un sistema automatizado de control XY etapa (Antes Proscan). Las imágenes se adquieren con un 10 veces UPLANFL Ph1/0.30 objetivo, en el modo de campo claro, con un intervalo de tiempo definido. El siguiente protocolo describe la adquisición de la imagen.
- Encienda el microscopio, la cámara, y un aparato celular en vivo de imágenes. Coloque la placa sobre la fase microscópica. Cubrir la placa por el entorno de la célula Neue vivoambiental cámara de control, que está conectado con una fuente de CO 2 y sensores de temperatura. Ajuste el termostato a 37 ° C y el CO 2 al 5%.
- SlideBook software permite la selección objetiva completamente automatizada, la selección de longitud de onda y cambiar fácilmente entre las técnicas de campo fluorescentes y brillantes. Con el fin de configurar los diferentes parámetros de control de enfoque, de software libre SlideBook> ir a la barra de menú de control> centro de selección, haciendo clic>
y seleccionar los parámetros siguientes: - En el "cuadro de objetivos", definir el objetivo por la selección de la ventana desplegable. Tenga en cuenta que estamos utilizando un objetivo de la fase y han seleccionado manualmente el anillo de fase apropiada en el condensador. Si se utiliza un sistema con un condensador automatizado, esto se ajusta automáticamente a través del programa de software. Alternativamente, si no porta objetivos, ni del condensador se automatizan estos deben ser seleccionados de cada manual demente.
- En el "Set Filter":
- Seleccione los ajustes para dirigir la trayectoria de la luz ya sea el ocular o la cámara en el menú desplegable para ver los filtros disponibles ("en vivo" para el ocular, "campo amplio" para la cámara en nuestro sistema).
- Seleccione el filtro adecuado para iluminación de campo claro (en la puesta en marcha, esta opción tiene la etiqueta "DIC", que representa una posición abierta para el paso de luz claro).
- Seleccione la fuente de luz, haga clic en "Abrir brillante" para abrir el obturador de campo claro.
- Para ver la muestra en el ocular, seleccione el filtro de campo claro (posición "6" en nuestro sistema) en la torreta. Después de comenzar a ver la muestra a través del ocular para encontrar campos correspondientes y llevar la muestra en el foco (pasos 3.2.1 a 3.2.2.3). Mueva la torre de filtro para cambiar la trayectoria de la luz a la cámara para la captura de la imagen (la posición "1" en nuestro sistema).
- La etapa automatizado permite la selección de diferentes coordinación XYTes para capturar varios campos de interés durante la adquisición de la imagen. En el software SlideBook, vaya al control de enfoque, seleccione "XY", seleccione diferentes posiciones aunque el ocular, a continuación, haga clic en "set point" de bloqueo en cada lugar de la captura de imágenes (Figura 1).
- Ajuste el foco de la imagen de la cámara que se visualiza en la pantalla. Esto se puede lograr ya sea usando los controles manuales en el microscopio o los controles de ordenador, que puede ajustar el enfoque en incrementos mucho más finos.
- Uso de los controles en el "orientar los controles" de la ventana, ajustar la posición z de la etapa. Para obtener los mejores resultados, se centran en planos protuberancias celulares cerca del contacto con la placa.
- Para ayudar a enfocar utilizar el control deslizante para ajustar los tiempos de exposición a estar en un rango apropiado para el enfoque. Si hay varias posiciones XY han sido seleccionados, ajustar el enfoque para cada posición individual: Bajo el control de foco> XY punto de visita>. Nota: esto se hace para asegurarse de que, then los campos están correctamente enfocado para una instantánea óptima.
- Utilice el software para configurar los parámetros de captura de la ventana. En SlideBook, abra la captura por parte de la selección
la barra de menús. Véase la Figura 2. A continuación, compruebe los siguientes parámetros. - Compruebe Captura> tipo como lapso de tiempo.
- Revisión del filtro de serie: campo amplio: DIC (para la imagen de campo claro).
- "Tiempo transcurrido captura" es el número de puntos de tiempo que va a ser capturado (que puede variar, dependiendo del tipo de célula). La duración es la duración total del tiempo para el experimento. Unidades de tiempo [en milisegundos (ms), segundos (s), minutos (m) u horas (h)] se puede seleccionar en el menú desplegable.
- "Intervalo" es el retraso entre el inicio de un punto de tiempo y el comienzo del punto de tiempo siguiente. A medida que escribe en dos de estos valores, el tercer campo se calculará automáticamente.
- Múltiple captura XY: Seleccione "multilista de puntos "para la posición XY más de 1.
- Nombre del archivo. En el ejemplo dado, lo hemos llamado '231 '.
- Para evitar el inesperado cierre de la computadora debido a varias imágenes, utilice la "opción del carrete" para guardar el archivo. Es opcional, sin embargo es altamente recomendable. Para ello, en virtud de la captura de contro l> seleccione Opciones avanzadas> Carrete> Capturar a la memoria y guardar en el archivo de cola después de cada punto de tiempo. Navegar por la ubicación para guardar el archivo de libreta de diapositiva (Figura 3). La película generada puede ser importado más tarde desde el lugar designado. Pasos de configuración del microscopio se ha resumido en el archivo 3.1 .
y seleccionar los parámetros siguientes: 
la barra de menús. Véase la Figura 2. A continuación, compruebe los siguientes parámetros. 4. Procesamiento de imágenes y análisis de la migración: Cálculo de la velocidad y desplazamiento
En este ejemplo, el procesamiento de imágenes se realiza por SlideBook 5, 6 5.0. Hay varios otros programas, como ImageJ 7 para el procesamiento de imágenes y análisis.
- Importe los archivos generados a partir de SlideBook imágenes de campos diferentes en diversos puntos temporales. Ir a la barra de menú> en Imagen> Importar> libro de diapositivas cola> seleccione el archivo deseado (Figura 4a).
- Aquí nuestro objetivo es seguir el movimiento de las células individuales. Se puede hacer mediante el seguimiento automático o de seguimiento individual. En el ejemplo, hemos utilizado seguimiento manual, ya que esto facilita descartar artefactos fácilmente, lo que es más difícil con seguimiento automático.
- Abra el archivo SlideBook, en el que tenemos que realizar un seguimiento. En el menú: Select Mask> Protocolo de rastreo de partículas> Protocolo de partículas manual de seguimiento (Figura 4b). Aparecerá una ventana con los puntos de tiempo de inicio y fin (Figura 4C).
- Begin para seguir el movimiento de las células individuales haciendo clic en el centro de cada célula (núcleo). Realizar un seguimiento de aproximadamente 10 células de cada película y al menos tres películas diferentes deben ser seleccionados de diferentes lugares, para que aproximadamente 30 células se analizará desde un experimento. Cada experimento se repitió tres veces. Para permitir un enfoque imparcial, seleccione las celdas de diferentes lugares, como algunas células de la parte frontal, media, etc esquinas Haga clic en "Aceptar", una vez que se realiza el seguimiento.
- La migración al azar puede ser analizado mediante la medición de los cambios en la velocidad, etc, la velocidad o el desplazamiento Para analizar los datos, bajo el menú> Select Mask> rastreo de partículas> protocolo de seguimiento de partículas. Seleccione parámetros de seguimiento como se describe, a continuación: (Figura 5a):
- Pista con - Seleccione el parámetro que desea seguir en la lista desplegable. En este ejemplo, hemos utilizado, el centro del área (las coordenadas del centro de la Obproyecto).
- Haga clic en "seguir y seguir". Una vez que el seguimiento se ha completado, este avanzará automáticamente a la siguiente etapa.
- Seleccione las estadísticas deseadas para cada ruta, como el desplazamiento y la velocidad media (ver Figura 5b):
- Promedio de velocidad - la distancia total recorrida dividida por el tiempo necesario para recorrer esa distancia.
- Desplazamiento total - la distancia total recorrida por el objeto.
- Haga clic en "Calcular y continuar" si desea pasar a la etapa siguiente, o simplemente seleccionar "Calcular" si desea ver las estadísticas sin tener que ir al siguiente paso. Un archivo que se genera se pueden guardar como archivo de texto y más tarde se pueden exportar a Excel.
- Con el fin de realizar un seguimiento de los objetos que utilizan un protocolo de seguimiento automatizado, en primer lugar una máscara tiene que ser creado.
- Seleccione la máscara de la imagen> Segmento> una ventana del segmento parece> seleccionar hasta que se alcanza el umbral de tal manera que septiembrearating un objeto a partir de otros> haga clic en Aplicar> Aceptar (vea la Figura 5c). Paso 4.5.1 es el mismo.
- Eliminar objetos más pequeños que - Marque esta casilla para eliminar de forma selectiva los objetos más pequeños que un determinado tamaño. Introduzca el tamaño en el campo de edición y elija micras o píxeles como unidad. Esto se utiliza para eliminar artefactos frecuencia causados por los desechos.
- Movimiento mínimo - introduzca el número mínimo de puntos de tiempo que debe ser rastreados para determinar una ruta de acceso.
- Movimiento máximo - Entrar en el movimiento máximo que puede esperar de un objeto dado desde el punto de tiempo de uno a otro.
- Pasos para analizar los datos son los mismos que el seguimiento manual (ver los pasos a 4.5.2 4.6.2).
5. Los resultados representativos
Un ejemplo de un análisis de la migración al azar como se cuantifica en términos de velocidad y desplazamiento (Figura 6). Después de exportar el archivo de to Excel, los datos se representa mediante un cuadro de bigotes y la trama. El análisis estadístico comparando el desplazamiento total y la velocidad media entre la prueba y el control se realiza a través de Mann-Whitney. La muestra de ensayo muestra un aumento de la velocidad media, en comparación con el control. La muestra de ensayo muestra un incremento de desplazamiento total en comparación con el control.
Película de control y de prueba: Control de la MDA-MB-231 y la prueba de la MDA-MB-231 células fueron sembradas en el colágeno durante la noche. Lapso de tiempo microscopía de vídeo se realizó mediante microscopio Olympus, acoplado a una cámara EM-Hamamatsu. Las imágenes son tomadas en un intervalo de 1 hora para un total de 18 horas durante la migración al azar. Por favor, vea la película y una película de 2 de migración al azar para el control y las muestras de ensayo.
Microscopio de configuración:
Figura 1. Configuración de múltiples puntos de la imagen capturar.
Figura 2. Pasos que representan el control de la captura. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 3. Cómo guardar varias imágenes.
dflinebreak "> Tratamiento de imágenes y análisis de la migración.
La figura 4a. Pasos para importar la imagen para el análisis de datos.
Figura 4b. Pasos para analizar los datos utilizando el protocolo de rastreo de partículas.
Figura 4C. Ventana que representa longitud de trayectoria de las partículas sometidas a seguimiento.
Pasos de análisis de datos.
Figura 5a. Pasos que representan los parámetros de protocolo de partícula de seguimiento.
Figura 5b. Selección de las estadísticas de ruta a analizar.
Figura 5c. Los pasos para crear la máscara para el protocolo de seguimiento automatizado.
Figura 6. La velocidad media (Figura6a) y el desplazamiento (Figura 6b) se representa en una parcela de bigotes. La muestra de ensayo muestra un incremento de la velocidad y el desplazamiento como comparar a controlar.
Cine
Película 1. La migración de las células de control. Haga clic aquí para ver la película .
Película 2. La migración de las células de prueba. Haga clic aquí para ver la película .
Control de la MDA-MB-231 y la prueba de la MDA-MB-231 células fueron sembradas con baja densidad de colágeno para pasar la noche. Lapso de tiempo microscopía de vídeo se realizó mediante microscopio Olympus, acoplado a una cámara EM-Hamamatsu. Las imágenes son tomadas en un intervalo de una hora durante 18 horas durante la migración al azar. Por favor, vea las películas de la migración al azar para el control y prueba.
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Discussion
El ensayo de tiempo real la migración al azar permite precisa, el análisis sensible, de los parámetros de la migración de células tales como la velocidad y el desplazamiento. Este método no se limita a terminar valor del punto de medición, por lo que es más cuantitativo. Puesto que, las células se controlan en condiciones normales de medio DMEM con suero, reduce el efecto deletéreo de incubación más largo en medio libre de suero. Se ha demostrado que la migración de las células depende de el formato y romper los contactos de células con el sustrato 8, por lo tanto, este método podría ser utilizado para estudiar el efecto de diferentes sustratos sobre la migración.
Uno de los pasos críticos implica un control adecuado de la temperatura a 37 ° C y CO 2 a 5% para asegurar la migración óptima. El ensayo permite flexibilidad para controlar la respuesta migratoria en puntos de tiempo deseados, sin embargo, puede requerir optimizar el número de puntos de tiempo. Por ejemplo, algunas células que tienen menores tasas de migración que tenga que ser vigilado por un henger tiempo en comparación con células que tienen mayores índices de migración.
El microambiente del tumor es uno de los factores cruciales en la carcinogénesis. El cáncer resulta de la interacción de las células tumorales con las células circundantes, tales como las células endoteliales, estroma y células inflamatorias 9. Este ensayo puede modificarse para estudiar cómo la migración de las células tumorales son influenciadas por el microambiente. Una de las maneras en las que se puede lograr es mediante el estudio de la migración de las células marcadas fluorescentemente tumorales cultivadas en una población mixta de células diferentes, tales como células endoteliales y estoma. Este método también puede ser utilizado para estudiar la curación de heridas en tiempo real.
Time-lapse microscopía podría ser modificado para controlar la invasión de células, la división celular, la apoptosis y la dinámica lamellipodial y la dinámica de adhesión focal usando lentes de mayor resolución.
Una de las limitaciones de este método es que no permite el seguimiento de la migraciónción in vivo. Puesto que no hay equipo disponible que se puede medir la migración en tiempo real en el cuerpo, este tipo de ensayo no es adecuado para la migración en vivo. Asimismo, no nos permiten elucidar el mecanismo bioquímico y componentes de señalización que son importantes en la migración celular. Para hacer frente a las vías de señalización, es esencial para llevar a cabo experimentos bioquímicos. Véanse las referencias de los grupos que han utilizado este método para la migración al azar 6, 10-14.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Amanda Struckhoff para la ayuda inicial con el experimento. Este trabajo fue apoyado por una beca del NIH 5RO1CA115706.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus Corporation | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior Scientific | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
References
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