Kvantitativ analys av Random migration av celler med Time-lapse video Mikroskopi

Summary

Denna metod tillåter övervakning av celler i realtid och kvantitativa mätningar av olika parametrar cellmigrering såsom hastighet, förskjutning, och hastighet. Till skillnad från de traditionella metoderna, är detta realtid strategi inte bygger på endpoint kvantitativa migration mätningar, utan den ger övervaka och beräkna olika parametrar kontinuerligt.

Abstract

Cellmigration är en dynamisk process, som är viktig för embryonal utveckling, vävnadsreparation, immunsystemets funktion, och tumörinvasion ^{1, 2.} Under riktad migration celler rör sig snabbt som svar på en extracellulär kemotaktisk signal eller som svar på inre signaler ³ tillhandahålls av den grundläggande rörlighet maskiner. Random migration uppstår när en cell har låg inneboende riktning, vilket gör att cellerna att utforska sin närmiljö.

Cell migration är en komplicerad process, i det initiala svaret cellen genomgår polarisering och sträcker sig utskjutande i riktning mot migration ^2. Traditionella metoder för att mäta migrationen såsom Boydenkammare migrering analys är en enkel metod för att mäta kemotaxi in vitro, vilket möjliggör mätning av migrering som en slutpunkt resultat. Men gör detta tillvägagångssätt inte mätning av individuella migration parametrar inte heller möjligt att visuanyttjande av morfologiska förändringar som cellen genomgår under flyttningen.

Här presenterar vi en metod som tillåter oss att övervaka migrerande celler i realtid med hjälp av video - tidsförloppet mikroskopi. Eftersom cellen migration och invasion är kännetecken av cancer, kommer denna metod tillämpas för att studera migration cancercell och invasion in vitro. Slumpmässig migrering av blodplättar har betraktats som en av parametrarna av trombocytfunktionen ^4, och därför denna metod kan också vara till hjälp för att studera blodplättar funktioner. Denna analys har fördelen av att vara snabb, tillförlitlig, reproducerbar, och kräver inte en optimering av cellantal. För att upprätthålla fysiologiskt lämpliga betingelser för celler, är mikroskop utrustat _med CO2 tillförsel och temperatur termostat. Cellrörelse övervakas genom fotografering med en kamera monterad på mikroskopet vid regelbundna intervall. Cellmigration kan beräknas genom mätning av genomsnittlig hastighet och enverage förskjutning, som beräknas genom Slidebook mjukvara.

Protocol

1. Framställning av platta belagd med kollagen

1. Späd kollagen till en slutlig koncentration av 10 pg / ml i Opti-MEM-medium.
2. Kappa plattor med 6 brunnar med kollagen, genom tillsats av 1,5 ml från steg 1 till varje brunn. Inkubera över natten vid 4 ° C.
3. På följande dag, tvätta plattan 2 gånger med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och lagra dem i PBS.

2. Cellberedning och sådd på ett 6-brunnars platta

Obs: Använd varma media och PBS för att säkerställa optimala förhållanden för cellrörelse

1. Växa MDA-MB-231 (en invasiv bröstcancer-cellinje) glest i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS). I detta exempel använder vi MDA-MB-231, men kan denna metod tillämpas på alla vidhäftande cancer och icke cancer cellinjer.
2. Tvätta celler två gånger med varm 1 x PBS och uppsamlades genom trypsinisering. Kontrollera celler under ett mikroskop för att suär att cellerna ordentligt avlägsnas genom trypsinbehandling.
3. Samla upp cellerna genom tillsats av DMEM-medium med 10% FBS, försiktigt rotera ned cellerna vid 1000 g under 5 minuter. Resuspendera cellpelleten försiktigt i DMEM-medium med 10% FBS.
4. Bryt cellpelleten genom att pipettera upp och ned försiktigt. Det är viktigt att bryta ned cellkluster i individuella celler så mycket som möjligt.
5. Räkna cellerna och späd till en slutlig koncentration av 50.000 celler per ml i DMEM-medium med 10% FBS. Dispensera 2 ml i varje brunn.
6. Inkubera plattan vid 37 ° C i en vävnadsodlings-inkubator över natten, tills startar tidsförlopp mikroskopi.
7. För att säkerställa gott om utrymme för migrering, skapar ett sår med användning av en pipettspets, tvätta plattan med 1 x PBS för att avlägsna skräp (bildad som ett resultat av sår) och tillsätt DMEM med 10% FBS. Kolla under mikroskop för flytande celler. Om ett stort antal celler är flytande, upprepa tvättförfarandet. Nu är plattan klar att ställas in påmikroskop för bild förvärvet.

3. Mikroskop Setup och automatisk Image Acquisition

Det finns flera imaging mjukvarupaket som styr mikroskop för automatisk bilden förvärvet. Här använder vi Slidebook 5,0 bildbehandlingsprogram och automatiska förvärv utförs på ett Olympus mikroskop (Olympus IX81), kopplad till en EM-Hamamatsu C9100 kamera, vilket är utmärkt för live-cell tillämpningar där snabbhet av förvärv och minimal fototoxicitet är av största vikt. Systemet innefattar en fas övre miljökontroll kammare (Neue levande cell) och en automatiserad XY-planet styrenheten (känd ProScan). Bilder förvärvas med 10x UPLANFL Ph1/0.30 mål i ljusa fält läge, med en definierad tidsintervall. Följande protokoll beskriver det bildinsamlande.

1. Slå på mikroskop, kamera och levande cell imaging apparat. Placera plattan över den mikroskopiska scenen. Täck plattan med Neue levande cell miljöjömässiga styrkammaren, som är förbunden med en _CO-2 tillförsel-och temperatursensorer. Ställ in termostaten på 37 ° C och CO ₂ på 5%.
2. SlideBook programvara gör det möjligt helautomatiska objektivt urvalsförfarande, våglängd och enkel växling mellan fluorescerande och ljusa fält tekniker. För att ställa in olika parametrar för fokusstyrning, öppen SlideBook mjukvara> gå till menyraden> välj fokusstyrning genom att klicka> och väljer följande parametrar:
   1. I "Mål rutan" definierar målet genom ett urval rullgardinsmenyn fönster. Notera att vi använder en fas objektiv och har manuellt valt rätt fasen ringen i kondensorn. Om du använder ett system med en automatiserad kondensor, kommer detta automatiskt in via programmet. Alternativt, om varken objektiv tornet eller kondensorn är automatiserade dessa bör varje väljas manuelltly.
   2. I "Filter Set" box:
      1. Välj inställningar för att rikta ljuset vägen till antingen okularet eller kameran från rullgardinsmenyn för att se tillgängliga filter ("Live" för okular, "Widefield" för Camera i vårt system).
      2. Välj lämplig filter för brightfield belysning (i vårt set up, det här alternativet märkt "DIC", som representerar en öppen position för brightfield ljusstrålen).
      3. Välj ljuskällan genom att klicka på "Öppna Bright" för att öppna den ljusa fältet slutaren.
3. För att visa prov under okularet, välj ljusa fältet filtret (läge "6" i vårt system) på tornet. Efter att först titta på provet genom okularet att hitta lämpliga fält och föra provet i fokus (steg 3.2.1 till 3.2.2.3). Flytta filtret tornet för att ändra ljusets väg till kameran för fotografering (läge "1" i vårt system).
4. Den automatiserade steget möjliggör val av olika XY samordninganmärkningarna till fånga flera intresseområden under bilden förvärvet. I SlideBook programvara, gå till fokusstyrning, välj "XY", välj olika positioner om de okularet, klicka sedan på "börvärde" lock i varje läge för fotografering (figur 1).
5. Fininställa fokus kamerabilden som visas på skärmen. Detta kan åstadkommas genom att antingen använda de manuella kontrollerna på mikroskop eller kontrollerna dator, vilken kan justera fokus i mycket finare steg.
6. Använda kontroller i "Focus Controls" fönster, justera Z-position på scenen. För bästa resultat, fokusera på plana cellulära utsprång nära kontakt med plattan.
7. För att underlätta med fokus använd skjutreglaget för att justera exponeringen gånger för att vara i en rad för fokusering. Om flera XY positioner har valts, justera fokus för varje enskild position: Under fokusstyrning> XY> Besök punkt. OBS: detta görs för att se, thpå fält är rätt fokuserad för en optimal bild.
8. Använda programvaran för att ställa in parametrar fånga fönster. I SlideBook öppnar avskiljning genom att välja från menyraden. Se figur 2. Vi kontrollerar då följande parametrar.
   1. Kontrollera Fånga typ> som tiden förflutit.
   2. Kontrollera Filter set: Wide område: DIC (för ljusa fält bild).
   3. "Tid förflutit infångning" är antalet tidpunkter som kommer att fångas (den kan variera beroende på celltypen). Varaktighet är den totala längden av tid för experimentet. Enheter av tid [i millisekunder (ms), sekunder (s), minuter (m) eller timmar (h)] kan väljas från rullgardinsmenyn.
   4. "Intervall" är fördröjningen mellan början av en tidpunkt och i början av nästa tidpunkt. När du skriver i två av dessa värden kommer tredje fältet beräknas automatiskt.
   5. Flera XY capture: välj "multipunkten lista "i mer än 1 XY position.
   6. Namnge filen. I det givna exemplet har vi kallade den '231 '.
9. För att undvika oväntade stänga av datorn på grund av flera bilder, använda "spolen alternativet" för att spara filen. Det är valfritt, men det rekommenderas starkt. För detta ändamål, under infångande kontroversiell l> välj Avancerat> Spool> Ta med minnet och spara till spolen filen efter varje tidpunkter. Bläddra platsen för att spara filen bilden boken (Figur 3). Den genererade Filmen kan importeras senare från den angivna platsen. Steg för mikroskop inställning har sammanfattats i filen 3,1 .

4. Bildbehandling och analys av migration: Beräkning av varvtal och deplacement

I detta exempel är bildbehandling görs genom SlideBook ^{5, 6} 5,0 programvara. Det finns flera andra program, såsom ImageJ ⁷ för bildbehandling och-analys.

1. Importera SlideBook filer som genereras från bilder av olika områden vid olika tidpunkter. Gå till menyraden> under Bild> Importera> Bild boken spolen> välj önskad fil (Figur 4a).
2. Här vårt mål är att följa utvecklingen av enskilda celler. Det kan göras med hjälp av automatiserad spårning eller individuell spårning. I exemplet har vi använt manuella spårning, eftersom detta underlättar att utesluta artefakter lätt, vilket är svårare med automatiserad spårning.
3. Öppna SlideBook filen, där vi måste utföra spårning. Under menyn: Välj Mask> Particle Tracking protokollet> Manuell Particle Tracking Protocol (figur 4b). Ett fönster visas med start och slut tidpunkter (figur 4c).
4. Begin för att spåra rörelsen av enskilda celler genom att klicka på centrum av varje cell (kärna). Spåra ca 10 celler från varje film och minst tre olika filmer bör väljas från olika ställen så att ungefär 30 celler som ska analyseras ur ett experiment. Varje experiment bör upprepas tre gånger. För att möjliggöra en objektiv metod att välja celler från olika platser, t.ex. vissa celler från front, mitten, hörn etc. Klicka på "OK", en gång spårning görs.
5. Random migration kan analyseras genom att mäta förändringar i hastighet, hastighet eller förskjutning etc. För att analysera data, under menyn> välj masken> partikel spårning> partikel spårning protokoll. Välja spårning parametrar såsom beskrivs nedan: (Figur 5a):
   1. Spåra med - Välj den parameter som du vill spåra i listrutan. I detta exempel har vi använt, Center of Area (koordinaterna för centrum av ObJect).
   2. Klicka på "spåra och fortsätta". När spårning är klar kommer detta gå automatiskt till nästa steg.
6. Välja önskade statistiken för varje bana, såsom förskjutning och den genomsnittliga hastigheten (se fig 5b):
   1. Medelhastighet - den sammanlagda sträcka delat med den tid som krävs för att resa denna sträcka.
   2. Totalt Deplacement - den sammanlagda sträcka av objektet.
   3. Klicka på "Beräkna och Fortsätt" om du vill gå vidare till nästa steg, eller helt enkelt välja "Beräkna" om du vill se din statistik utan att gå till nästa steg. En fil kommer att skapas som kan sparas som textfil och kan senare exporteras till Excel.
7. För att spåra objekt med automatisk spårning protokoll måste först en mask som ska skapas.
   1. Välj Mask> Segment Bild> ett segment fönster verkar> markera tills tröskeln uppnås så att septemberarating ett objekt från andra> klicka på Verkställ> OK (se figur 5c). Steg 4.5.1 är densamma.
   2. Ta bort objekt mindre än - Markera rutan för att selektivt ta bort objekt mindre än en viss storlek. Ange storlek i textfältet och välj antingen mikron eller pixlar som enhet. Detta används för att avlägsna artefakter som ofta orsakas av skräp.
   3. Minsta rörelse - ange det minsta antal tidpunkter som måste spåras för att bestämma en väg.
   4. Maximal rörelse - Ange högsta rörelse som du förväntar dig från en viss objekt från en tidpunkt till nästa.
   5. Åtgärder för att analysera data är samma som manuell spårning (se stegen 4.5.2 till 4.6.2).

5. Representativa resultat

Ett exempel på en slumpmässig migration analys kvantifieras som i fråga om snabbhet och förskjutning (Figur 6). När du har exporterat filen to Excel data ritas med hjälp av en låda och morrhår tomt. Statistisk analys som jämför total förskjutning och den genomsnittliga hastigheten mellan test och kontroll utförs med användning av Mann-Whitney-testet. Testprovet visar en ökning i den genomsnittliga hastigheten jämfört med kontrollen. Testprovet visar en ökning i total förskjutning jämfört med kontrollen.

Film av kontroll och test: Kontroll MDA-MB-231 och test-MDA-MB-231-celler såddes på kollagen över natten. Tidsförlopp video mikroskopi utfördes genom Olympus mikroskop, som är kopplad till en EM-Hamamatsu kamera. Bilder tas vid ett intervall av 1 timme under sammanlagt 18 timmar under slumpmässig migrering. Se film 1 och Film 2 av slumpmässig migration för kontroll och prov test.

Mikroskop setup:

Figur 1. Ställa in flera punkter för bild fånga.

Figur 2. Steg skildrar fånga kontroll. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Hur spara flera bilder.

dflinebreak "> Bildbehandling och analys av migration.

Figur 4a. Åtgärder för att importera bilden för dataanalys.

Figur 4b. Åtgärder för att analysera data med partikel tracking-protokollet.

Figur 4c. Fönster som visar vägen längd spårade partiklar.

Steg för dataanalys.

Figur 5a. Steg som visar parametrar partikel spårning protokoll.

Figur 5b. Val av väg statistik som skall analyseras.

Figur 5c. Steg för att skapa mask för automatiserad spårning protokollet.

Figur 6. Medelhastighet (Figur6a) och förskjutning (figur 6b) är plottad i en hårkristaller kurva. Provet visar en ökning av hastighet och förskjutning som jämför att styra.

Filmer

Film 1. Migration av kontroll celler. Klicka här för att se filmen .

Film 2. Migration av test cellerna. Klicka här för att se filmen .

Kontroll-MDA-MB-231 och test-MDA-MB-231-celler såddes glest på kollagen över natten. Tidsförlopp video mikroskopi utfördes genom Olympus mikroskop, som är kopplad till en EM-Hamamatsu kamera. Bilder tas med ett intervall på 1 timme i 18 timmar under slumpmässig migration. Se filmer av slumpmässig migration för kontroll och test.

Discussion

I realtid slumpmässiga migration analys möjliggör noggrann, känslig, analys av parametrar cell migration såsom hastighet och förskjutning. Denna metod är inte begränsad till slutvärdet punkt mätning, varför det är mer kvantitativ. Sedan, cellerna övervakades under normal DMEM-medium med serum, minskar den skadliga effekten av längre inkubation i serumfritt medium. Det har visats att migreringen av celler beror på den formatering och bryta cellkontakter med substratet ^8, sålunda kan denna metod användas för att studera effekten av olika substrat på migration.

En av de kritiska stegen innebär en ordentlig kontroll av temperaturen till 37 ° C och CO ₂ vid 5% för att säkerställa optimal migration. Analysen möjliggör flexibilitet att följa flyttande svar på önskade tidpunkter, men kan den kräva att optimera antalet tidpunkter. Till exempel kan vissa celler har lägre migrationen måste övervakas för en longer tid i jämförelse med celler som har högre vandringshastigheter.

Mikromiljön av tumören är en av de avgörande faktorerna i karcinogenes. Cancer resultat från interaktionen av tumörceller med närliggande celler såsom endotelceller, stromala och inflammatoriska celler ^9. Denna analys kan modifieras för att studera hur migrering av tumörceller påverkas av mikromiljön. Ett av de sätt på vilka det kan uppnås genom att studera migrering av fluorescensmärkta tumörceller odlade i en blandad population av olika celler, såsom stomi-och endotelceller. Denna metod kan också användas för att studera sårläkning i realtid.

Time-lapse mikroskopi kan modifieras för att övervaka cellinvasion, celldelning, apoptos och lamellipodial dynamik och fokala dynamik vidhäftning med högre upplösning linser.

En av begränsningarna med denna metod är att den inte tillåter övervakning av migraning in vivo. Eftersom det inte finns någon tillgänglig utrustning som kan mäta realtid migrering i kroppen, är denna typ av analys som inte är lämplig för in vivo-migrering. Det inte heller möjligt för oss att belysa biokemiska maskiner och signalering komponenter som är viktiga i cell migration. För att åtgärda de signalvägar, är det viktigt att utföra biokemiska experiment. Se referenser för grupper som har använt denna metod för slumpmässig migration ^{6, 10-14.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30243.01
FBS	Gemini Bio Products	100-106
Opti-Mem	Invitrogen	31985-070
Collagen	BD Biosciences	354231
Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller	Olympus Corporation	Olympus 1X81
Environmental control chamber	Neue	Neue Live Cell Chamber	Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments.
Automated XY stage	Prior Scientific	Prior Proscan	This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy.
Camera		Hamamatsu EM camera C9100
Software	Typically purchased through microscope vendor such as Olympus	Slide Book 5