Summary
Diese Methode ermöglicht das Monitoring von Zellen in Echtzeit und quantitative Messungen verschiedener Zell-Migration Parameter wie Geschwindigkeit, Weg und Geschwindigkeit. Im Gegensatz zu den herkömmlichen Methoden ist diese Echtzeit-Ansatz nicht auf Endpunkt quantitativen Migration der Grundlage von Messungen, sondern es ermöglicht die Überwachung und Berechnung verschiedener Parameter kontinuierlich.
Abstract
Die Zellmigration ist ein dynamischer Prozess, das ist wichtig für die Embryonalentwicklung, die Reparatur von Gewebe, die Funktion des Immunsystems und Tumorinvasion 1, 2. Während gerichtete Migration, zu bewegen Zellen schnell in Reaktion auf eine extrazelluläre chemotaktischen Signal oder in Reaktion auf intrinsische Signale 3 durch die grundlegende Motilität Maschine bereitgestellt. Zufällige Migration tritt auf, wenn eine Zelle besitzt niedrige intrinsische Richtwirkung, so dass die Zellen, um ihre lokale Umgebung zu erkunden.
Die Zellmigration ist ein komplexer Prozess, in der ursprünglichen Antwort Zelle erfährt Polarisation und erstreckt sich Vorsprünge in der Richtung der Wanderung 2. Traditionelle Methoden zur Migration, wie der Boyden-Kammer Assay die Migration zu messen, ist eine einfache Methode, Chemotaxis in vitro, die Messung der Migration als Endpunkt Ergebnis erlaubt zu messen. Doch dieser Ansatz weder erlaubt die Messung der einzelnen Parameter Migration, noch erlauben zu visuasierung von morphologischen Veränderungen erfährt, dass die Zelle während der Migration.
Hier präsentieren wir eine Methode, die uns zu wandernden Zellen in Echtzeit per Video überwachen können - Zeitraffer-Mikroskopie. Da Zellmigration und Invasion Kennzeichen von Krebs sind, wird diese Methode anwendbar sein bei der Untersuchung von Krebszellen Migration und Invasion in vitro. Zufällige Migration von Plättchen nach einem der Parameter der Thrombozytenfunktion 4 wurde erlaubt, damit dieses Verfahren könnte auch nützlich sein bei der Untersuchung Plättchenfunktionen. Dieser Assay hat den Vorteil, dass die schnelle, zuverlässige und reproduzierbare, und erfordert keine Optimierung der Zellzahlen. Um physiologisch geeigneten Bedingungen für die Zellen zu erhalten, wird das Mikroskop mit CO 2-Versorgung und Thermostat ausgestattet. Zellbewegung wird durch das Fotografieren mit einer Kamera ausgestattet, um dem Mikroskop in regelmäßigen Abständen überwacht. Die Zellmigration durch Messung der mittleren Geschwindigkeit und einer berechneten werdenurchschnittliche Verschiebung, die durch Slidebook Software berechnet wird.
Protocol
1. Vorbereitung der Platte mit Kollagen beschichtet
- Verdünnte Kollagen zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml in Opti-MEM Medium.
- Coat 6 Well-Platten mit Kollagen, durch Zugabe von 1,5 ml aus Schritt 1 in jede Vertiefung. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C
- Am folgenden Tag, waschen Sie die Platte 2-mal mit 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) und speichern sie in PBS.
2. Zellpräparation und Seeding auf einer 6-Well-Platte
Hinweis: Verwenden Sie warmes Medien und PBS, um optimale Bedingungen für die Bewegung der Zellen zu gewährleisten
- Wachsen MDA-MB-231 (ein invasiver Brustkrebs-Zelllinie) dünn in Dulbecco modifiziertes Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). In diesem Beispiel verwenden wir den MDA-MB-231, jedoch kann diese Methode auf alle Anhänger Krebs und nicht-bösartige Zelllinien eingesetzt werden.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit warmem 1x PBS und sammeln durch Trypsinierung. Überprüfen Zellen unter einem Mikroskop zu machen suerneut, dass die Zellen richtig durch Trypsin-Behandlung abgelöst.
- Sammeln der Zellen durch Zugabe von DMEM-Medium mit 10% FBS, sanft drehen sich die Zellen bei 1000 g für 5 Minuten. Das Zellpellet vorsichtig in DMEM-Medium mit 10% FBS.
- Brechen Sie das Zellpellet durch Auf-und Abpipettieren sanft. Es ist wichtig zu brechen Zellcluster in einzelne Zellen so weit wie möglich.
- Zählen der Zellen und mit Wasser auf eine Endkonzentration von 50.000 Zellen / ml in DMEM-Medium mit 10% FBS. Dispense 2 ml in jede Vertiefung.
- Anschließend wird die Platte bei 37 ° C in einem Gewebekultur-Inkubator über Nacht bis zum Start der Zeitraffer-Mikroskopie.
- Um ausreichend Platz für die Migration zu gewährleisten, erstellen Sie eine Wunde mit Hilfe einer Pipettenspitze, waschen Sie die Platte mit 1X PBS, um Ablagerungen (gebildet als Folge der Wunde) entfernen und hinzufügen DMEM mit 10% FBS. Prüfen Sie unter dem Mikroskop für schwimmende Zellen. Wenn eine große Anzahl von Zellen schwimmenden sind, wiederholen Sie den Waschvorgang. Nun ist die Platte fertig zu sein, das Setup aufMikroskop für die Bildaufnahme.
3. Mikroskop-Setup und Automated Image Acquisition
Es gibt mehrere Imaging-Software-Pakete, die das Mikroskop für die automatisierte Bildaufnahme. Hier verwenden wir Slidebook 5,0 Imaging-Software und automatische Übernahmen sind auf einem Olympus-Mikroskop (Olympus IX81), gekoppelt an ein EM-Hamamatsu C9100-Kamera, das ist ausgezeichnet für Live-Cell-Anwendungen, bei denen Schnelligkeit des Erwerbs und der minimale Phototoxizität ist von größter Bedeutung durchgeführt. Das System beinhaltet eine Bühne oben Umweltkontrolle Kammer (Neue Live Cell) und eine automatische XY-Steuerung (Vor Proscan). Die Bilder werden mit einem 10X UPLANFL Ph1/0.30 Ziel, in Hellfeld-Modus, mit einem definierten Zeitintervall erworben. Das folgende Protokoll beschreibt die Bildaufnahme.
- Schalten Sie das Mikroskop, Kamera und Live Cell Imaging Apparatur. Positionieren Sie die Platte über die mikroskopische Bühne. Die Platte von der Neuen Live Cell ENVIronmental Steuerkammer, die mit einem CO 2-Versorgung und Temperatursensoren angeschlossen ist. Stellen Sie den Thermostat auf 37 ° C und CO 2 bei 5%.
- SlideBook Software ermöglicht vollautomatische objektive Auswahl, Auswahl der Wellenlänge und einfaches Umschalten zwischen Fluoreszenz-und Hellfeld-Techniken. Um die Einrichtung verschiedener Parameter der Fokus-Steuerung, offene SlideBook Software> in der Menüleiste> select Fokus Kontrolle zu gehen, indem Sie auf>
und wählen Sie folgende Parameter: - In der "Ziel-Feld" definieren das Ziel durch Auswahl aus Drop-Down-Fenster. Beachten Sie, dass wir mit einer Phase objektiv und haben manuell die entsprechende Phase-Ring im Kondensator ausgewählt. Wenn Sie ein System mit einem automatisierten Kondensator, wird dies automatisch durch die Software eingestellt werden. Alternativ, wenn weder Objektivrevolver noch Kondensator geregelt werden, sollten diese jeweils manuell ausgewählt werdenly.
- In der "Filter-Set"-Box:
- Wählen Sie Einstellungen, um den Lichtweg entweder das Okular oder die Kamera aus dem Dropdown-Feld zu lenken, um verfügbare Filter ("Live" für Okular, "Weitfeld" für Kamera in unserem System) zu sehen.
- Wählen Sie den passenden Filter für Hellfeldbeleuchtung (in unserer Einrichtung, ist diese Option mit der Bezeichnung "DIC", die eine offene Position für das Hellfeld Lichtweg darstellt).
- Wählen Sie die Lichtquelle durch einen Klick auf "Open Hell", um die Hellfeld-Verschluss zu öffnen.
- Wenn Sie das Beispiel unter dem Okular anzuzeigen, wählen Sie die Hellfeld-Filter (Position "6" in unserem System) auf dem Turm. Nach anfänglich Betrachten der Probe durch das Okular zu entsprechenden Felder zu finden und bringen die Probe in den Fokus (Schritte 3.2.1 bis 3.2.2.3). Bewegen Sie den Filter Revolver, um den Lichtweg an der Kamera ändern für die Bilderfassung (Position "1" in unserem System).
- Die automatisierte Bühne ermöglicht die Auswahl von verschiedenen XY-Koordinates, um mehrere Felder von Interesse während der Bildaufnahme zu erfassen. In SlideBook Software, um den Fokus Kontrolle gehen, wählen Sie "XY", wählen Sie verschiedene Positionen obwohl das Okular, klicken Sie dann auf "set point" Schloss an jedem Standort für die Bilderfassung (Abbildung 1).
- Feinabstimmung der Fokus der Kamera Bild auf dem Bildschirm angezeigt wird. Dies kann entweder unter Verwendung der manuellen Kontrollen auf dem Mikroskop oder den Computer steuert, die den Fokus in viel kleineren Schritten anpassen können erreicht werden.
- Verwenden Sie die Steuerelemente im "Focus Controls"-Fenster, stellen Sie die z-Position der Bühne. Für beste Ergebnisse, auf flachen zellulären Protrusionen in der Nähe der Kontakt mit der Platte zu konzentrieren.
- Um mit der Fokussierung verwenden Sie den Schieberegler, um die Belichtungszeiten einstellen, um in einem geeigneten Bereich für die Fokussierung sein zu helfen. Wenn mehrere XY-Positionen ausgewählt wurden, stellen Sie den Fokus für jede einzelne Position: Unter Fokussteuerung> XY> Besuch Punkt. Hinweis: Dies geschieht, um sicherzustellen, th machenauf Felder sind korrekt für eine optimale Momentaufnahme konzentriert.
- Verwenden Sie die Software zum Einrichten des Capture-Fenster Parameter. In SlideBook, öffnen Sie die Gefangennahme durch die Auswahl
aus der Menüleiste. Siehe Abbildung 2. Dann überprüfen wir die folgenden Parameter. - Überprüfen Sie erfassen Typ> als Zeitraffer.
- Prüfen Sie Filter-Set: Breites Feld: DIC (für Hellfeld-Bild).
- "Zeitraffer-Capture" ist die Anzahl von Zeitpunkten, die erfasst (kann variieren, abhängig vom Zelltyp) werden. Die Dauer ist die Gesamtzeit für das Experiment. Einheiten der Zeit [in Millisekunden (ms), Sekunden (s), Minuten (m) oder Stunden (h)] können aus dem Dropdown-Menü ausgewählt werden.
- "Intervall" ist die Verzögerung zwischen dem Beginn eines Zeitpunkt und dem Beginn der nächsten Zeitpunkt. Wie Sie in zwei dieser Werte eingeben, wird die dritte Feld automatisch berechnet.
- Mehrere XY-Capture: Wählen Sie "MultiPunkte-Liste "für mehr als 1 XY-Position.
- Benennen Sie die Datei. In dem gegebenen Beispiel, haben wir es mit dem Namen '231 '.
- Zur Vermeidung von unerwarteten Ausfallzeiten des Computers durch mehrere Bilder geschlossen, verwenden Sie den "Spool-Option", um die Datei zu speichern. Es ist optional, es wird jedoch dringend empfohlen. Zu diesem Zweck unter Capture-contro l> Wählen Sie Erweitert> Spool> Fotografieren, um Speicher zu sparen und Spool-Datei nach jedem Zeitpunkt Punkten. Durchsuchen Sie den Speicherort, um die Folie Buchdatei (Abbildung 3) zu retten. Der erzeugte Film kann später aus der dafür vorgesehenen Stelle importiert werden. Die Schritte der Mikroskop-Setup wurde in zusammengefasst Datei 3,1 .
und wählen Sie folgende Parameter: 
aus der Menüleiste. Siehe Abbildung 2. Dann überprüfen wir die folgenden Parameter. 4. Bildverarbeitung und-analyse von Migration: Berechnung der Geschwindigkeit und Verschiebung
In diesem Beispiel wird eine Bildverarbeitung durchgeführt, indem SlideBook 5, 6 5.0 Software. Es gibt verschiedene andere Programme, wie ImageJ 7 für die Bildverarbeitung und Analyse.
- Importieren der SlideBook Dateien von Bildern von verschiedenen Bereichen zu verschiedenen Zeitpunkten erzeugt. Gehen Sie ins Menü bar> unter Bild> Importieren> Slide Buch Spool> wählen Sie die gewünschte Datei (Abbildung 4a).
- Hier ist unser Ziel, die Bewegung der einzelnen Zellen zu verfolgen. Es kann über automatisierte Tracking oder individuelle Tracking werden. Im Beispiel haben wir manuelle Tracking verwendet, da diese Entscheidung erleichtert aus Artefakten leicht, das ist viel schwieriger mit automatisierten Tracking-Systems.
- Öffnen Sie die Datei SlideBook, in denen wir uns Tracking durchzuführen. Unter Menü: auswählen Maske> Particle Tracking Protocol> Manuelle Particle Tracking Protocol (Abb. 4b). Ein Fenster wird mit Start-und Endzeit Punkte (Abbildung 4c) erscheinen.
- Begin, um die Bewegung von einzelnen Zellen durch das Anklicken der Mitte jeder Zelle (Kern) zu verfolgen. N etwa 10 Zellen aus jeder Film und mindestens drei verschiedene Filme sollten von verschiedenen Orten gewählt werden, dass etwa 30 Zellen aus einem Experiment analysiert werden. Jedes Experiment sollte dreimal wiederholt werden. Um eine unvoreingenommene Herangehensweise zuzulassen, wählen Sie Zellen, die aus unterschiedlichen Standorten wie z. B. einige Zellen aus Front-, Middle, Ecken usw. "OK" klicken, nachdem Tracking ist getan.
- Zufällige Migration kann durch die Messung von Veränderungen in der Geschwindigkeit, Geschwindigkeit, Weg usw. Um die Daten, unter Menü> select Maske> Particle Tracking> Particle Tracking-Protokoll analysieren analysiert werden. Wählen Sie Tracking-Parameter wie unten beschrieben: (Abbildung 5a):
- Verfolgen Sie mit - Wählen Sie den Parameter, den Sie aus der Dropdown-Liste verfolgen wollen. In diesem Beispiel haben wir genutzt, Center of Area (die Koordinaten des Mittelpunktes des ObProjekt).
- Klicken Sie auf "zu verfolgen und weiter". Sobald Tracking abgeschlossen ist, wird dies automatisch mit dem nächsten Schritt voranzubringen.
- Wählen Sie den gewünschten Statistiken für jeden Pfad, wie Verschiebung und die durchschnittliche Geschwindigkeit (siehe Abbildung 5b):
- Durchschnittliche Geschwindigkeit - der gesamte Weg, den die Zeit benötigt, um die Strecke zurückzulegen unterteilt.
- Hubraum - die Gesamtstrecke von dem Objekt gereist.
- Klicken Sie auf "Berechnen und Fortfahren", wenn Sie mit dem nächsten Schritt voranschreiten wollen, oder wählen Sie einfach "Berechnen", wenn Sie Ihre Statistiken, ohne dabei mit dem nächsten Schritt ansehen möchten. Eine Datei wird erzeugt, kann als Textdatei gespeichert werden und können später nach Excel exportiert werden.
- Um Objekte mit automatisierten Tracking-Protokoll zu verfolgen, hat zunächst eine Maske erstellt werden soll.
- Wählen Maske> Segment Image> ein Segment Fenster erscheint> wählen, bis Schwelle erreicht wird, so dass Septemberarating ein Objekt von anderen> klicken Sie auf Übernehmen> OK (siehe Abbildung 5c). Schritt 4.5.1 die gleiche ist.
- Entfernen Sie Objekte, die kleiner als - Markieren Sie dieses Kästchen, um selektiv zu entfernen, Objekte, die kleiner als eine gegebene Größe. Geben Sie die Größe in das Eingabefeld ein und wählen Sie entweder um oder Pixel als Einheit. Diese wird verwendet, um Artefakte häufig durch Ablagerungen zu beseitigen.
- Minimale Bewegung - geben Sie die minimale Anzahl von Zeitpunkten, die verfolgt, um einen Pfad zu ermitteln muss.
- Maximale Bewegung - Geben Sie die maximale Bewegung, die Sie von jedem beliebigen Objekt von einem Zeitpunkt zum nächsten erwarten.
- Schritte, um die Daten zu analysieren sind die gleichen wie manuelle Tracking (siehe die Schritte 4.5.2 bis 4.6.2).
5. Repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel für eine ungerichtete Migration Analyse in Bezug auf Geschwindigkeit und Weg (6) quantifiziert. Nach dem Exportieren Sie die Datei to Excel werden Daten aufgezeichnet mit einer Box und Whisker Plot. Die statistische Analyse vergleicht insgesamt Verschiebung und die durchschnittliche Geschwindigkeit zwischen Versuchs-und Kontrollgruppe erfolgt mit Mann-Whitney-Test. Die Testprobe zeigt eine Zunahme der durchschnittlichen Geschwindigkeit im Vergleich zur Kontrolle. Die Probe zeigt einen Anstieg der gesamten Verschiebung als im Vergleich zur Kontrolle.
Film von Kontroll-und Test: Control MDA-MB-231 Test-und MDA-MB-231 Zellen wurden auf Kollagen ausgesät über Nacht. Zeitraffer-Video-Mikroskopie wurde von Olympus-Mikroskop durchgeführt, der mit einem EM-Hamamatsu Kamera. Die Bilder werden in einem Intervall von 1 Stunde für insgesamt 18 Stunden während der ungerichtete Migration übernommen. Bitte sehen Sie Film 1 und Film 2 von zufälligen Migration für Steuerungs-und Testproben.
Mikroskop-Setup:
Abbildung 1. Einrichten mehrerer Punkte für Bild zu erfassen.
Abbildung 2. Schritte darstellen Capture-Steuertabellen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 3. So speichern Sie mehrere Bilder.
dflinebreak "> Bildverarbeitung und-analyse der Migration.
Abbildung 4a. Schritte zum Bild für die Datenanalyse zu importieren.
Abbildung 4b. Schritte zum Daten mit Partikel-Tracking-Protokoll zu analysieren.
Abbildung 4c. Fenster darstellen Weglänge von Kettenfahrzeugen Partikel.
Die Schritte der Datenanalyse.
Abbildung 5a. Schritte darstellen Parameter der Partikel-Tracking-Protokoll.
5b. Auswahl der Pfad Statistiken zu analysieren.
5c. Schritte zur Maske für die automatisierte Tracking-Protokoll zu erstellen.
Abbildung 6. Durchschnittliche Geschwindigkeit (Abbildung6a) und Verschiebung (6b) in einer Whiskers-Plot aufgetragen. Die Probe zeigt eine Zunahme der Geschwindigkeit und der Verschiebung als zu vergleichen, um zu kontrollieren.
Kino
Movie 1. Migration von Kontrollzellen. Klicken Sie hier, um das Video anzusehen .
Movie 2. Migration von Testzellen. Klicken Sie hier, um das Video anzusehen .
Control-MDA-MB-231 Test-und MDA-MB-231 Zellen wurden dünn auf Kollagen für Nacht ausgesät. Zeitraffer-Video-Mikroskopie wurde von Olympus-Mikroskop durchgeführt, der mit einem EM-Hamamatsu Kamera. Die Bilder werden in einem Intervall von 1 Stunde für 18 Stunden während der ungerichtete Migration übernommen. Bitte beachten Sie die Filme von zufälligen Migration zur Steuerung und Test.
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Discussion
Die Echtzeit ungerichtete Migration Assay ermöglicht die präzise, sensibel, Analyse der Zellmigration Parameter wie Geschwindigkeit und Auslenkung. Diese Methode beschränkt sich nicht Punkt Messwert zu beenden, daher ist es mehr quantitativ. Da die Zellen in DMEM-Medium mit normalem Serum überwacht, senkt die schädliche Wirkung von längerer Inkubation in serumfreiem Medium. Es hat sich gezeigt, dass die Migration von Zellen auf die Formatierung und Brechungszelle Kontakte mit dem Substrat 8, so kann diese Methode verwendet werden, um Wirkung verschiedener Substrate über die Migration zu untersuchen abhängt.
Einer der kritischen Schritte beinhaltet ordnungsgemäße Kontrolle der Temperatur auf 37 ° C und CO 2 bei 5%, um eine optimale Migration sicherzustellen. Der Assay erlaubt Flexibilität, um wandernde Antworten auf gewünschten Zeitpunkten zu überwachen, doch, so kann sie eine Optimierung der Anzahl von Zeitpunkten. Zum Beispiel können einige Zellen mit niedrigeren Migrationsraten müssen für eine lo überwacht werdennger als Zeit, um Zellen mit höheren Preisen im Vergleich Migration.
Die Mikroumgebung des Tumors ist einer der entscheidenden Faktoren bei der Krebsentstehung. Cancer Ergebnisse aus der Wechselwirkung von Tumorzellen mit den umgebenden Zellen wie Endothelzellen, Stromazellen und Entzündungszellen 9. Dieser Assay kann modifiziert werden, um zu untersuchen, wie die Migration von Tumorzellen durch die Mikroumgebung beeinflusst werden. Einer der Wege, auf denen dies erreicht werden kann, ist das Studium der Migration von fluoreszierend markierten Tumorzellen in einer gemischten Population von verschiedenen Zellen, wie Stoma und Endothelzellen wachsen. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um die Wundheilung in Echtzeit zu untersuchen.
Zeitraffer-Mikroskopie konnten modifiziert, um Zell-Invasion, die Zellteilung, Apoptose und lamellipodialen Dynamik und Dynamik fokaler Adhäsionen mit Linsen mit höherer Auflösung überwachen.
Eine der Einschränkungen dieses Verfahrens ist, dass es nicht erlaubt die Überwachung von Migrationtion in vivo. Da es keine Einrichtung steht, die Echtzeit-Migration im Körper messen kann, ist diese Art von Assay nicht geeignet zur in vivo-Migration. Darüber hinaus erlaubt uns nicht, um die biochemische Maschinerie und Signalisierungs-Komponenten, die wichtig sind in der Zellmigration aufzuklären. Um die Signalwege adressieren, ist es unerlässlich, biochemische Experimente durchführen. Siehe Referenzen für Gruppen, die diese Methode verwendet haben für ungerichtete Migration 6, 10-14.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Amanda Struckhoff für die erste Hilfe mit dem Experiment zu danken. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus NIH 5RO1CA115706 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus Corporation | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior Scientific | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
References
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