Summary
Deze methode maakt het mogelijk controle van de cellen in real time en kwantitatieve metingen van verschillende celmigratie parameters, zoals snelheid, verplaatsing, en snelheid. In tegenstelling tot de traditionele methoden, is deze real-time benadering niet gebaseerd op eindpunt kwantitatieve migratie metingen, in plaats daarvan het laat de controle en het berekenen van verschillende parameters continu.
Abstract
Cel migratie is een dynamisch proces, wat belangrijk is voor de embryonale ontwikkeling, weefselherstel, werking van het immuunsysteem, en tumor invasie 1, 2. Tijdens directionele migratie cellen snel bewegen in reactie op een extracellulair chemotactische signaal, of als reactie op signalen intrinsieke 3 door de basis motiliteit machines. Willekeurige migratie doet zich voor wanneer een cel bezit lage intrinsieke gerichtheid, waardoor de cellen aan hun lokale omgeving te verkennen.
Cel migratie is een complex proces, bij de eerste respons cel ondergaat polarisatie en strekt zich uitsteeksels in de richting van de migratie 2. Traditionele methoden om migratie, zoals de Boyden kamer migratie test te meten is een eenvoudige methode om te meten chemotaxis in vitro, die het mogelijk maakt het meten van migratie als een eindpunt resultaat. Echter, deze benadering laat geen meting van de individuele migratie parameters, noch is het in staat te stellen Visualization van de morfologische veranderingen die cel ondergaat tijdens de migratie.
Hier presenteren we een methode die ons in staat stelt om migrerende cellen in real time met behulp van video - time lapse microscopie. Sinds celmigratie en invasie zijn kenmerken van kanker, zal deze methode van toepassing zijn in het bestuderen van kankercel migratie en invasie in vitro. Willekeurige migratie van bloedplaatjes wordt beschouwd als een van de parameters van de functie van de bloedplaatjes 4, vandaar deze methode kan ook nuttig zijn in het bestuderen van bloedplaatjes functies. Deze test heeft het voordeel dat snel en betrouwbaar en reproduceerbaar, en vereist geen optimalisatie van celaantallen. Om fysiologisch geschikte omstandigheden voor cellen te handhaven wordt de microscoop voorzien CO 2 toevoer en thermostaat. Cell beweging gevolgd door's in een camera aangebracht op de microscoop bij regelmatige intervallen. Celmigratie kan worden berekend door de gemiddelde snelheid enverage verplaatsing berekend door Slidebook software.
Protocol
1. Voorbereiding van gecoat met Collageen
- Verdun collageen tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml in Opti-Mem media.
- Laag 6 wells platen met collageen door toevoeging van 1,5 ml van stap 1 in elk putje. Incubeer overnacht bij 4 ° C.
- De volgende dag, was de plaat 2 keer met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar ze in PBS.
2. Cel Voorbereiding en zaaien op een 6-well Plate
Opmerking: Gebruik warm media en PBS om optimale omstandigheden voor de cel beweging zorgen
- Grow MDA-MB-231 (een invasieve borstkanker cellijn) dun in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS). In dit voorbeeld met de MDA-MB-231, maar deze methode kan worden toegepast op alle aanhangend kankercellen en niet kwaadaardige cellijnen.
- Twee keer wassen cellen met warme 1x PBS en verzamelen door behandeling met trypsine. Controleer cellen onder een microscoop om su te makenopnieuw dat de cellen goed losgemaakt door trypsinebehandeling.
- Verzamelt de cellen door toevoeging DMEM medium met 10% FBS voorzichtig draaien de cellen bij 1000 g gedurende 5 minuten. Resuspendeer de celpellet voorzichtig in DMEM medium met 10% FBS.
- Breek de celpellet door en neer te pipetteren voorzichtig. Het is belangrijk te breken celgroepen in individuele cellen zoveel mogelijk.
- Tel de cellen en verdund tot een eindconcentratie van 50.000 cellen / ml in DMEM medium met 10% FBS. Afvullen 2 ml in elk putje.
- Incubeer de plaat bij 37 ° C in een incubator weefselkweek nacht tot starten tijdsverloop microscopie.
- Om voldoende ruimte voor de migratie te verzekeren, maak een wond met behulp van een pipet, was de plaat met 1X PBS om vuil (gevormd als gevolg van een wond) te verwijderen en toe te voegen DMEM met 10% FBS. Controleer onder de microscoop voor drijvende cellen. Als grote aantallen cellen zijn drijvende, herhaal dan het wassen. Nu is de plaat klaar is om setup op de Bemicroscoop voor het imago van acquisitie.
3. Microscoop Setup en geautomatiseerde Image Acquisition
Er zijn verschillende imaging software pakketten die de microscoop voor automatische beeld acquisitie te regelen. Hier gebruiken we Slidebook 5,0 imaging-software en automatische acquisities worden uitgevoerd op een Olympus microscoop (Olympus IX81), gekoppeld aan een EM-Hamamatsu C9100 camera, wat uitstekend is voor live-cell toepassingen waarbij snelheid van verwerving en minimale fototoxiciteit van het grootste belang. Het systeem omvat een stap top milieu stuurkamer (Neue Levende Cell) en een automatische kruistafel controller (Prior ProScan). Beelden worden opgenomen met een 10x UPLANFL Ph1/0.30 doel, in heldere gebied mode, het gebruik van een bepaald tijdsinterval. Het volgende protocol beschrijft de afbeelding overname.
- Zet de microscoop, camera, en live cell imaging apparatuur. Plaats de plaat over de microscopische podium. Bedek de plaat door de Neue Live Cell milieuronmental regelkamer, die verbonden is met een CO 2 toevoer en temperatuur. Stel de thermostaat op 37 ° C en CO 2 5%.
- SlideBook software maakt het mogelijk volledig geautomatiseerd objectieve selectie, golflengte selectie en eenvoudig schakelen tussen fluorescerende en helderveld technieken. Om het opzetten van verschillende parameters van focus control, open SlideBook software> ga naar de menubalk> selecteer Focus Control, door te klikken>
en selecteer de volgende parameters: - In de "Doelstelling vak" te definiëren als doelstelling om door selectie van drop-down venster. Merk op dat we een fase met behulp van objectieve en zijn handmatig geselecteerd de juiste fase-ring in de condensor. Bij gebruik van een systeem met een automatische condensor, zal deze automatisch worden ingesteld via de software-programma. Als alternatief, als niet objectief turret of condensor zijn geautomatiseerd deze moeten elk worden geselecteerd handleidingly.
- In de "Filter Set" doos:
- Selecteer Instellingen om het lichtpad te richten op zowel het oculair of camera uit het drop down box om de beschikbare filters ("Live" voor oculair, "Widefield" voor Camera in ons systeem) te zien.
- Selecteer de juiste filter voor helderveld verlichting (in ons opzet, wordt deze optie met het label "DIC", die een open positie voor de helderveld lichtpad vertegenwoordigt).
- Selecteer de lichtbron door te klikken op "Open Bright" om de helder veld sluiter te openen.
- Om het monster te bekijken onder het oog stuk, selecteert u het helder veld filter (stand "6" in ons systeem) op de toren. Na in eerste instantie het bekijken van het monster door het oculair naar juiste velden te vinden en het monster in beeld te brengen (stappen 3.2.1 tot en met 3.2.2.3). Verplaats de filter revolver om het lichtpad te wijzigen in de camera voor het vastleggen van beelden (stand "1" in ons systeem).
- De geautomatiseerde fase kan de selectie van verschillende XY coördinatiesysteem coördineert op meerdere velden van belang vast te leggen tijdens beeldacquisitie. In SlideBook software, ga naar de Focus Control, selecteer "XY", selecteer verschillende posities al is het oculair en klik op 'set point "lock op elke locatie voor foto-opname (figuur 1).
- Fijnafstemming de focus van de camera afbeelding die wordt weergegeven op het scherm. Dit kan worden bereikt door een met de bedieningsorganen van de microscoop of de computer controles die de kern kan aanpassen fijner stappen.
- Met behulp van de controles in de "Focus Controls" venster, past u de Z-positie van het podium. Voor de beste resultaten, focus op vlakke cellulaire uitsteeksels in de buurt van het contact met de plaat.
- Om te helpen met focussen Gebruik de schuifbalk om de blootstelling tijden aan te passen om in een passende reeks voor het scherpstellen. Als er meerdere XY-posities zijn geselecteerd, stelt u de focus voor elke individuele functie: Onder focus controle> XY> bezoek punt. Let op: dit is gedaan om ervoor te zorgen, th makenop veld correct is gericht voor een optimale momentopname.
- Gebruik de software op te zetten capture venster parameters. In SlideBook, opent u de opname door het selecteren van
in de menubalk. Zie afbeelding 2. Vervolgens kijken we de volgende parameters. - Controleer Capture type> als de tijd komen te vervallen.
- Controleer het filter set: Breed veld: DIC (voor helderveld afbeelding).
- "Tijdsverloop capture" het aantal tijdstippen die wordt gemaakt (dat kan variëren afhankelijk van het celtype). Duur is de totale duur van het experiment. Eenheden van de tijd [in milliseconden (ms), seconde (s), minuten (m) of uur (h)] kan gekozen worden uit het dropdown menu.
- "Interval" is de vertraging tussen het begin van een meetpunt en het begin van het volgende meetpunt. Terwijl u typt in twee van deze waarden, zal het derde veld automatisch worden berekend.
- Meerdere XY-opname: selecteer "multi-punt list "voor meer dan 1 XY positie.
- Geef het bestand. In het gegeven voorbeeld, hebben we noemden het '231 '.
- Om te voorkomen dat onverwacht uitschakelen van de computer als gevolg van meerdere beelden, gebruik de "spool optie" om het bestand op te slaan. Het is optioneel, maar het wordt sterk aanbevolen. Voor dit doel, onder capture contro l> selecteer Geavanceerd> Spool> Leg het geheugen en het spool-bestand na iedere keer punten te besparen. Ga naar de locatie aan de dia boekbestand (figuur 3) op te slaan. De gegenereerde film kan later van de aangewezen locatie worden geïmporteerd. Stappen van microscoop installatie is samengevat in file 3,1 .
en selecteer de volgende parameters: 
in de menubalk. Zie afbeelding 2. Vervolgens kijken we de volgende parameters. 4. Image Processing and Analysis van de migratie: Berekening van de snelheid en verplaatsing
In dit voorbeeld is beeldverwerking door SlideBook 5, 6 5.0 software. Er zijn verschillende andere programma's zoals ImageJ 7 voor de beeldverwerking en analyse.
- Importeer de SlideBook bestanden gegenereerd op basis van beelden van verschillende gebieden op verschillende tijdstippen. Ga naar het menu bar> onder Afbeelding> Importeren> Dia boek spool> selecteer het gewenste bestand (Figuur 4a).
- Hier is ons doel om de verplaatsing van individuele cellen. Het kan worden gedaan met behulp van geautomatiseerde volgen of individuele tracking. In het voorbeeld hebben we handmatig bijhouden gebruikt, omdat dit vergemakkelijkt het uitsluiten van artefacten gemakkelijk, dat is moeilijker met automatische tracking.
- Open het SlideBook bestand, waarin we moeten volgen uit te voeren. Onder het menu: Selecteer Mask> Particle Tracking Protocol> Handmatig Particle Tracking Protocol (figuur 4b). Er verschijnt een venster met begin-en eindtijd punten (figuur 4c).
- Begin om de beweging van individuele cellen te volgen door te klikken op het midden van elke cel (kern). Track ongeveer 10 cellen per film ten minste drie films moeten worden gekozen uit verschillende locaties zodat ongeveer 30 cellen worden geanalyseerd een experiment. Elk experiment worden drie keer herhaald. Om een onbevooroordeelde benadering mogelijk te maken, cellen van verschillende locaties, zoals sommige cellen van voor te selecteren, midden, hoeken etc. Klik op "OK", eens tracking is gedaan.
- Willekeurige migratie kan worden geanalyseerd door het meten van veranderingen in de snelheid, snelheid of verplaatsing enz. Om de gegevens, onder menu> selecteer masker> deeltje volgen> deeltje volgen protocol te analyseren. Kies opsporingsparameters zoals beschreven in: (figuur 5a):
- Track met - Selecteer de parameter die u wilt bijhouden van de dropdown lijst. In dit voorbeeld gebruikt, Center gebied (de coördinaten van het midden van de Object).
- Klik op "te houden en voort te zetten". Na het volgen is voltooid, zal dit automatisch door naar de volgende stap.
- Kies de gewenste statistieken voor elk pad, zoals de verplaatsing en de gemiddelde snelheid (zie figuur 5b):
- Gemiddelde snelheid - de totale afgelegde afstand gedeeld door de tijd nodig om die afstand te reizen.
- Totaal Verplaatsing - de totale afstand afgelegd door het object.
- Klik op "Bereken en doorgaan" als u op weg naar de volgende stap, gewoon of selecteer "Bereken" als u in uw statistieken te bekijken zonder het gaan naar de volgende stap. Een bestand zal worden gegenereerd die kan worden opgeslagen als tekstbestand en kan later worden geëxporteerd naar Excel.
- Met het oog op te sporen objecten met behulp van geautomatiseerde volgen protocol, eerst een masker moet worden gecreëerd.
- Selecteer Mask> Segment Afbeelding> een segment venster lijkt> te selecteren totdat drempel wordt bereikt zodanig dat SEParating een object van anderen> klik op Toepassen> OK (zie figuur 5c). Stap 4.5.1 hetzelfde.
- Verwijder voorwerpen die kleiner zijn dan - Schakel dit vakje in het selectief verwijderen van objecten kleiner dan een bepaalde grootte. Voer het formaat in het bewerkingsveld en kies micron of pixels als eenheid. Dit wordt gebruikt om artefacten vaak veroorzaakt door vuil te verwijderen.
- Minimale beweging - voer het minimum aantal tijdstippen die moet worden gevolgd om een weg te bepalen.
- Maximum Movement - Voer de maximale beweging die u mag verwachten van een bepaald object van het ene tijdstip naar de volgende.
- Stappen om de gegevens te analyseren zijn dezelfde als handleiding volgen (zie de stappen 4.5.2 tot 4.6.2).
5. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van een willekeurige migratie analyse gekwantificeerd in snelheid en verplaatsing (figuur 6). Na het exporteren van het bestand to excel, worden de gegevens uitgezet met behulp van een doos en snorharen plot. Statistische analyse vergelijken van de totale verplaatsing en de gemiddelde snelheid tussen de test-en controle wordt uitgevoerd met behulp van Mann-Whitney test. Het monster een stijging van de gemiddelde snelheid in vergelijking met de controle. Het monster vertoont een toename van de verplaatsing ten opzichte van de controle.
Film van controle en test: Controle MDA-MB-231 en test MDA-MB-231 cellen werden uitgezet op de collageen 's nachts. Timelapse videomicroscopie werd uitgevoerd door Olympus microscoop, gekoppeld met een EM-Hamamatsu camera. Beelden worden genomen met een interval van 1 uur voor een totaal 18 uren willekeurige migratie. Zie Film 1 en Film 2 van willekeurige migratie voor controle en proefmonsters.
Microscoop setup:
Figuur 1. Het opzetten van meerdere punten voor het imago van vast te leggen.
Figuur 2. Stappen beeltenis vastleggen controle. Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Hoe om meerdere beelden op te slaan.
dflinebreak "> Beeldverwerking en analyse van de migratie.
Figuur 4a. Stappen om afbeelding te importeren voor data-analyse.
Figuur 4b. Stappen om gegevens met behulp van deeltjes volgen protocol te analyseren.
Figuur 4c. Window beeltenis van weglengte van de gevolgde deeltjes.
Stappen van data-analyse.
Figuur 5a. Stappen beeltenis van parameters van deeltjes volgen protocol.
Figuur 5b. Selectie van het pad statistieken worden geanalyseerd.
Figuur 5c. Stappen te maken masker voor geautomatiseerde volgen protocol.
Figuur 6. Gemiddelde snelheid (figuur6a) en verplaatsing (figuur 6b) is uitgezet in een whiskers plot. Het monster vertoont een verhoging van de snelheid en de verplaatsing te vergelijken met controle.
Bioscoop
Film 1. Migratie van controle cellen. Klik hier om het filmpje te bekijken .
Movie 2. Migratie van testcellen. Klik hier om het filmpje te bekijken .
Controle MDA-MB-231 en test MDA-MB-231 cellen werden dun gezaaid op de collageen voor overnachting. Timelapse videomicroscopie werd uitgevoerd door Olympus microscoop, gekoppeld met een EM-Hamamatsu camera. Beelden worden genomen met een interval van 1 uur 18 uur bij willekeurige migratie. Zie de films van willekeurige migratie voor controle en test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De real-time willekeurige migratie-test maakt een nauwkeurige, gevoelige, analyse van celmigratie parameters, zoals snelheid en verplaatsing. Deze methode is niet beperkt tot punt meetwaarde beëindigen vandaar is kwantitatief. Aangezien worden cellen gecontroleerd normale DMEM medium met serum, vermindert de nadelige gevolgen van meer incubatie in serumvrij medium. Gebleken is dat de verplaatsing van cellen is afhankelijk van de opmaak en breken cel contact met het substraat 8, zodat deze methode kan worden gebruikt om het effect van verschillende substraten te bestuderen op migratie.
Een van de kritische stappen omvat goede controle van de temperatuur tot 37 ° C en CO 2 5% om optimale migratie. De assay maakt flexibiliteit trekkende reacties controleren op gewenste tijdstippen, maar kan zij optimale aantal tijdstippen. Zo kunnen sommige cellen met een lagere migratie tarieven moeten worden gecontroleerd op een longer vergelijking tot cellen met hogere migratiesnelheden.
De micro-omgeving van de tumor is een van de cruciale factoren in het ontstaan van kanker. Cancer resultaten van interactie van tumorcellen met omringende cellen zoals endotheelcellen, stromale en inflammatoire cellen 9. Deze test kan worden gewijzigd om te bestuderen hoe de migratie van tumorcellen worden beïnvloed door de micro-omgeving. Een van de manieren waarop kan worden bereikt is door bestudering van de migratie van fluorescent gelabelde tumor cellen gekweekt in een gemengde populatie van verschillende cellen zoals stoma en endotheelcellen. Deze werkwijze kan ook worden gebruikt om de wondheling in real time te bestuderen.
Time-lapse microscopie kan worden aangepast naar cel invasie, celdeling, apoptose en lamellipodia dynamiek en de focal adhesion dynamiek met behulp van een hogere resolutie lenzen te controleren.
Een van de beperkingen van deze methode is dat het niet mogelijk controle migratieking in vivo. Aangezien er geen materiaal aanwezig dat real time migratie in het lichaam te meten, dit type assay niet geschikt voor in vivo migratie. Het is ook niet ons toelaten om de biochemische machines en signalering componenten die van belang zijn in de cel migratie toe te lichten. Om de aanpak van de signaalwegen, is het essentieel om uit te voeren biochemische experimenten. Zie referenties voor groepen die deze methode hebben gebruikt voor willekeurige migratie 6, 10-14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Amanda Struckhoff bedanken voor de eerste hulp met het experiment. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van NIH 5RO1CA115706.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus Corporation | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior Scientific | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
References
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
- Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
- Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
- Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
- Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
- Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
- Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
- Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
- Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).
