Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ analyse av Random migrasjon av celler ved hjelp av Time-lapse video Mikroskopi

Published: May 13, 2012 doi: 10.3791/3585

Abstract

Cell migrasjon er en dynamisk prosess, som er viktig for embryoutvikling, vev reparasjon, immunsystemets funksjon, og tumor invasjon 1, 2. Under retningsbestemt migrasjon, celler bevege seg raskt i respons til en ekstracellulær kjemotaktisk signal, eller som svar på indre pekepinner 3 levert av grunnleggende motility maskiner. Tilfeldig migrasjon oppstår når en celle besitter lav indre retningen, slik at cellene til å utforske sitt nærmiljø.

Cell migrasjon er en kompleks prosess, i den første responsen cellen gjennomgår polarisering og strekker utstikk i retning av migrasjon to. Tradisjonelle metoder for å måle migrasjon som Boyden kammeret migrasjon analysen er en enkel metode for å måle chemotaxis in vitro, som tillater måling migrasjon som et sluttpunkt resultat. Imidlertid gir denne tilnærmingen verken måling av individuelle migrasjon parametre, heller ikke det tillate å visualization av morfologiske endringer som cellen gjennomgår i løpet av migrasjon.

Her presenterer vi en metode som tillater oss å overvåke trekkende celler i sanntid ved hjelp av video - Time Lapse mikroskopi. Siden cellen migrasjon og invasjon er kjennetegn av kreft, vil denne metoden være aktuelt å studere kreft celle migrasjon og invasjon in vitro. Tilfeldig migrasjon av blodplater har vært ansett som en av parametrene i blodplatefunksjon 4, derfor denne metoden kan også være nyttig å studere blodplater funksjoner. Denne analysen har fordelen av å være rask, pålitelig, reproduserbar, og krever ikke optimalisering av celle tall. For å opprettholde fysiologisk egnede forhold for celler, er mikroskop utstyrt med CO 2 forsyning og temperatur termostat. Cell bevegelse overvåkes ved å ta bilder med et kamera montert på mikroskop med jevne mellomrom. Cell migrasjon kan beregnes ved å måle gjennomsnittlig fart og enverage fortrengning, som er beregnet av Slidebook programvare.

Protocol

1. Utarbeidelse av Plate Belagt med Collagen

  1. Fortynn kollagen til en endelig konsentrasjon på 10 mikrogram / ml i Opti-Mem media.
  2. Coat 6 vel plater med kollagen, ved å legge 1,5 ml fra trinn 1 til hver brønn. Inkuber over natten ved 4 ° C.
  3. Dagen etter, vaske tallerkenen 2 ganger med 1x Fosfatbufret saltvann (PBS) og lagre dem i PBS.

2. Celleforberedelsen og Seeding på en seks-brønns plate

Merk: Bruk varme media og PBS for å sikre optimale forhold for celle bevegelse

  1. Grow MDA-MB-231 (en invasiv brystkreft cellelinje) tynt i Dulbecco modifiserte Eagle Medium (DMEM) med 10% fostermedisin Bovine Serum (FBS). I dette eksempelet bruker vi MDA-MB-231, men kan denne metoden brukes på alle heftende kreftceller og ikke kreft cellelinjer.
  2. Vask cellene to ganger med varmt 1x PBS og samle ved trypsinization. Sjekk celler under et mikroskop for å gjøre sure at cellene er riktig frittliggende av trypsin behandling.
  3. Samle cellene ved å legge DMEM medium med 10% FBS, forsiktig spinn ned cellene ved 1000 g i 5 minutter. Resuspender cellepelleten forsiktig i DMEM medium med 10% FBS.
  4. Bryt cellepelleten ved pipettering opp og ned forsiktig. Det er viktig å bryte ned cellen klynger i enkelte celler så mye som mulig.
  5. Telle celler og fortynn til en endelig konsentrasjon på 50.000 celler / ml i DMEM media med 10% FBS. Tilsett 2 ml i hver brønn.
  6. Inkuber platen ved 37 ° C i en vev kulturinkubatoren natten, inntil starte time-lapse mikroskopi.
  7. For å sikre god plass til migrasjon, lage et sår ved hjelp av en pipette, Vask platen med 1X PBS for å fjerne rester (dannet som et resultat av sår) og legge DMEM med 10% FBS. Sjekk under mikroskop for flytende celler. Hvis et stort antall celler er flytende, gjenta prosedyren vask. Nå er platen klar til å settes opp på denmikroskop for image oppkjøpet.

3. Mikroskop Oppsett og Automated Image Acquisition

Det er flere bildebehandlingsprogrammer programvarepakker som styrer mikroskop for automatisert bilde oppkjøpet. Her bruker vi Slidebook 5,0 bildebehandlingsprogrammer og automatiske oppkjøp er utført på en Olympus mikroskop (Olympus IX81), koblet til en EM-Hamamatsu C9100 kamera, som er utmerket for live-celle applikasjoner hvor hastighet av oppkjøp og minimal fototoksisitet er det viktigste. Systemet inkluderer en scene topp miljøkontroll kammeret (Neue levende celle) og en automatisert XY stadium kontrolleren (Prior Proscan). Bildene er kjøpt med en 10X UPLANFL Ph1/0.30 objektiv, i lyse felt modus, med en definert tidsintervall. Følgende protokoll beskriver bildet oppkjøpet.

  1. Slå på mikroskop, kamera, og levende celle bildebehandling apparat. Plasser platen over mikroskopiske scenen. Dekk platen med Neue Live-Cell miljøsige kontroll kammer, som er forbundet med en CO 2 forsyning og temperatursensorer. Still termostaten på 37 ° C og CO 2 på 5%.
  2. SlideBook programvaren tillater helautomatisk objektiv valg, bølgelengde utvalg og enkel veksling mellom lysstoffrør og lyse felt teknikker. For å sette opp forskjellige parametre fokus kontroll, åpen SlideBook programvare> gå til menylinjen> velg fokus kontroll, ved å klikke> Figur 0 Knapp 1 og velg følgende parametere:
    1. I "Mål-boksen," definerer målet med utvalg fra drop down-vinduet. Merk at vi bruker en fase objektiv og har manuelt valgt riktig fase ringen i kondensatoren. Hvis du bruker et system med en automatisert kondensator, vil dette bli automatisk gjennom programmet. Alternativt, hvis verken objektiv turret eller kondensatoren er automatisert disse bør hver velges manueltly.
    2. I "Filter Set" boksen:
      1. Velg innstillinger for å dirigere lyset sti til enten okularet eller kameraet fra drop down boksen for å se tilgjengelige filtre ("Live" for okularet, "Widefield" for Kamera i vårt system).
      2. Velg riktig filter for lysfelt belysning (i vårt sett opp, er dette alternativet merket "DIC" som representerer en åpen posisjon for lysfelt lysbanen).
      3. Velg lyskilden ved å klikke på "Åpne Bright" for å åpne lyse feltet lukkeren.
  3. For å se prøven under øyet stykket, velger lyse feltet filter (posisjon "6" i vårt system) på dreieskiven. Etter første omgang ser prøven gjennom okularet til å finne aktuelle feltene og bringe prøven i fokus (trinn 3.2.1 til 3.2.2.3). Flytt filteret turret å endre lyset banen til kameraet for Image Capture (posisjon "1" i vårt system).
  4. Den automatiserte scenen tillater valg av ulike XY samordningtes å fange flere felt av interesse under bildet oppkjøpet. I SlideBook programvare, gå til fokus kontroll, velg "XY", velge ulike posisjoner skjønt øyet stykke, og klikk "set point" lock på hvert sted for bildeopptak (figur 1).
  5. Finjustere fokus på kameraet bildet som vises på skjermen. Dette kan skje enten ved å bruke de manuelle kontrollene på mikroskop eller datamaskinen kontrollene, som kan justere fokuset i mye finere trinn.
  6. Bruk kontrollene i "Focus Controls"-vinduet, juster z posisjonen scenen. For best resultat, fokuserer på flate mobilnettet utstikk nær kontakt med platen.
  7. For å hjelpe med å fokusere bruke glidebryteren til å justere eksponeringen ganger for å være i en passende utvalg for fokusering. Hvis flere XY stillinger har blitt valgt, justere fokus for hver enkelt posisjon: Under fokus kontroll> XY> besøk punkt. Merk: dette er gjort for å sørge, thpå felt er riktig fokusert for en optimal øyeblikksbilde.
  8. Bruk programvare for å sette opp-vindu parametere. I SlideBook åpner fangst ved å velge Figur 0 Knapp 2 fra menylinjen. Se figur 2. Vi så sjekk følgende parametre.
    1. Sjekk Fangsttyper> som tiden forfalle.
    2. Sjekk Filter sett: Wide feltet: DIC (for lyse felt bilde).
    3. "Time lapse capture" er antall tidspunkter som vil bli tatt (det kan variere, avhengig av celletype). Varighet er den totale lengden av tid for forsøket. Tidsenheter [i millisekunder (ms), sekunder (r), minutter (m) eller timer (h)] kan velges fra rullegardinmenyen.
    4. "Intervall" er forsinkelsen mellom begynnelsen av en endepunktet og begynnelsen av neste endepunktet. Som du skriver i to av disse verdiene, vil det tredje feltet beregnes automatisk.
    5. Multippel XY capture: velg "multipunkts liste "for mer enn en XY posisjon.
    6. Gi filen. I den gitte eksempel, har vi kalt det '231 '.
  9. For å unngå uventet slå av maskinen på grunn av flere bilder, bruke "spolen alternativet" for å lagre filen. Det er valgfritt, men det er sterkt anbefalt. For dette formålet, under fangst contro l> velg Avansert> Spool> Ta til minnet og lagre til spool fil etter hver gang poeng. Bla gjennom hvor du vil lagre lysbildet bokfil (figur 3). Den genererte filmen kan importeres senere fra angitt sted. Trinn i mikroskop oppsettet har blitt oppsummert i fil 3,1 .

4. Bildebehandling og analyse av Migration: Beregning av Speed ​​og Displacement

I dette eksemplet er bildebehandlingen gjøres ved SlideBook 5, 6 5.0 programvare. Det finnes ulike andre programmer, for eksempel ImageJ 7 for bildebehandling og analyse.

  1. Importere SlideBook filer generert fra bilder av forskjellige felt på ulike tidspunkter. Gå til menylinjen> under Image> Import> Lysbilde bok spole> velg den ønskede filen (figur 4a).
  2. Her er vårt mål er å spore bevegelsene til individuelle celler. Det kan gjøres ved hjelp av automatisert sporing eller individuell sporing. I eksemplet har vi brukt manuell tracking, da dette letter utelukke gjenstander lett, noe som er mer vanskelig med automatisert sporing.
  3. Åpne SlideBook filen, der vi har for å utføre sporing. Under menyen: Velg Mask> Particle Tracking Protocol> Manuell Particle Spore Protocol (figur 4b). Et vindu vil dukke opp med start-og sluttidspunkt poeng (figur 4c).
  4. Begin å spore bevegelse av individuelle celler ved å klikke på midten av hver celle (nucleus). Spor omtrent 10 celler fra hver film, og minst tre forskjellige filmer bør velges fra forskjellige steder slik at ca 30 cellene vil bli analysert fra et eksperiment. Hvert eksperiment skal gjentas tre ganger. For å tillate en objektiv tilnærming, velger celler fra forskjellige steder som noen celler fra fronten, midten, hjørner etc. Klikk på "OK", en gang sporing gjøres.
  5. Tilfeldig migrasjon kan analyseres ved å måle endringer i fart, hastighet eller forskyvning osv. For å analysere dataene, under menyen> velg maske> partikkel sporing> partikkel sporing protokollen. Velg sporingsparametre som beskrevet nedenfor: (Figur 5a):
    1. Spor med - Velg parameter som du ønsker å spore fra rullegardinlisten. I dette eksemplet har vi brukt, Center of Area (koordinatene til sentrum av Obsjektet).
    2. Klikk på "sporet og fortsette". Når sporing er fullført, vil dette automatisk videre til neste trinn.
  6. Velg ønsket statistikk for hver bane, som for eksempel fortrengning og gjennomsnittlig hastighet (se figur 5b):
    1. Gjennomsnittlig Speed ​​- samlet strekning delt på tiden det tar å reise denne avstanden.
    2. Total Displacement - den totale distansen ved objektet.
    3. Klikk på "Beregn og fortsett" hvis du ønsker å gå videre til neste trinn, eller bare velg "Beregn" hvis du ønsker å se statistikken uten å gå til neste trinn. En fil vil bli generert som kan lagres som tekstfil og kan senere eksporteres til Excel.
  7. For å spore objekter ved hjelp av automatiserte sporing protokollen, har først en maske som skal opprettes.
    1. Velg Mask> Segment Bilde> et segment vindu synes> velge til terskelen er nådd slik at septemberarating ett objekt fra andre> klikk på Bruk> OK (se figur 5c). Trinn 4.5.1 er den samme.
    2. Fjern Objekter mindre enn - Kryss av her for å selektivt fjerne objekter som er mindre enn en gitt størrelse. Angi størrelsen i tekstfeltet og velg enten mikron eller piksler som enhet. Dette brukes til å fjerne gjenstander ofte forårsaket av rusk.
    3. Minimum bevegelse - angi minimum antall tidspunkter som må spores for å bestemme en bane.
    4. Maksimal Movement - Angi maksimalt bevegelsen som du forventer fra et gitt objekt fra en tid punkt til det neste.
    5. Fremgangsmåte for å analysere dataene er de samme som manuell sporing (se trinnene 4.5.2 til 4.6.2).

5. Representative Resultater

Et eksempel på en tilfeldig migrasjon analyse som kvantifiseres i form av fart og forskyvning (figur 6). Etter eksportere filen to excel, er data plottet ved hjelp av en boks og værhår plott. Statistisk analyse sammenligne total fortrengning og gjennomsnittlige hastigheten mellom test og kontroll er utført ved hjelp Mann-Whitney test. Prøven viser en økning i gjennomsnittlig hastighet i forhold til kontrollen. Prøven viser en økning i total forskyvning i forhold til kontrollen.

Film av kontroll og test: Kontroll MDA-MB-231 og test MDA-MB-231 celler ble sådd på collagen over natten. Time-lapse video mikroskopi ble utført av Olympus mikroskop, koblet til en EM-Hamamatsu kamera. Bildene er tatt med et intervall på 1 time til sammen 18 timer i løpet av tilfeldig migrasjon. Se Movie 1 og Movie 2 av tilfeldig migrasjon for kontroll og stikkprøvene.

Microscope oppsett:

Figur 1
Figur 1. Sette opp flere punkter for bilde fange.

Figur 2
Figur 2. Steps skildrer fangst kontroll. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Hvordan lagre flere bilder.

dflinebreak "> Bildebehandling og analyse av migrasjon.

Figur 4a
Figur 4a. Fremgangsmåten for å importere bildet for dataanalyse.

Figur 4b
Figur 4b. Steps å analysere data ved hjelp av partikkel sporing protokollen.

"Figur Figur 4c. Window forestiller banelengde sporede partikler.

Trinn på dataanalyse.

Figur 5a
Figur 5a. Steps skildrer parametere partikkel sporing protokollen.

Figur 5b
Figur 5b. Valg av banen statistikk som skal analyseres.

Figur 5c
Figur 5c. Trinnene for å opprette maske for automatisert sporing protokollen.

Figur 6
Figur 6. Gjennomsnittlig hastighet (Figur6a) og forskyvning (figur 6b) er tegnet inn i et værhår plott. Prøven viser en økning av fart og forskyvning som sammenligne å kontrollere.

Filmer

Movie 1. Migrasjon av kontroll celler. Klikk her for å vise filmen .

Movie 2. Migrasjon av testceller. Klikk her for å vise filmen .

Kontroll MDA-MB-231 og test MDA-MB-231 celler ble sådd tynt på kollagen for natten. Time-lapse video mikroskopi ble utført av Olympus mikroskop, koblet til en EM-Hamamatsu kamera. Bilder er tatt på et intervall på 1 time i 18 timer i løpet tilfeldig migrasjon. Vennligst se filmer av tilfeldig migrasjon for kontroll og test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den sanntid tilfeldig migrasjon analysen muliggjør nøyaktig, følsom, analyse av celle migrasjon parametre som hastighet og forskyvning. Denne metoden er ikke begrenset til slutt punkt måleverdi, derfor er det mer kvantitativ. Siden er celler overvåkes i normal DMEM medium med serum, det reduserer skadelig effekt av lengre inkubasjon i serum frie medier. Det er vist at migrasjon av celler avhenger formatering og bryte celle kontakter med undergrunnen 8, dermed kan denne metoden brukes til å studere effekten av ulike undergrunn på migrasjon.

En av de kritiske trinnene innebærer god kontroll av temperatur til 37 ° C og CO 2 på 5% for å sikre optimal migrasjon. Analysen tillater fleksibilitet til å overvåke trekkende responser på ønskede tidspunkter, kan det imidlertid kreve å optimalisere antall tidspunkter. For eksempel kan noen celler har lavere migrasjon priser må overvåkes for en longer tid i forhold til celler som har høyere migrasjon priser.

Mikromiljøet av svulsten er en av de avgjørende faktorene i kreftutvikling. Kreft resultater fra interaksjon av tumorceller med omkringliggende celler som endotelceller, stromale og inflammatoriske celler 9. Denne analysen kan endres for å studere hvordan migrering av kreftceller blir påvirket av mikromiljøet. En av måtene det kan oppnås er ved å studere migrasjon av fluorescensmerkede tumor celler dyrket i et blandet befolkning av ulike celler som stomi og endotelceller. Denne metoden kan også brukes til å studere sårtilheling i sanntid.

Time-lapse mikroskopi kan modifiseres til å overvåke celle invasjon, celledeling, apoptose og lamellipodial dynamikk og fokale vedheft dynamikken bruke høyere oppløsning objektiver.

En av begrensningene i denne metoden er at den ikke tillater overvåking av migrasjonsjon in vivo. Siden det ikke er tilgjengelig utstyr som kan måle sanntid migrasjon i kroppen, er denne type analysen ikke egnet for in vivo migrasjon. Det heller ikke tillate oss å belyse den biokjemiske maskineri og signalsystemer komponenter som er viktige i celle migrasjon. For å ivareta de signalveier, er det viktig å utføre biokjemiske eksperimenter. Se referanser for grupper som har brukt denne metoden for tilfeldig seks migrasjon, 10-14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30243.01
FBS Gemini Bio Products 100-106
Opti-Mem Invitrogen 31985-070
Collagen BD Biosciences 354231
Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller Olympus Corporation Olympus 1X81
Environmental control chamber Neue Neue Live Cell Chamber Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments.
Automated XY stage Prior Scientific Prior Proscan This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy.
Camera Hamamatsu EM camera C9100
Software Typically purchased through microscope vendor such as Olympus Slide Book 5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
  2. Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
  5. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
  6. Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
  7. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
  8. Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
  9. Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
  10. Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
  11. Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
  12. Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
  13. Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
  14. Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).

Tags

Cellular Biology migrasjon sanntid tid forfalle video mikroskopi
Kvantitativ analyse av Random migrasjon av celler ved hjelp av Time-lapse video Mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jain, P., Worthylake, R. A.,More

Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. J. Vis. Exp. (63), e3585, doi:10.3791/3585 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter