Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Количественный анализ случайных миграции клеток помощью замедленной видео микроскопии

Published: May 13, 2012 doi: 10.3791/3585

Summary

Этот метод позволяет осуществлять мониторинг клеток в реальном времени и количественных измерений различных параметров миграции клеток, таких как скорость, перемещение и скорость. В отличие от традиционных методов, это реальный подход время не на основе конечных количественных измерений миграции, вместо этого она позволяет осуществлять мониторинг и расчет различных параметров непрерывно.

Abstract

Сотовые миграция представляет собой динамический процесс, который имеет важное значение для эмбрионального развития, восстановления тканей, иммунной системы, а также опухолевой инвазии 1, 2. В направленной миграции клеток быстро двигаться в ответ на внеклеточный сигнал хемотаксиса, или в ответ на внутренние сигналы 3 предоставляемых базовых механизмов подвижности. Случайные миграция происходит, когда клетка обладает низкой внутренней направленности, что позволяет клеткам, чтобы исследовать их местным условиям.

Сотовые миграция представляет собой сложный процесс, в начальной клеточной реакции происходят поляризация и продолжается выступы в направлении миграции 2. Традиционные методы измерения миграции, таких как миграция анализа Бойден камеры простой способ измерения хемотаксис в пробирке, который позволяет измерить миграцию как результат конечной точки. Однако, этот подход позволяет ни измерения отдельных параметров миграции, а также не позволит видеотехникакристаллизации морфологические изменения, которые клетка претерпевает в процессе миграции.

Здесь мы представляем метод, который позволяет нам отслеживать миграцию клеток в реальном времени с помощью видео - микроскопия промежуток времени. Поскольку миграция клеток и вторжения являются признаками рака, этот метод будет применяться в изучении рака миграции клеток и вторжение в пробирке. Случайные миграции тромбоцитов была рассматриваться в качестве одного из параметров тромбоцитов 4 функция, следовательно, этот метод также может быть полезно в изучении функции тромбоцитов. Этот тест имеет то преимущество, что быстрые, надежные, воспроизводимые и не требует оптимизации числа клеток. В целях сохранения физиологически благоприятные условия для клетки, микроскоп снабжен CO 2 и температуры подачи термостата. Сотовые движение контролируется фотосъемки с помощью камеры устанавливается на микроскоп на регулярной основе. Сотовые миграция может быть вычислена путем измерения средней скорости иverage перемещения, который рассчитывается путем программного Slidebook.

Protocol

1. Подготовка плиты покрывают коллагеном

  1. Развести коллаген в конечной концентрации 10 мкг / мл Opti-сувениры СМИ.
  2. Пальто 6 хорошо пластин с коллагеном, добавляя 1,5 мл с шагом 1 в каждую лунку. Выдержите в течение ночи при 4 ° C.
  3. На следующий день, мыть пластину 2 раза 1x фосфатного буфера (PBS) и хранить их в PBS.

2. Подготовка клетки и посев на 6-и плиты

Примечание: используйте теплую СМИ и PBS для обеспечения оптимальных условий для движения клетки

  1. Рост MDA-MB-231 (инвазивный рак молочной железы клеточная линия) редко в Дульбеко изменения Eagle среднего (DMEM) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). В этом примере мы используем MDA-MB-231, однако, этот метод может быть применен к любой приверженец раковых и не раковых клеточных линий.
  2. Промойте клетки в два раза теплой 1x PBS и собирать по трипсинизации. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы суповторно, что клетки правильно отделяться от лечения трипсином.
  3. Сбор клеток путем добавления DMEM среде с 10% FBS, мягко спином вниз клетки в 1000 г в течение 5 минут. Ресуспендируйте осадок клеток осторожно DMEM среде с 10% ЭТС.
  4. Перерыв осадок клеток с помощью пипетки и осторожно. Важно, чтобы сломать клетку кластеров в отдельных клетках, насколько это возможно.
  5. Подсчитайте клетки и развести до конечной концентрации 50 000 кл / мл в DMEM среде с 10% ЭТС. Внесите 2 мл в каждую лунку.
  6. Инкубируйте планшет при 37 ° С в культуре ткани инкубаторе на ночь, до начала покадровой микроскопии.
  7. Чтобы обеспечить достаточное пространство для миграции, создания раны помощью кончика пипетки, вымыть тарелку с 1X PBS для удаления мусора (образуются в результате раны) и добавить DMEM с 10% ЭТС. Проверка под микроскопом плавающие клетки. Если большое количество клеток с плавающей повторить промывку. Теперь пластина готова к установке намикроскоп для получения изображений.

3. Установка микроскопа и автоматизированной обработки изображения

Есть несколько изображений программные пакеты, которые контролируют микроскоп для автоматического получения изображения. Здесь мы используем Slidebook 5,0 обработки изображений и автоматическое приобретение осуществляется на микроскопе Olympus (Olympus IX81), связанной с EM-C9100 Hamamatsu камерой, которая отлично подходит для живых клеток приложений, где скорость сбора и минимальное фототоксичности имеет первостепенное значение. Система включает в себя этап верхней палаты экологического контроля (Neue живой клетки) и автоматизированных этапе XY контроллер (До Проскан). Изображения, полученные с 10X UPLANFL Ph1/0.30 цели, в ярком режиме поля, используя определенный промежуток времени. Следующий протокол описывает получения изображений.

  1. Включите микроскоп, фотоаппарат, и живые изображения аппарата клетки. Установите пластину на микроскопические стадии. Обложка пластинки Сотовые окружающей Neue Онлайнэкологической управление камерой, которая связана с CO 2 питания и датчиков температуры. Установите термостат при температуре 37 ° C и CO 2 на уровне 5%.
  2. SlideBook программное обеспечение позволяет полностью автоматизировать объективный выбор, выбор длины волны и легкое переключение между флуоресцентным и яркие методы поле. Для того, чтобы настроить различные параметры фокусировки, открытые SlideBook программы> перейдите к меню> выберите управление фокусом, нажав> Цифра 0 Кнопка 1 и выберите следующие параметры:
    1. В разделе «Цель окна" определить цели, выбор из выпадающего окна. Обратите внимание, что мы используем этапе цель и вручную выбрать соответствующий кольцо этап в конденсаторе. При использовании системы с автоматизированными конденсатор, это автоматически будет установлен через программу. Кроме того, если ни одна из целей башни, ни конденсатор автоматизированы они должны каждый быть выбран ручнойют.
    2. В «Набор фильтров" коробке:
      1. Выберите настройки, чтобы направить световой поток в любой окуляр или камеру из выпадающего списка, чтобы увидеть доступные фильтры ("Live" на окуляр "Широкоугольные" для камеры в нашей системе).
      2. Выберите подходящий фильтр для светлого освещения (в нашем настройки, эта опция называется "ДВС", который представляет собой открытую позицию на пути света светлого).
      3. Выбор источника света, нажав кнопку "Открыть Светлый", чтобы открыть яркие выдержки области.
  3. Для просмотра образца под окуляр, выберите яркие поле фильтра (положение "6" в нашей системе) на турели. После первоначального просмотра образца через окуляр, чтобы найти соответствующие поля и принести образец в центре внимания (шаги 3.2.1 3.2.2.3). Переместить фильтр башни изменить путь света в камеру для захвата изображения (положение "1" в нашей системе).
  4. Автоматизированный этап позволяет выбирать различные XY координациюТЭС для захвата нескольких областях, представляющих интерес в приобретении изображений. В программном обеспечении SlideBook, перейдите в центре управления, выберите "XY", выбрать разные позиции, хотя глаза кусок, затем нажмите кнопку "уставки" замок в каждом месте для захвата изображения (рис. 1).
  5. Точная настройка фокуса камеры изображения, просматривать на экране. Это может быть достигнуто путем либо с помощью ручного управления на микроскоп или компьютер управления, который может настроить фокус в гораздо шагом мельче.
  6. Используя элементы управления в "Фокус управления" окна настройки Z позицию на сцене. Для достижения наилучших результатов, сосредоточиться на плоский сотовый выступов вблизи контакта с пластиной.
  7. Чтобы помочь с фокусировкой использовать ползунок для регулировки экспозиции, чтобы быть в соответствующем диапазоне фокусировки. Если несколько позиций XY были отобраны, настроить фокус для каждого отдельного положения: В фокусе управления> XY> Визит точки. Примечание: это делается, чтобы убедиться, тыс.на месторождениях правильно ориентированы на оптимальный снимок.
  8. Используйте программное обеспечение для настройки параметров захвата окна. В SlideBook, откройте захвата, выбрав Цифра 0 Кнопка 2 в строке меню. См. Рисунок 2. Затем проверьте следующие параметры.
    1. Проверьте Захват типа> как промежуток времени.
    2. Проверьте набор фильтров: Широкое поле: DIC (для яркого изображения поля).
    3. "Захват Временной интервал" является число временных точек, которые будут захвачены (она может варьироваться, в зависимости от типа клеток). Продолжительность составляет общая протяженность времени для экспериментов. Единицы измерения времени [в миллисекундах (мс), секундах (с), минут (м) или часов (час)] может быть выбран из выпадающего меню.
    4. "Интервал" является задержка между началом одного timepoint и в начале следующего timepoint. При вводе в двух из этих значений, третье поле будет рассчитана автоматически.
    5. Несколько захвата XY: выберите "мультисписок точек "более чем на 1 XY позиции.
    6. Имя файла. В данном примере, мы назвали его '231 '.
  9. Чтобы избежать неожиданных выключение компьютера в связи с несколькими изображениями, использовать «катушку вариант" для сохранения файла. Это не является обязательным, однако настоятельно рекомендуется. Для этого, по захвату Contro л> выберите Advanced> Spool> Захват памяти и сохранить в файл очереди после каждого момента времени. Просмотрите папку для сохранения файлов слайд книги (рис. 3). Созданный фильм можно будет импортировать в указанном месте. Шаги микроскопа установки были суммированы в файл 3,1 .

4. Обработки изображений и анализа миграции: Расчет скорости и перемещения

В этом примере, обработка изображений производится SlideBoОК 5, 6 5.0. Существуют и другие программы, такие как ImageJ 7 для обработки и анализа изображений.

  1. Импорт SlideBook файлы, созданные с изображениями различных областях в различные моменты времени. К меню> в меню Image> Import> Авто книги катушку> выберите нужный файл (рис. 4а).
  2. Здесь наша цель отслеживать движение отдельных клеток. Это можно сделать с помощью автоматического отслеживания или индивидуального сопровождения. В этом примере мы использовали ручной слежения, так как это облегчает исключает артефакты легко, который является более сложным с автоматического отслеживания.
  3. Откройте файл SlideBook, в которых мы должны выполнить слежения. В меню выберите Mask> Протокол частиц отслеживания> Руководство частиц отслеживания протокола (рис. 4б). На экране появится окно с начальным и конечным моментами времени (рис. 4в).
  4. Бегип отслеживать движение отдельных клеток, нажав кнопку в центре каждой клетки (ядра). Отслеживать около 10 клеток из каждого фильма и по крайней мере трех различных фильмов должны быть выбраны из разных мест, так что около 30 клеток будут проанализированы с одного эксперимента. Каждый эксперимент следует повторить три раза. Для обеспечения объективного подхода, выделите ячейки из разных мест, таких как некоторые клетки от передней, средней, углы и т.п. Нажмите "OK", когда отслеживание осуществляется.
  5. Случайные миграции могут быть проанализированы с помощью измерения изменений скорости и т.д., скорости или смещения Для анализа данных, в меню> выберите маску> частица отслеживания> частица отслеживания протокола. Выберите параметры отслеживания, как описано ниже: (рис. 5а):
    1. Трек с - выбор параметров, которые вы хотите отслеживать из выпадающего списка. В этом примере мы использовали, центр района (координаты центра ОбьJect).
    2. Нажмите кнопку "отслеживать и продолжить». После отслеживания завершен, это автоматически перейдет к следующему шагу.
  6. Выберите нужный статистику по каждому пути, такие, как перемещение и средней скорости (см. рис 5б):
    1. Средняя скорость - общее пройденное расстояние, деленное на время прохождения этого расстояния.
    2. Всего Водоизмещение - общее расстояние, пройденное объектом.
    3. Нажмите кнопку "Рассчитать и продолжить", если вы хотите, чтобы перейти к следующему шагу, или просто выбрать "Рассчитать", если вы хотите просмотреть статистику, не переходить к следующему шагу. Будет создан файл, который может быть сохранен в текстовый файл и в дальнейшем могут быть экспортированы в Excel.
  7. Для того, чтобы отслеживать объекты, используя автоматизированный протокол слежения, сначала маска должна быть создана.
    1. Выберите Mask> сегмента Image> сегмент окно будет появляться> выбрать до порога достигается такой, что сентябрьarating один объект от других> нажмите Применить> ОК (рис. 5в). Шаг 4.5.1 то же самое.
    2. Удаление объектов меньше, чем - Этот флажок, чтобы выборочно удалить объекты меньше заданного размера. Введите размер в поле ввода и выбрать один микрон или пиксели в качестве единицы. Это используется для удаления артефактов, часто вызваны мусора.
    3. Минимальное движение - ввести минимальное количество времени, моменты, которые необходимо отслеживать для того, чтобы определить пути.
    4. Максимальное движение - Введите максимальное движение, которое можно ожидать от любого объекта из одного момента времени к следующему.
    5. Шаги для анализа данных, такие же, как руководство слежения (см. шаги 4.5.2 на 4.6.2).

5. Представитель Результаты

Примером случайного анализа миграции как количественно с точки зрения скорости и перемещения (рис. 6). После экспорта файл то Excel, данные отображается с использованием окна и усы сюжет. Статистический анализ сравнения общим водоизмещением и среднюю скорость движения между основной и контрольной осуществляется с помощью теста Манна-Уитни. Тестовый образец показывает увеличение средней скорости по сравнению с контролем. Тестовый образец показывает увеличение общего смещения по сравнению с контролем.

Фильм контроля и испытаний: Управление MDA-MB-231 и тест MDA-MB-231 клеток высевали на коллаген ночь. Покадровый видео микроскопа была выполнена под микроскопом Olympus, связанной с EM-Хамамацу камеры. Изображения взяты с интервалом в 1 час в общей сложности 18 часов во время случайных миграции. Пожалуйста, смотрите фильм 1 и фильм 2 случайные миграции управления и испытания образцов.

Микроскоп установки:

Рисунок 1
Рисунок 1. Настройка нескольких точек на изображении захватить.

Рисунок 2
Рисунок 2. Шагов изображающие захвата контроля. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3
Рисунок 3. Как сохранить несколько изображений.

dflinebreak "> Обработка изображений и анализа миграции.

На рисунке 4а
Рисунок 4а. Шаги для импорта изображений для анализа данных.

Рисунок 4б
Рисунок 4б. Шаги для анализа данных с использованием частиц отслеживания протокола.

Рисунок 4c. Окна изображающие путь длиной гусеничных частиц.

Этапы анализа данных.

На рисунке 5а
Рисунок 5а. Шаги изображающие параметры частиц протокол слежения.

На рисунке 5б
На рисунке 5б. Выбор пути статистику для анализа.

На рисунке 5в
На рисунке 5в. Шаги для создания маски для автоматического отслеживания протокола.

Рисунок 6
Рисунок 6. Средняя скорость движения (рис.6а) и смещения (рис. 6б) строится на участке усы. Тестовый образец показывает увеличение скорости и перемещения как по сравнению с контролем.

Кино

Фильм 1. Миграция контрольных клеток. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Фильм 2. Миграция тест клеток. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Управление MDA-MB-231 и тест MDA-MB-231 клетки высевают редко на коллаген для ночлега. Покадровый видео микроскопа была выполнена под микроскопом Olympus, связанной с EM-Хамамацу камеры. Изображения взяты с интервалом в 1 час в течение 18 часов во время случайных миграции. Пожалуйста, смотрите фильмы случайных миграции для контроля и испытаний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В режиме реального времени случайного анализа миграции позволяет точно, чувствительный, анализ миграции клеток такие параметры, как скорость и перемещение. Этот метод не ограничивается до конца значение точки измерения, следовательно, количественные. Так, клетки контролируется в нормальной средой DMEM с сывороткой, это уменьшает вредное воздействие больше инкубации в сыворотке крови свободных средств массовой информации. Было показано, что миграция клеток зависит от форматирования и разрушение клетки контактов с субстратом 8, таким образом, этот метод может быть использован для изучения влияния различных субстратов по вопросам миграции.

Одним из важнейших шагов включает в себя надлежащий контроль температуры до 37 ° C и CO 2 на уровне 5% для обеспечения оптимальной миграции. Анализ позволяет гибко контролировать миграционные ответы на желаемые моменты времени, однако она может потребовать оптимизации числа моментов времени. Например, некоторые клетки, имеющие низкие показатели миграции, возможно, придется проводить мониторинг вотnger времени по сравнению с клетками, имеющие более высокий уровень миграции.

Микроокружение опухоли является одним из решающих факторов в канцерогенезе. Рак результате взаимодействия опухолевых клеток с окружающей клетки, такие как эндотелиальные клетки, стромальные и воспалительных клеток 9. Этот анализ может быть изменен, чтобы изучить, как миграции опухолевых клеток под влиянием микроокружения. Один из способов, в которых она может быть достигнуто путем изучения миграции флуоресцентно меченных опухолевых клеток, выращенных в смешанной популяции различных клеток, таких как стомы и эндотелиальных клеток. Этот метод может также быть использована для изучения заживления ран в режиме реального времени.

Покадровый микроскопии может быть изменен, чтобы контролировать вторжения клетки, деление клеток, апоптоз и lamellipodial динамика и координационные динамики адгезии использованием линз выше разрешение.

Одним из недостатков этого метода является то, что он не позволит контролировать миграциюТион в естественных условиях. Поскольку не существует оборудованием, которое может измерить реальную время миграции в организме, этот тип анализа не подходит для миграции в естественных условиях. Это также не позволит нам выяснить биохимические механизмы и сигнализации компонентов, которые играют важную роль в миграции клеток. В целях решения сигнальных путей, важно выполнять биохимические эксперименты. См. ссылки на группы, которые использовали этот метод для случайных миграции 6, 10-14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Amanda Struckhoff для начальной помощь в проведении эксперимента. Эта работа была поддержана грантом от NIH 5RO1CA115706.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30243.01
FBS Gemini Bio Products 100-106
Opti-Mem Invitrogen 31985-070
Collagen BD Biosciences 354231
Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller Olympus Corporation Olympus 1X81
Environmental control chamber Neue Neue Live Cell Chamber Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments.
Automated XY stage Prior Scientific Prior Proscan This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy.
Camera Hamamatsu EM camera C9100
Software Typically purchased through microscope vendor such as Olympus Slide Book 5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
  2. Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
  5. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
  6. Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
  7. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
  8. Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
  9. Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
  10. Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
  11. Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
  12. Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
  13. Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
  14. Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).

Tags

Клеточной биологии выпуск 63 миграции в режиме реального времени промежуток времени видеомикроскопии
Количественный анализ случайных миграции клеток помощью замедленной видео микроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jain, P., Worthylake, R. A.,More

Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. J. Vis. Exp. (63), e3585, doi:10.3791/3585 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter