Summary
وتوليفها نحن والتماثلية رواية من pancratistatin مع النشاط المضاد للسرطان قابلة للمقارنة كما pancratistatin الأصلية؛ ومن المثير للاهتمام، والعلاج توفيقية مع عقار تاموكسيفين أسفرت عن زيادة هائلة في الاستقراء وأفكارك autophagic بواسطة الميتوكوندريا استهداف مع تأثير ضئيل على الخلايا الليفية نونكانكيرووس. وبالتالي، يمكن أن JCTH-4 في تركيبة مع عقار تاموكسيفين توفير بيئة آمنة لمكافحة السرطان العلاج.
Abstract
سرطان الثدي هو واحد من أكثر أنواع السرطان انتشارا بين النساء في أمريكا الشمالية. كثير الحالية لمكافحة سرطان العلاجات، بما في ذلك الإشعاعات المؤينة، تحفز الخلايا عن طريق الحمض النووي من التلف. لسوء الحظ، مثل هذه العلاجات هي غير انتقائي على الخلايا السرطانية وإنتاج سمية مماثلة في الخلايا الطبيعية. وأفادت نحن الحث الانتقائي لموت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية التي pancratistatin مركب طبيعي (PST). مؤخرا، أصدر رواية PST التماثلية، وهو مشتق C-1 acetoxymethyl من deoxypancratistatin-7 (JCTH-4)، عن طريق التخليق نوفو دي ويجعلها تظهر المقارنة يحفز الخلايا انتقائية النشاط في العديد من خطوط الخلايا السرطانية. في الآونة الأخيرة، وقد تورط الالتهام الذاتي في الأورام الخبيثة على حد سواء المؤيدة للبقاء على قيد الحياة وآليات الموت الموالية للاستجابة للعلاج الكيميائي. وقد أثبت عقار تاموكسيفين (TAM) دائما تحريض المؤيدة لبقاء الالتهام الذاتي في العديد من أنواع السرطان. في هذه الدراسة، ومدى فعالية JCTH-4 وحده، وبالاشتراك مع تام للحث على موت الخلايا في الثدي cance الإنسانتم تقييم R (MCF7) والعصبية (SH-SY5Y) الخلايا. TAM وحدها التي يسببها الالتهام الذاتي، ولكن ضئيل موت الخلايا في حين JCTH-4 وحدها تسبب تحريض كبير من الخلايا مع بعض تحريض الالتهام الذاتي. ومن المثير للاهتمام، تسفر عن معالجة توفيقية زيادة كبيرة في الحث أفكارك وautophagic. رصدنا المعتمدة على الزمن تغيرات شكلية في الخلايا التي تمر MCF7 TAM الناجم عن الالتهام الذاتي، JCTH-4-الناجم عن موت الخلايا المبرمج والالتهام الذاتي، وتسريع موت الخلايا مع العلاج اندماجي استخدام الوقت الفاصل بين المجهري. وقد أثبتنا هذه المركبات للحث على موت الخلايا المبرمج / الالتهام الذاتي من خلال استهداف الميتوكوندريا في هذه الخلايا السرطانية. الأهم من ذلك، فإن هذه العلاجات لا تؤثر على بقاء الخلايا الليفية الإنسان نونكانكيرووس. وبالتالي، فإن هذه النتائج تشير إلى أنه يمكن استخدام JCTH-4 في تركيبة مع TAM كعلاج مضاد للسرطان آمنة وفعالة جدا ضد سرطان الثدي والخلايا العصبية.
Protocol
مقدمة
موت الخلايا المبرمج، أو اكتب أنا موت الخلايا المبرمج، هو عملية الفسيولوجية التي يمكن أن تعمل خارجيا، عن طريق ربط ليجند الموت لمستقبلات الموت، أو جوهرها. يبدأ المسار لا يتجزأ من موت الخلايا المبرمج من قبل إجهاد الخلايا مثل الحمض النووي من التلف والخلل الميتوكوندريا، وهذا يؤدي في النهاية إلى permeabilization من تبديد، الميتوكوندريا من المحتمل غشاء الميتوكوندريا (MMP)، وإطلاق سراح من العوامل apoptogenic من الفضاء intermembrane الميتوكوندريا، وتنفيذها لاحقا من موت الخلايا المبرمج 1.
الالتهام الذاتي هو عملية في أي خلية فواصل، ويتحلل، وقامت بتدوير مكوناته داخل الخلايا الخاصة بها مع المحافظة على سلامة غشاء البلازما، يتم تشغيلها من قبل أنواع مختلفة من الضغوط الخلوية بما في ذلك الاكسدة، نقص الأكسجين، والمجاميع البروتين، والحرمان من المواد الغذائية، ونمو الحرمان عامل، و العضيات التالفة 2. في المراحل الأوليةمن هذه العملية، يتم غمر المواد عصاري خلوي بواسطة autophagosomes، حويصلات المزدوج membraned، التي تلتحم لlysosomes لتشكيل autolysosomes. بعد اندماج الليزوزومية، والمواد عصاري خلوي المتخذة سابقا من قبل autophagosomes هي التي تدهورت بفعل الانزيمات الليزوزومية 2. تفعيل واسعة من هذا الممر ينتج تدهور واسع من مكونات داخل الخلايا التي قد تؤدي إلى موت الخلايا autophagic أو النوع الثاني من موت الخلايا المبرمج 3.
وقد اعتبر التهرب من موت الخلايا واحدة من السمات المميزة لمرض السرطان 4. السرطان هو مرض يتميز نمو الخلايا غير المنضبط وانتشارها 5. على وجه الخصوص، العصبية تنشأ من تطوير خلايا عصبية من الجهاز العصبي الودي من قمة العصبية 6. هذا هو الورم الأكثر شيوعا الصلبة التي تحدث عند الأطفال الصغار، وهو ما يمثل حوالي 9٪ من جميع سرطانات الطفولة 7. على الرغم من إحراز تقدم كبير حتى الآن، وهذا المرض لا يزال مشكلةإلى كل من العلماء والأطباء الأساسية. من ناحية أخرى، وسرطان الثدي هو أكثر أنواع السرطان شيوعا بين الإناث 8. وقد تاموكسيفين (TAM) كثيرا ما تستخدم لعلاج سرطان الثدي في هرمون التي تستجيب باعتبارها مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) خصم 9. ومع ذلك، فإن تقارير أخرى تقدم أدلة على آليات مستقلة إضافية من موت الخلايا المبرمج من قبل التعريفي تام. على وجه الخصوص، TAM يتفاعل مع مجمع الأول من السلسلة التنفسية الميتوكوندريا (MRC) في فلافين وحيد النوكليوتيد والخمسين (أحادي نوويد الفلافين) موقع 10.
توقيت المحيط الهادي هو مركب طبيعي معزول من نبات littoralis Hymenocallis. المتناقضة من مبحث المعالجة الكيميائية العديد من المستخدمة حاليا، فقد تبين للحث على موت الخلايا المبرمج، وبطريقة غير ذات سمية جينية، بشكل انتقائي في مختلف أنواع الخلايا السرطانية من خلال الميتوكوندريا التي تستهدف 11-15. ومع ذلك، وعرقل عمل قبل السريرية والسريرية التي توفر له، بل هو موجود في كميات قليلة جدا في مصدرها الطبيعي والعديد من complications عبء لها تركيب كيميائي. وتوليفها، ونحن فحص نظائرها الاصطناعية من deoxypancratistatin-7، ولاحظ مماثلة مضادة للسرطان في نشاط مشتق C-1 acetoxymethyl، JC-TH-خلات-4 (JCTH-4) 16. لدينا الآن في متناول اليد والتماثلية PST الاصطناعية مع نشاط مضاد للسرطان قوي. وكان توليف لها موحدة ويمكن زيادتها لإنتاج كميات كافية للعمل قبل السريرية والسريرية. منذ الطبيعية PST تام على حد سواء، والهدف من الميتوكوندريا، سيكون من المهم للتحقيق في التأثير المشترك لالتناظرية الاصطناعية من PST حول سرطان الثدي والخلايا العصبية البشرية بالاشتراك مع تام.
هنا، ونحن التقرير السمسة الانتقائي للJCTH-4 في العصبية البشرية (SH-SY5Y) وغدية الثدي (MCF7) الخلايا. وكان JCTH-4 قادرة على حمل الخلايا في كل من خطوط الخلايا من خلال استهداف الميتوكوندريا؛ JCTH-4 تسبب تبديد MMP وزيادة في أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) الإنتاج في mitoch معزولةondria من هذه الخلايا السرطانية. وعلاوة على ذلك، وكان المستحث الالتهام الذاتي من قبل JCTH-4 في MCF7 الخلايا. ومن المثير للاهتمام، إضافة إلى إهانة TAM-4 JCTH تعزيز الآثار المذكورة أعلاه JCTH-4 في SH-SY5Y والخلايا MCF7. تم رصد تغيرات شكلية الناجمة عن JCTH-4 و TAM حده، وبالاشتراك في MCF7 الخلايا عبر مرور الزمن المجهر النقيض من المرحلة أو الصور مجال مشرق. عرضت طبيعي الليفية الجنين البشري (NFF) انخفاض ملحوظ في حساسية للJCTH-4 على حد سواء وحده، وبالاشتراك مع تام. ولذلك، فإن هذه الملاحظات توحي JCTH-4، وحده، ومع تام، لتكون آمنة وفعالة وكيل العلاج الكيميائي ضد سرطان الثدي، والعصبية.
المواد وطرق
1. خلية ثقافة
- تنمو وثقافة SH-SY5Y الخلايا العصبية البشرية (آي تي سي سي، القط. الولايات المتحدة الأمريكية رقم CRL-2266، ماناساس، فرجينيا،) مع متوسط Dulbecco للنسور معدلة F-12 HAM (سيغما الدريخ، ميسيسوجا، ON، كندا) تستكمل مع 2 مم L-glutaminه، و 10٪ الجنين مصل بقري (FBS) و 10. ملغ / مل جنتاميسين (Gibco BRL، VWR، ميسيسوجا، ON، كندا) الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- تنمو وثقافة MCF7 غدية الثدي خلايا (آي تي سي سي، القط. رقم HTB-22، ماناساس، فرجينيا، الولايات المتحدة الأمريكية) في المتوسط-1640 RPMI (سيغما الدريخ كندا، ميسيسوجا، ON، كندا) تستكمل مع معيار FBS 10٪ (الحرارية العلمي، والتايم، ماجستير) و 10 ملغ / مل جنتاميسين (Gibco BRL، VWR، ميسيسوجا، ON، كندا). الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- تنمو وثقافة العادي على ما يبدو الخلايا الليفية الجنين البشري (NFF) خط الخلية (Coriell معهد للبحوث الطبية، القط. رقم AG04431B، كامدن، ونيو جيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية) في متوسطة Dulbecco ومعدلة النسر، وارتفاع نسبة الجلوكوز (الحرارية العلمية، التايم، ماجستير، الولايات المتحدة الأمريكية ) تستكمل مع FBS 15٪ و 10 ملغ / مل جنتاميسين (Gibco BRL، VWR، ميسيسوجا، ON، كندا). الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
2. تحضير المخدرات
- وزن من عقار تاموكسيفين (TAM) سترات الملح (سيغما الدريخ، القط. رقم T9262، ميسيسوجا، ON، كندا) وحله في DMSO لإعداد حل الأوراق المالية 10 مم. مخزن حل الأوراق المالية في -20 درجة مئوية حتى استخدامها. ضوابط استخدام جميع السيارات في هذه الدراسة الواردة DMSO في أقل من 0.5٪.
- كرر الخطوة 2.1 لإعداد حل الأوراق المالية 1 ملم الذائبة في DMSO من 4-JC-TH-خلات (JCTH-4)، التي تنتجها تركيب chemoenzymatic من بروموبنزين كما هو موضح سابقا 16. مخزن حل الأوراق المالية في -20 درجة مئوية حتى استخدامها. ضوابط استخدام جميع السيارات في هذه الدراسة الواردة DMSO في أقل من 0.5٪.
3. الوقت الفاصل بين الميكروسكوب
- لوحة ما يقرب من 2.0 X 10 5 MCF7 الخلايا في أطباق زجاجية 35 ملم ثقافة القاع (شركة ماتيك، القط. رقم P35G-014-C، آشلاند، MA، الولايات المتحدة الأمريكية) في ظروف معقمة لمجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية، وتمكينهم من النمو في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- عندما تصل خلايا التقاء 60 الى 70٪، تعاملهم مع 1 ميكرومتر JCTH-4 باستخدام ملي 1حل سهم الذائبة في DMSO و 10 ميكرومتر تام باستخدام محلول المخزون 10 ملي الذائبة في DMSO، وحده، وبالاشتراك في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية.
- بعد علاج الخلايا لمدة 48 ساعة، وخلايا مكان في غرفة ساخنة على 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 على مرحلة من مراحل المجهر DMI6000 ايكا فلوري (ايكا مايكروسيستمز، يتزلا، ألمانيا).
- باستخدام LAS AF6000 البرمجيات، ووضع المجهر على اتخاذ النقيض من مرحلة أو الميكروسكوب مجال مشرق في التكبير 400X كل 5 دقائق لمدة 18 ساعة.
4. تلطيخ النووية
- لوحة ما يقرب من 2.0 X 10 5 MCF7 أو خلايا SH-SY5Y في كل بئر من 6 لوحة أسفل واضح تماما زراعة الأنسجة في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية، والسماح لهم أن ينمو بمعدل 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- عندما تصل خلايا التقاء 60 الى 70٪، تعاملهم مع 1 ميكرومتر JCTH-4 باستخدام محلول المخزون 1 ملم الذائبة في DMSO و 10 ميكرومتر تام باستخدام محلول المخزون 10 ملي الذائبة في DMSO، على حد سواءحده، وبالاشتراك في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية.
- احتضان الخلايا التي تحتوي على العلاجات المذكورة أعلاه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة (SH-SY5Y الخلايا) أو 72 ساعة (MCF7 الخلايا).
- بعد العلاج، وحضانة للخلايا مع المخدرات، وإضافة مباشرة هويشت 33342 صبغ (المسابر الجزيئية، يوجين، OR، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى وسائل الإعلام من الخلايا المعالجة إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر إلى وصمة نوى.
- احتضان الخلايا مع صبغة هويشت لمدة 5 إلى 10 دقائق محمية من الضوء.
- وضع لوحة على مسرح المجهر مارك ألماني لايكا IRB مضان مقلوب (لايكا مايكروسيستمز، يتزلا، ألمانيا).
- أخذ الميكروسكوب الفلورسنت ومرحلة في التكبير 400X.
5. Annexin الخامس مقايسة ربط
- لوحة ما يقرب من 5.0 X 10 5 MCF7، SH-SY5Y، أو خلايا NFF في 10 مل من زراعة الأنسجة لوحات في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية، والسماح لهم أن ينمو بمعدل 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- Wخلايا الدجاجة تصل إلى التقاء 60 الى 70٪، تعاملهم مع 1 ميكرومتر JCTH-4 باستخدام محلول المخزون 1 ملم الذائبة في DMSO و 10 ميكرومتر تام باستخدام الأوراق المالية 10 ملم حل الذائبة في DMSO، على حد سواء وحده، وبالاشتراك في السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية مجلس الوزراء.
- احتضان الخلايا التي تحتوي على العلاجات المذكورة أعلاه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة (SH-SY5Y الخلايا) أو 72 ساعة (MCF7 والخلايا NFF).
- إعداد Annexin V عازلة ملزم في DDH 2 O مع HEPES 10 ملم، 10 ملم هيدروكسيد الصوديوم، 140 مم كلوريد الصوديوم، و 1 CaCl 2 مم عند 7.6 أس هيدروجيني ومخزن في 4 درجات مئوية حتى استخدامها.
- بعد العلاج، وحضانة للخلايا مع المخدرات، وإزالة وسائل الإعلام من لوحات تحتوي على خلايا مع وقف التنفيذ ووضعه في أنبوب منفصل 15 مليلتر مخروطي الشكل لكل مجموعة معاملة مختلفة وصفت مع العلاج المناسب.
- فصل الخلايا الملتصقة من لوحات باستخدام التربسين.
- بعد الخلايا رفعها من لوحة نتيجة للالتربسين، نضح في وسائل الاعلام وضعت في مخروطي 15 مليلترآل أنبوب في الخطوة 5.4 ووضعه مرة أخرى في لوحات الأصلية مع الخلايا التربسين مع وقف التنفيذ.
- مع حشو ماصة الالكترونية والماصات المصلية، مزج وسائل الإعلام مع حل الخلية التربسين ووضع هذا الخليط مرة أخرى في المقابلة أنابيب مخروطية 15 مل.
- منبذة الخلايا في 600 XG لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف من كل أنبوب، وخلايا resuspend في برنامج تلفزيوني.
- منبذة الخلايا في 600 XG لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف من كل أنبوب، وخلايا resuspend في أنابيب microfuge المسمى مع حوالي 50 حتي 70 ميكرولتر من العازلة الخامس Annexin ملزم.
- إضافة Annexin V-AlexaFluor 488 (1:50) (سيغما الدريخ، ميسيسوجا، ON، كندا)، وصبغ هويشت إلى تركيز النهائي من 10 ميكرون، واحتضان لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء.
- حضانة التالية، ودوامة واحدة من أنابيب microfuge، إضافة 7-10 ميكرولتر من خليط الخلية إلى شريحة المجهر، ووضع فاق ساترة من خليط الخلية على microscopالشرائح الإلكترونية، واتخاذ الميكروسكوب فلوري، على حد سواء Annexin الخامس وهويشت الصور لكل رأي، في التكبير 400X على العائد المحلي مارك ألماني لايكا مقلوب مضان المجهر (لايكا مايكروسيستمز، يتزلا، ألمانيا). كرر ذلك لكل عينة تجريبية في كل من أنابيب microfuge المتبقية.
6. المياه المالحة Tetrazolium القابلة للذوبان (WST-1) الفحص لبقاء الخلية
- يعرض للتريبسين 1 متكدسة T75 قارورة أو 10 سم زراعة الأنسجة طبق من MCF7، SH-SY5Y، أو خلايا NFF في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية.
- بعد أن تم رفع هذه الخلايا، إضافة 5-10 مل من وسائل الإعلام إلى التربسين ووضع تعليق وسائل الاعلام الخلية في أنبوب 15 مليلتر مخروطي.
- منبذة الخلايا في 600 XG لمدة 5 دقائق، ووضع أنبوب مرة أخرى إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، وإزالة طاف من كل أنبوب، وresuspend الخلايا في حوالي 1 إلى 3 مل من وسائل الاعلام تبعا لحجم الخلية بيليه.
- 10 ميكرولتر مكان لتعليق الخلية في أنبوب microfuge، إضافة 10 ميكرولتر من زرقة التريبان صبغ (Sigma الدريخ، ميسيسوجا، ON، كندا)، ومزيج مع micropipette.
- تحميل 10 ميكرولتر من الخلايا أزرق التريبان علقت على haemocytometer (Hausser العلمية، الولايات المتحدة الأمريكية)، عد الخلايا، وحساب تركيز خلايا تعليق الخلية في أنبوب الأصلي المخروطية ال 15 مل.
- استخدم هذا التركيز على تحديد حجم التعليق الخلية الأصلية اللازمة لإنشاء تعليق خلية المخفف مع تركيزات 1.5 × الخلايا 5 10 / مل لMCF7 وSH-SY5Y و 5.0 X 10 4 لخلايا NFF اللازمة للتصفيح.
- استخدام المعلقات الخلية المخففة إلى لوحة 15 × 10 3 MCF7 أو خلايا SH-SY5Y / جيد أو 5.0 X 10 خلايا NFF 3 / جيد بإضافة 100 ميكروليتر من الايقاف الخلية المخفف إلى كل بئر من 96 لوحة أسفل جيد واضح زراعة الأنسجة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها.
- علاج الخلايا مع 1 ميكرومتر JCTH-4 و 10 ميكرومتر تام على حد سواء وحده، وبالاشتراك في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية لمدة 72 ساعةق لMCF7 والخلايا NFF، ولمدة 48 ساعة لSH-SY5Y الخلايا.
- بعد العلاج، وحضانة من المخدرات، وإضافة 10 ميكرولتر من WST-1 الكاشف (روش العلوم التطبيقية، انديانابوليس، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى كل جيدا، واحتضان لوحة لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- أخذ قراءات الامتصاصية في 450 نانومتر على فيكتور Wallac 3 عداد Multilabel 1420 (PerkinElmer، وودبريدج، ON، كندا)، والتعبير عنها كنسبة مئوية من مجموعات المراقبة مذيب.
7. Tetramethylrhodamine الميثيل استر (TMRM) تلطيخ
- وضع ساترة إلى كل بئر من 6 لوحة أسفل واضح تماما زراعة الأنسجة والخلايا لوحة MCF7 في كل بئر من 6 جيدا نسيج لوحة الثقافة في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية. تسمح لهم أن ينمو بمعدل 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2.
- عندما تصل خلايا التقاء 60 الى 70٪، تعاملهم مع 1 ميكرومتر JCTH-4 باستخدام محلول المخزون 1 ملم الذائبة في DMSO و 10 ميكرومتر تام باستخدام محلول المخزون 10 ملي الذائبة في DMSO،على حد سواء وحده، وبالاشتراك في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية.
- احتضان الخلايا التي تحتوي على العلاجات المذكورة أعلاه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 72 ساعة.
- بعد العلاج، وحضانة للخلايا مع المخدرات، وإضافة مباشرة هويشت 33342 صبغ (المسابر الجزيئية، يوجين، OR، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى وسائل الإعلام من الخلايا المعالجة إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر إلى وصمة عار في نوى وكذلك tetramethylrhodamine الميثيل استر (TMRM ) (Gibco BRL، VWR، ميسيسوجا، ON، كندا) بتركيز نهائي من 200 نانومتر.
- احتضان الخلايا مع الأصباغ بنسبة 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة محمية من الضوء.
- ماصة 8 ميكرولتر من وسائل الإعلام أو برنامج تلفزيوني على شريحة المجهر وأخذ ساترة من لوحة 6 جيدا ووضعه على رأس وسائل الإعلام أو برنامج تلفزيوني على الشريحة المجهر مع الخلايا إلى أسفل مع ملاقط.
- أخذ الميكروسكوب فلوري، على حد سواء هويشت والميكروسكوب TMRM لكل رأي، مع مجهر IRB مارك ألماني لايكا مضان مقلوب (لايكا مايكروسيستمز، يتزلا، ألمانيا) في التكبير 400X.
8. الميتوكوندريا العزلة
- إعداد حوالي 10 مل من العازلة منخفض التوتر (1 ملم EDTA، 5 مم تريس، حمض الهيدروكلوريك، 210 مم مانيتول، 70 السكروز مم، 10 ميكرومتر ليو-PEP، 10 ميكرومتر بيب-A، و 100 ميكرون PMSF) والعازلة رد فعل والحفاظ على حد سواء الحلول على الجليد.
- مع حوالي 8-10 متكدسة T75 قوارير زراعة الأنسجة من SH-SY5Y الخلايا، ويعرض للتريبسين الخلايا، إضافة إلى تحييد وسائل الإعلام التربسين، وجمع تعليق خلية في أنابيب مخروطية 50 مل، الطرد المركزي وأنابيب في 600 XG لمدة 5 دقائق في 4 درجات C.
- إزالة الكريات خلية طاف وresuspend في حوالي 10 إلى 20 مل من برنامج تلفزيوني الباردة، وأجهزة الطرد المركزي للأنابيب في 600 XG لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتكرار هذه العملية يغسل مرة واحدة.
- إزالة طاف وresuspend الخلايا في العازلة منخفض التوتر الباردة. التجانس الخلايا يدويا مع كوب طاحونة الأنسجة وأجهزة الطرد المركزي في الخلية المحللة في 600 XG لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
9. Amplex الأحمر الفحص
- بعد عزل الميتوكوندريا من الخلايا، وتقدير تركيز البروتين في عينة من الميتوكوندريا المعزولة باستخدام منحنى مستوى تركيز معروف من جيش صرب البوسنة 1mg/mL (الأبقار مصل الزلال) مع فحص بروتين BioRad (بيو راد مختبرات، هرقل، كاليفورنيا الولايات المتحدة الأمريكية) .
- باستخدام تركيز المقدرة من البروتين من حل الميتوكوندريا المعزولة، وحساب حجم هذا الحل لإعطاء 20 ميكروغرام من البروتين. ماصة هذا الحجم في كل بئر من لوحة 96-جيدا مبهمة لتحميل 20 ميكروغرام من البروتين / جيد.
- ملء كل بئر في لوحة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر مع عازلة رد فعل، العلاج من تعاطي المخدرات (مع وجود تركيز النهائي من 1 ميكرومتر JCTH-4، و / أو 10 TAM ميكرون، 250 ميكرون أو PQ (سيغما الدريخ، ميسيسوجا، ON ، Canada) تستخدم كوسيلة لمراقبة إيجابية)، كاشف Amplex الأحمر بتركيز نهائي من 50 ميكرون، وبيروكسيداز الفجل (HRP) (سيغما الدريخ، ميسيسوجا، ON، كندا) في نسبة ميكرولتر U/200 6.
- بعد فترة حضانة 2 ساعة، واتخاذ قراءات مضان في السابق. 560 نيوتن متر وإم. 590 نانومتر على مقياس التألق الطيفي (SpectraMax XPS الجوزاء، الأجهزة الجزيئية، سانيفيل كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية).
10. الخلوية المحللة التحضير
- زراعة الخلايا لالتقاء MCF7 60 الى 70٪ في 10 سم لوحات زراعة الأنسجة.
- علاج الخلايا مع 1 ميكرومتر JCTH-4 و 10 ميكرومتر TAM حده، وبالاشتراك لمدة 72 ساعة مع حوالي 10 إلى 15 لوحات لكل مجموعة العلاج.
- إعداد خلية العازلة تحلل (10 ملم تريس حمض الهيدروكلوريك في درجة الحموضة 7.2، 5 مم بوكل، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم EGTA، 1٪ تريتون-X-100، و 10 ميكرومتر ليو-PEP، 10 ميكرومتر بيب-A، و 100 ميكرومتر PMSF ) ومخزن في 4 درجات مئوية حتى استخدامها.
- طرد ميكانيكيا الخلايا من الأسطح لوحة مع مكشطة الخلية وجمع الخلايا في 50 الموسومةأنابيب مل مخروطي.
- منبذة الأنابيب في 600 XG لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة حبيبات الخلية طاف وresuspend في حوالي 10 إلى 20 مل من برنامج تلفزيوني الباردة، وأنابيب الطرد المركزي في 600 XG لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتكرار هذه العملية غسيل مرة واحدة.
- إزالة طاف وresuspend الخلايا في خلية الباردة العازلة تحلل. التجانس الخلايا يدويا مع كوب طاحونة الأنسجة وأجهزة الطرد المركزي في الخلية المحللة في 600 XG لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تجاهل الكريات وتخزين lysates خلية في -20 درجة مئوية حتى استخدامها.
11. التحليلات الغربية وصمة عار
- تحديد تركيز البروتين في الخلية lysates باستخدام فحص بروتين BioRad (بيو راد مختبرات، هرقل، كاليفورنيا الولايات المتحدة). إخضاع عينات من البروتين لSDS-PAGE والبروتين نقل إلى غشاء النيتروسليلوز.
- بعد نقل، والأغشية كتلة مع ث 5٪ / الخامس TBST الحليب (تريس مخزنة المالحة توين-20) حل لمدة 1 ساعة.
- الأغشية التحقيق مع نملةI-LC3 الأجسام المضادة التي أثيرت في الأرانب (1:500) (نوفوس البيولوجية، القط. رقم NB100-2220، ليتلتون، CO، الولايات المتحدة الأمريكية)، أو الأجسام المضادة لمكافحة β-أكتين التي أثيرت في الماوس (1:1000) (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، وشركة، القطة. رقم SC-81178، باسو روبلز، كاليفورنيا، الولايات المتحدة) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- موضوع الأغشية إلى 15 دقيقة واحد واثنين في الدقيقة 5 يغسل TBST واحتضان مع الماوس المضادة لل(1:2000) أو أرنب المضادة لل(1:2000) بيروكسيداز الفجل، مترافق الأضداد الثانوية (Abcam، القط. رقم وab6728 ab6802، كامبردج، ماساشوستس، الولايات المتحدة) لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
- الأغشية تخضع ليغسل الثلاثة المتتابعة 5 دقائق في TBST ووضع تصور لعصابات بروتين مع كاشف التوهج محسن (سيغما الدريخ، CPS160، ميسيسوجا، ON، كندا).
- أجريت تحاليل قياس كثافة استخدام يماغيج البرمجيات.
12. Monodansylcadaverine (MDC) تلطيخ
- وضع ساترة إلى كل بئر من 6 لوحة أسفل واضح تماما زراعة الأنسجة والخلايا لوحة MCF7 في كل بئر من 6كذلك الأنسجة واضح أسفل لوحة الثقافة في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية. تسمح لهم أن ينمو بمعدل 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2.
- عندما تصل خلايا التقاء 60 الى 70٪، تعاملهم مع 1 ميكرومتر JCTH-4 باستخدام محلول المخزون 1 ملم الذائبة في DMSO و 10 ميكرومتر تام باستخدام الأوراق المالية 10 ملم حل الذائبة في DMSO، على حد سواء وحده، وبالاشتراك في السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية مجلس الوزراء.
- احتضان الخلايا التي تحتوي على العلاجات المذكورة أعلاه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 72 ساعة.
- بعد العلاج، وحضانة للخلايا مع المخدرات، وإضافة مباشرة Monodansylcadaverine (MDC) (سيغما الدريخ، ميسيسوجا، ON، كندا) إلى تركيز النهائي من 0.1 ملم إلى كل بئر لمدة 15 دقيقة.
- احتضان الخلايا مع صبغة في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء.
- ماصة 30 ميكرولتر من وسائل الإعلام أو برنامج تلفزيوني على شريحة المجهر وأخذ ساترة من لوحة 6 جيدا ووضعه على رأس وسائل الإعلام أو برنامج تلفزيوني على الشريحة المجهر مع القوات الجوية الخلايانانوغرام نزولا مع ملاقط.
- أخذ فلوري حركة التغيير الديمقراطي والميكروسكوب المرحلة، لكل رأي، مع IRB مارك ألماني لايكا مقلوب مضان المجهر (لايكا مايكروسيستمز، يتزلا، ألمانيا) في التكبير 400X.
13. ممثل النتائج
انتقائية الحث على موت الخلايا المبرمج في ادينوكارسينوما الثدي الإنسان وخلايا العصبية التي JCTH-4: تعزيز نشاط بواسطة TAM
وقد تبين الحث الانتقائي لموت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية المختلفة عن طريق PST الطبيعية (الشكل 1A) 11-13. بسبب قلة توافر PST، وتوليفها نحن نظائرها من deoxypancratistatin-7 (JCTH-4، الشكل 1B)، ومنهم لفحص النشاط المضاد للسرطان الثدي مماثلة في غدية الإنسان (MCF7) والخلايا العصبية (SH-SY5Y). في المرحلة الأولى من التجارب، وأردنا أن رصد التغيرات المورفولوجية مع مرور الوقت بعد العلاج مع JCTH TAM-4 وحده، وبالاشتراك في خلية MCF7ق. تم رصد MCF7 الخلايا لمدة 18 ساعة، كما رأينا في الفيديو 1 التي تنتجها الوقت الفاصل بين المجهري مع الصور على النقيض مرحلة، مع معالجة المذيبات (السيطرة) لمدة 48 ساعة، وهذه الخلايا تعرض أي تغييرات كبيرة في التشكل. في المقابل، بعد 48 ساعة من 1 علاج JCTH-4 ميكرون، عرضت هذه الخلايا التغيرات المورفولوجية المرتبطة موت الخلايا المبرمج مثل الانكماش، blebbing، تشكيل هيئة أفكارك كما رأينا في الفيديو 2. من ناحية أخرى، تنتج وحدها في علاج تام MCF7 خلايا مورفولوجيا واضح للغاية بما في ذلك ادراج منقط يدل على autophagosomes المرتبطة الالتهام الذاتي (فيديو 3). وقد لوحظ مورفولوجيا أفكارك ضئيلة جدا والخلايا عرضت عموما مورفولوجيا صحية مماثلة للسيطرة مذيب تعامل MCF7 الخلايا. ومن المثير للاهتمام، في حضور تام، وتعززت بشكل كبير في تحريض مبرمج من قبل JCTH-4 كما هو مبين من قبل التشكل أفكارك زيادة في MCF7 خلايا بعد 48 ساعة كما illustratإد في فيديو 4.
في المرحلة الثانية من التجارب استخدمت نحن الأصباغ الفلورية لتقييم استحثاث موت الخلايا المبرمج. بعد 72 ساعة و 48 ساعة من 1 ميكرومتر علاج-4 JCTH في MCF7 والخلايا SH-SY5Y على التوالي، واستخدمت هويشت صبغ ورصد مورفولوجيا النووية. وأشارت النتائج مكثف، نوى الملون بألوان زاهية يرافقه الهيئات أفكارك في MCF7 وSH-SY5Y الخلايا، مما يدل على الاستقراء أفكارك (الشكل 2A، ب). أسفرت عن علاج تام وحدها الحد الأدنى من التشكل النووي أفكارك في MCF7 والخلايا SH-SY5Y؛ النوى كانت كبيرة، جولة، وملطخة بشكل خافت مع هويشت مماثلة لمجموعة مراقبة مذيب (الشكل 2A، ب). في اتفاق مع الفيديو 4، نوى MCF7 والخلايا SH-SY5Y عرض زيادة ملحوظة في التشكل أفكارك مع العلاج الجمع بعد 72 ساعة (الشكل 2A، ب).
للتحقق من الاستقراء أفكارك، وجرى تقييم لخلايا عتخريج hosphatidylserine، على علامة للموت الخلايا المبرمج، عن طريق فحص الخامس Annexin ملزم 17. MCF7 وSH-SY5Y الخلايا المعالجة لمدة 72 ساعة و 48 على التوالي مع 1 ميكرومتر JCTH-4 وحده، وبالاشتراك مع TAM 10 ميكرومتر كانت ايجابية للAnnexin الخامس الملزمة، التي أشار إليها مضان أخضر، مؤكدا على استحثاث موت الخلايا المبرمج (الشكل 3A، ب ). لم يلاحظ أي جهات خارجية واضحة من فسفاتيديل في MCF7 وSH-SY5Y خلايا تعامل مع TAM وحدها، وكذلك في الخلايا NFF تعامل مع جميع المجموعات العلاجات المذكورة آنفا بعد 72 ساعة (الشكل 3C). ولذلك، JCTH-4 وحده، وبالاشتراك مع TAM يستحث موت الخلايا المبرمج بشكل انتقائي في MCF7 والخلايا SH-SY5Y.
لقياس تأثير JCTH-4 وحده، وبالاشتراك مع تام، وهو WST-1 معاملة أجريت الفحص اللونية القائمة على بقاء الخلية، وهو مؤشر على استقلاب الخلية النشطة، في MCF7 وتعامل خلايا NFF لمدة 72 ساعة والخلايا SH-SY5Y لمدة 48 ساعة.بالمقارنة مع مجموعات المراقبة المذيبات، وانخفاض 1 ميكرومتر JCTH-4 استقلاب الخلية النشطة من قبل أكثر من 50٪، في حين أن 10 ميكرومتر وحدها عرضت تام لا يوجد فرق كبير في كل من MCF7 وSH-SY5Y الخلايا (الشكل رقم 4A، ب). ومن المثير للاهتمام في MCF7 والخلايا SH-SY5Y، أدت إضافة إلى JCTH TAM-4 اهانة في انخفاض التآزر في استقلاب الخلية. وكانت الخلايا NFF بشكل كبير أقل حساسية لكلا بمفرده-4 JCTH وJCTH 4-تام مع (الشكل 4C). وبالتالي، JCTH-4 يوضح نشاط تعاوني انتقائي مع تام في MCF7 والخلايا SH-SY5Y.
الميتوكوندريا استهداف JCTH-4
لمعرفة ما اذا JCTH-4 يستهدف الميتوكوندريا للحث على موت الخلايا المبرمج المحتملة غشاء الميتوكوندريا في الخلايا كلها وجيل ريوس في الميتوكوندريا المعزولة تم رصدها. وعولج MCF7 الخلايا لمدة 72 ساعة وملطخة TMRM. انخفضت 1 ميكرومتر JCTH MMP-4، وأشار إلى فقدان مضان أحمر (الشكل 5A). ومع ذلك، مع البالإضافة إلى ذلك (ه) من TAM ميكرومتر 10، لوحظ وجود قدر أكبر من تبديد MMP، في حين أن 10 ميكرومتر تام وحده لم يكن لها تأثير واضح في المشاركة المتناقصة.
كما تم زيادة ارتبطت ريوس جيل إلى permeabilization غشاء الميتوكوندريا وتحريض موت الخلايا المبرمج، المقررة في إنتاج ريوس مع صبغ Amplex الأحمر في الميتوكوندريا المعزولة من SH-SY5Y خلايا تعامل مع 1 ميكرومتر JCTH-4 و 10 ميكرومتر تام، وحده، وبالاشتراك 18 -20. وأعرب عن قراءات مضان وحدات مضان النسبي (RFU). وقد لوحظت زيادة في توليد ريوس مع JCTH-4 وتام وحدها (الشكل 5B). ومن المثير للاهتمام، أسفرت عن معاملة مجموعة أكبر زيادة في الإنتاج ريوس. وقد استخدمت محفز المعروفة الإنتاج ريوس في الميتوكوندريا، PQ، كعنصر تحكم إيجابية.
تحريض الالتهام الذاتي من قبل JCTH-4 و TAM
ارتبط الاستقراء Autophagic إلى إهانة العلاج الكيميائي بواسطة مركبات مختلفة
ومن خلال lipidated الالتهام الذاتي، أنيبيب المرتبطة سلسلة البروتين ضوء 1 3 (LC3) تقع عادة في العصارة الخلوية (LC3-I)، مع فسفاتيديل إيثانولامين ومحلية في وقت لاحق إلى الأغشية autophagosomal (LC3-II) 2. للتحقق من تحريض الالتهام الذاتي، وجرى تقييم مستويات LC3-II في MCF7 الخلايا المعالجة لمدة 72 ساعة عن طريق تحليل لطخة غربية. 1 ميكرومتر JCTH-4 الناجمة قليلا تحويل I-LC3 إلى LC3-II في حين أن 10 TAM ميكرومتر أنتجت أكبر استجابة autophagic (الشكل6B). ومن المثير للاهتمام، أدى الجمع بين العلاج في أكبر تحريض الالتهام الذاتي، مما أسفر عن LC3-II-I LC3 إلى نسبة أكبر من 3. ولذلك، فإن هذه النتائج تظهر الاستقراء autophagic في MCF7 الخلايا JCTH TAM-4 وحده، وبالاشتراك مع أعظم استجابة في الخلايا التي تحتوي على تركيبة العلاج.
تكميلية الفيديو 1. التشكل الخلوي للخلايا MCF7 تعامل مع سيطرة مذيب. تم رصد MCF7 الخلايا بين 48 و 66 ساعة بعد المعالجة سيطرة مذيب (DMSO) باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري مع الصور على النقيض مرحلة. واستمرت الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تم التقاط الصور في التكبير 400X. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو .
تكميلية فيديو 2. الحث من التشكل الخلوي أفكارك في MCF7 خلايا تعامل مع JCTH-4. تم رصد MCF7 الخلايا بين 48 و 66 بعد العلاج الطرافة ساعاتح 1 ميكرومتر JCTH-4 استخدام الوقت الفاصل بين المجهري مع الصور على النقيض مرحلة. واستمرت الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تم التقاط الصور في التكبير 400X. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو .
تكميلية فيديو 3. الحث من التشكل الخلوي autophagic في MCF7 خلايا تعامل مع تام. تم رصد MCF7 الخلايا بين 48 و 66 ساعة بعد العلاج مع TAM 10 ميكرومتر استخدام الوقت الفاصل بين المجهري مع الصور على النقيض مرحلة. واستمرت الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تم التقاط الصور في التكبير 400X. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو .
تكميلية فيديو 4. مورفولوجيا أفكارك المحسن بواسطة JCTH-4 مع تام في MCF7 الخلايا. تم رصد MCF7 الخلايا بين 48 و 66 ساعة بعد العلاج مع كل من ميكرومتر JCTH 1-4 و 10 ميكرومتر تام باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري مع مرحلة تابعصور راست. واستمرت الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تم التقاط الصور في التكبير 400X. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو .
الشكل 1. مقارنة الإنشائية من PST إلى التماثلية 7-ديوكسي الاصطناعية. (أ) التركيب الكيميائي للpancratistatin (PST). (ب) التركيب الكيميائي لل4-JC-TH-خلات (JCTH-4).
الشكل 2. JCTH-4 الحث مورفولوجيا أفكارك النووية مع تعزيز النشاط مع تام. مورفولوجيا النووية من (أ) MCF7 و (ب) الخلايا SH-SY5Y المعالجة لمدة 72 ساعة و 48 على التوالي مع تركيز تام، والمشار إليه من الملون JCTH-4 مع صبغ هويشت. وعولج مجموعات المراقبة مع D (مذيبهيئة علماء المسلمين). أخذت الصور في التكبير 400X في المجهر الفلورسنت. شريط النطاق = 15 ميكرون.
الشكل 3. JCTH-4 أسباب فسفاتيديل تخريج حده، وبالاشتراك مع TAM انتقائي في الخلايا السرطانية. تم تقييم Annexin الخامس ملزمة لفسفاتيديل تخريجها للتحقق من تحريض تحريض موت الخلايا المبرمج في (أ) MCF7 (72 ساعة)، (ب) SH-SY5Y (48 ساعة)، و (ج) خلايا NFF (72 ساعة) تعامل مع JCTH-4 وتام في تركيزات المشار إليه. وعولج مجموعات المراقبة مع مذيب (DMSO). أخذت الصور في التكبير 400X في المجهر الفلورسنت. شريط النطاق = 15 ميكرون.
الشكل 4. TAM يعزز انخفاض الجدوى من قبل JCTH-4 انتقائيا في الخلايا السرطانية. وكانت لوحات 96-جيدا المصنف وايال (أ) MCF7، (ب) SH-SY5Y، و (ج) خلايا NFF وتعامل مع JCTH-4 وتام في تركيزات المشار إليه. وعولج MCF7 والخلايا NFF لمدة 72 ساعة وعولج SH-SY5Y لمدة 48 ساعة. بعد العلاج من تعاطي المخدرات، والحضانة، وأضيف WST-1 الكاشف إلى كل بئر، وأخذت قراءات الامتصاصية في 450 نانومتر، ومعبرا عنها كنسبة مئوية من سيطرة (DMSO). وأجريت إحصاءات باستخدام GraphPad نسخة بريزم 5.0. يتم التعبير عن القيم كما يعني من quadruplicates من 3 تجارب مستقلة SD ±. MCF7: * P <0.001 **، ف <0.0001 مقابل السيطرة؛ # P <0.05 مقابل 1 ميكرومتر JCTH-4؛ † P <0.0001 مقابل 10 ميكرومتر تام. SH-SY5Y: * P <0.0005 مقابل السيطرة؛ # P <0.005 مقابل 1 ميكرومتر JCTH-4؛ † P <TAM ميكرومتر 0،005 مقابل 10. NFF: * ع <TAM ميكرومتر 0،005 مقابل 10 + 1 ميكرومتر JCTH-4 في MCF7 الخلايا؛ # P <0.01 مقابل 10 ميكرومتر TAM + 1 ميكرومتر JCTH-4 في SH-SY5Y الخلايا.
الشكل 5. JCTH-4، وفعل تام على الميتوكوندريا. (أ) كانت تزرع MCF7 الخلايا على coverslips وتعامل مع تركيزات المشار إليه من المخدرات لمدة 72 ساعة وملطخة TMRM لتقييم MMP. تم علاج الخلايا من السيطرة على المجموعة مع مذيب (DMSO). تم التقاط الصور في التكبير 400X على مضان المجهر. شريط النطاق يعاملون = 15 ميكرون. (ب) الميتوكوندريا المعزولة من SH-SY5Y الخلايا مع JCTH-4 وتام في تركيزات المشار إليها وجرى تقييم ريوس الإنتاج مع الركيزة Amplex الأحمر في وجود البيروكسيديز الفجل (HRP). تم علاج خلايا مجموعة التحكم مع مذيب (DMSO). الباراكوات (PQ) كانت تستخدم بتركيز 250 ميكرون كعنصر تحكم إيجابية. وقد تم الحصول على قراءات مضان بعد 2 ساعة من العلاج في السابق. 560 نيوتن متر وإم. 590 نانومتر، ويعبر عنه fluorescenc نسبيوحدات ه (RFU). وقد تم الحصول على إحصائيات استخدام GraphPad نسخة بريزم 5.0. البيانات هو ممثل من 3 تجارب مستقلة مع اتجاهات مماثلة. يتم التعبير عن القيم كما SD ± متوسط quadruplicates من 1 تجربة مستقلة. * P <0.05 **، ف <0.005 ***، P <0.001 مقابل السيطرة؛ # P <0.05 مقابل 1 ميكرومتر JCTH-4؛ † ميكرومتر <0.05 مقابل 10 ف تام؛ @ P <0.05 مقابل 250 ميكرون PQ.
الشكل 6. TAM يعزز الاستقراء autophagic من JCTH-4 (أ) كانت تزرع MCF7 الخلايا على coverslips وتعرض للاهانة JCTH-4 وتام في تركيزات المشار إليها لمدة 72 ساعة. تم علاج خلايا مجموعة التحكم مع مذيب (DMSO). وبعد المعالجة، ملطخة MCF7 الخلايا مع حركة التغيير الديمقراطي للكشف عن الفجوات autophagic. تم التقاط الصور في التكبير 400X على مضان المجهر. شريط النطاق = 15 ميكرون. (ب) وأجريت تحاليل لطخة غربية من اصل لLC3 و β-أكتين في lysates خلية من خلايا MCF7 تعامل مع تركيزات المشار إليه من المخدرات لمدة 72 ساعة. وأعدم التحليلات الكثافة باستخدام يماغيج البرمجيات. وأجريت إحصاءات باستخدام GraphPad نسخة بريزم 5.0. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SD. * P <0.05 **، ف <0.005 ***، ف <0.0005 مقابل السيطرة؛ # P <0.001 مقابل 1 ميكرومتر JCTH-4؛ † P <TAM ميكرومتر 0،001 مقابل 10.
قائمة الاختصارات.
| ER | مستقبلات هرمون الاستروجين |
| أحادي نوويد الفلافين | فلافين وحيد النوكليوتيد |
| JCTH-4 | JC-TH-خلات-4 |
| LC3 | أنيبيب المرتبطة سلسلة البروتين ضوء 1 3 |
| حركة التغيير الديمقراطي | monodansylcadaverine |
| MMP | mitochondrالاتحاد العالمي للتعليم غشاء المحتملة |
| لجنة نهر الميكونج | الجهاز التنفسي سلسلة الميتوكوندريا |
| NFF | طبيعي الليفية الجنينية البشرية |
| PQ | الباراكوات |
| PST | pancratistatin |
| RFU | مضان الوحدات النسبية |
| ROS | أنواع الاكسجين التفاعلية |
| TAM | تاموكسيفين |
| TMRM | tetramethylrhodamine الميثيل استر |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تبين أن توقيت المحيط الهادي ومركبات مشابهة لديها خصائص مضادة للسرطان 11-15،21. وذكرت سابقا نحن PST الطبيعية لزعزعة الاستقرار في الميتوكوندريا في الخلايا السرطانية بشكل انتقائي، والتي يدفع بالتالي موت الخلايا المبرمج من قبل الافراج عن عوامل apoptogenic 12،14. فمن الأرجح أن JCTH-4 الأفعال من خلال الآلية نفسها؛ JCTH-4 الشكل تسبب انهيار MMP في MCF7 الخلايا كما رأينا مع تلطيخ TMRM (الشكل 5A)، وزادت من جيل من ريوس في الميتوكوندريا المعزولة من SH-SY5Y الخلايا ( 5B)، مما يدل على ضعف الميتوكوندريا. وبالتالي، استحثاث موت الخلايا المبرمج من قبل JCTH-4 هو على الارجح من خلال استهداف الميتوكوندريا في الخلايا السرطانية.
العديد من الاختلافات الموجودة بين الخلايا نونكانكيرووس والسرطان التي يمكن أن تستخدم كأساس لالانتقائية السرطان عن طريق JCTH-4. الخلايا السرطانية تعتمد اعتمادا كبيرا على تحلل وبدرجة أقل على الميتوكوندريا لإنتاج الطاقة، ويشار إلى هذه الظاهرة إلىق تأثير اربورغ 22. مثل النشاط الأيضي في الخلايا السرطانية يؤدي الى ارتفاع نسبة الحموضة في العصارة الخلوية. وبالتالي، فإن البيئة الحمضية عصاري خلوي يسهم فرط الاستقطاب سرطان الخلية الميتوكوندريا التي تم ربطها إلى تعزيز القدرة على غزو والتهرب من موت الخلايا المبرمج 23. Hyperpolariztion من الخلايا السرطانية الميتوكوندريا ومع ذلك، قد تجعل الخلايا السرطانية عرضة للJCTH-4، تؤخذ مرة واحدة في الخلية، قد JCTH-4 الحصول على شحنة موجبة من خلال المعالجة الأنزيمية، وربما بشكل انتقائي يتم تناولها في الخلايا السرطانية الميتوكوندريا نظرا لطبيعتها hyperpolarized. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت أن مجموعة من البروتينات المرتبطة بها الميتوكوندريا antiapoptotic أن أعرب للغاية في الخلايا السرطانية التي تحظر الميتوكوندريا permeabilization غشاء والتنفيذ اللاحقة من الخلايا مثل البروتينات antiapoptotic من عائلة-2 بي سي إل من البروتينات 24-26.
في وجود أشكال مختلفة من الإجهاد الخلوية، ويتم تشغيل الالتهام الذاتي كماردا المؤيدة للبقاء على قيد الحياة، مما يتيح لخلايا البقاء على قيد الحياة في ظل ظروف غير مواتية 2. من خلال تحفيز هذا المسار ومع ذلك، يمكن أن يؤدي إلى انهيار واسعة من المكونات الحيوية داخل الخلايا مما أدى إلى وفاة 3 autophagic الخلية. وقد ارتبطت الردود autophagic كلا من البقاء على قيد الحياة المؤيدة والموالية الموت على الإهانة العلاج الكيميائي 3. يمكن أن الخلل الميتوكوندريا بواسطة JCTH-4 مما يؤدي إلى الاكسدة يؤدي الى الاستجابة الافتراضية التلقائي autophagic. في الواقع لم نلاحظ بعض الاستقراء autophagic جنبا إلى جنب مع موت الخلايا المبرمج مع JCTH-4 علاج (الشكل 2A، 3A ب، ب 6A، ب). وعلى الرغم من TAM راسخة باعتبارها خصم ER ER في إيجابي خلايا سرطان الثدي، فقد تبين في الآونة الأخيرة على التفاعل مع ملزم، الميتوكوندريا إلى موقع أحادي نوويد الفلافين من أنا مجمع 10. وعلاوة على ذلك، TAM هو محفز معروفة من الالتهام الذاتي عبر العديد من أنواع الخلايا السرطانية 3. في الواقع، لم TAM يسبب زيادة في توليد ريوس في mitoch معزولةondria (الشكل 5B). ومع ذلك، ثبت مثل هذا التفاعل غير كافية للتسبب انهيار MMP (الشكل 5A)، ولكن كافية لإحداث نموذجي المؤيدة للبقاء استجابة autophagic. وقد لوحظ الاستقراء autophagic واسعة عندما استخدمت JCTH-4 و TAM في تركيبة (الشكل 6A، ب)، الذي كان يرافقه استجابة السامة للخلايا معززة (الشكل رقم 4A، ب)، توحي استجابة الموالية للموت autophagic، ومع ذلك، الخلايا السرطانية يموت في نهاية المطاف من موت الخلايا المبرمج نتيجة permeabilization الميتوكوندريا وapoptogenic الافراج عن عامل. ويمكن أن يعزى للتوعية من هذا القبيل من قبل TAM إلى JCTH-4 اهانة للزيادة في توليد ريوس بواسطة TAM. لأن كلا تام وJCTH 4-قادرة على توليد الاكسدة، قد إنتاج اندماجي من التوتر مع كل من هذه المركبات تؤدي إلى تحريض autophagic واسعة النطاق مما أدى إلى رد فعل autophagic ضارة و / أو permeabilization الميتوكوندريا واسعة النطاق وموت الخلايا المبرمج لاحق. اليتم الجمع بين العلاج لا يؤثر على سلامة الخلايا الليفية نونكانكيرووس (الشكل 4C). وتشير هذه النتائج التي يمكن استخدامها JCTH-4 وحده، وبالاشتراك مع TAM بكفاءة لعلاج سرطان الثدي، والعصبية دون التسبب في آثار سلبية على الخلايا نونكانكيرووس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من جانب فرسان كولومبوس الفصل 9671 (وندسور، أونتاريو)، وفريدريك بانتينغ CIHR وأفضل تشارلز منح الدراسات العليا التي منحت لكندا ما دنيس. شكرا لكم على هودج روبرت وإليزابيث فيدالجو دا سيلفا على المساعدة التي قدموها مع المجهري الوقت الفاصل. شكرا لكم على Facecchia كاتي لتحرير الفيديو المجهري الوقت الفاصل. ونود أيضا أن نشكر Sudipa يونيو تشاترجي وتريمبلي فيليب لاستعراض نقدي لهذه المخطوطة. ويكرس هذا العمل في ذاكرة من Couvillon كيفين الذي خسر معركته ضد مرض السرطان في عام 2010.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC | CRL-2266 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM | Sigma-Aldrich | 51448C | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| MCF7 cell line | ATCC | HTB-22 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R 0883 | |
| Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) | Coriell Institute for Medical Research | AG04431B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30022.01 | |
| Tamoxifen citrate salt | Sigma-Aldrich | T9262 | |
| 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek Corp. | P35G-014-C | |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| H–chst 33342 dye | Molecular Probes, Life Technologies | H3570 | |
| Leica DM IRB inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Annexin V AlexaFluor-488 | Invitrogen | A13201 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| Haemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| WST-1 reagent | Roche Group | 11644807001 | |
| Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter | PerkinElmer, Inc. | 1420-011 | |
| Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) | GIBCO, by Life Technologies | T-668 | |
| Glass tissue grinder | Fisher Scientific | K8885300-0002 | |
| BioRad protein assay | Bio-Rad | 500-0001Bottom of Form | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Horseradish peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8125 | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | 3126666 | |
| Anti-LC3 antibody raised in rabbit | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6728 | |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6802 | |
| Chemiluminescence peroxidase substrate | Sigma-Aldrich | CPS160 | |
| Monodansylcadaverine | Sigma-Aldrich | 30432 |
References
- Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
- Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
- Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
- Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
- Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
- Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
- Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
- McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
- Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6 (2010).
- Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
- Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
- Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
- Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
- Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
- Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
- Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. an, Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
- Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).
