Summary
我们已合成了新型防癌抗癌作为本地pancratistatin活动相媲美的pancratistatin模拟;有趣的是，与他莫昔芬治疗组合的产生在细胞凋亡和自噬的诱导线粒体与非癌成纤维细胞的影响最小的目标大幅提高。因此，与他莫昔芬结合JCTH-4可以提供一个安全的抗癌疗法。
Abstract
乳腺癌是最常见的癌症之一，除在北美的妇女。目前许多抗癌药物，包括电离辐射，通过DNA损伤诱导细胞凋亡。不幸的是，这种治疗方法有非选择性的肿瘤细胞，在正常细胞产生类似的毒性。我们已经报道（PST），通过天然化合物pancratistatin的选择性诱导肿瘤细胞凋亡。最近，一种新的PST模拟，7 deoxypancratistatin（JCTH-4）的C-1乙酰衍生物，从头合成产生，它在多种癌细胞株展品媲美选择性诱导凋亡活性。最近，自噬已被牵连在恶性肿瘤亲生存和死亡机制在化疗反应。三苯氧胺（TAM）总是表现出亲生存在许多癌症细胞自噬的诱导。在这项研究中，JCTH-4单独和谭相结合的疗效，诱导细胞死亡在人类乳腺癌canceR（MCF7细胞）和神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞）进行了评估。谭单独诱导细胞自噬，但单独JCTH-4微不足道的细胞死亡而造成的一些诱导的自噬诱导细胞凋亡的重要。有趣的是，组合的治疗取得了大幅增加在细胞凋亡和自噬的诱导。我们监测的组合使用治疗时间推移显微镜MCF7细胞的形态学变化时间依赖性接受TAM诱导细胞自噬，JCTH-4诱导的细胞凋亡和自噬，并加速细胞死亡。我们已经证明了这些化合物诱导细胞凋亡/自噬在这些癌细胞的线粒体定位。重要的是，这些治疗并不影响非癌的人成纤维细胞的生存。因此，这些结果表明，JCTH-4在与谭相结合，可以作为一个安全和非常强大的抗癌疗法对乳腺癌和神经母细胞瘤细胞。
Protocol
介绍
细胞凋亡，或I型程序性细胞死亡，是一种生理过程，可以运行外在，通过死亡配体结合死亡受体，或本质。细胞凋亡的内在途径是由细胞内的压力，如DNA损伤和线粒体功能障碍，最终导致线粒体，线粒体膜电位的耗散（MMP）的释放凋亡因子从线粒体间隙的通透性，和随后的执行细胞凋亡1。
自噬是一个过程，在其中一个单元休息，降解，回收自身的内组件，同时维持细胞膜的完整性;它是引发蜂窝讲的不同类型，包括氧化应激，缺氧，蛋白质总量，剥夺营养，生长因子剥夺，受损的细胞器2。在初始阶段这个过程中，细胞内物质的自噬，双-membraned的囊泡，这熔合在溶酶体形成autolysosomes的吞没。发布以前通过自噬溶酶体融合，胞质材料是由2溶酶体酶降解。这一途径的广泛激活，产生广泛的降解细胞内的组件，这可能会导致自噬细胞死亡或Ⅱ型程序性细胞死亡3。
一直被认为是细胞死亡的逃税4癌症的标志之一。癌症是由不受控制的细 胞生长和增殖5为特征的疾病。神经母细胞瘤，特别是来自发展中国家神经嵴6交感神经从中枢神经系统的神经细胞。这是发生在年纪较小的儿童最常见的实体肿瘤，占所有儿童癌症的7约9％。虽然已经取得了很大进展，到今天为止，这种疾病仍然是个问题这两个基本的科学家和临床医生。另一方面，乳腺癌是最常见的癌症，其中包括8位女性。三苯氧胺（TAM）已在激素敏感的乳腺癌常用的治疗作为雌激素受体 （ER）拮抗剂9。尽管如此，其他报告提供额外的独立诱导细胞凋亡的机制，由谭证据。谭耀宗议员，尤其是复杂的线粒体呼吸链（MRC），黄素单核苷酸（FMN的）网站10我互动。
PST是一种天然化合物从沙参的Hymenocallis工厂分离。从目前使用的许多化疗药物相比，它已被证明诱导细胞凋亡，在非遗传毒性的方式，在各种癌症细胞类型选择性地通过线粒体定位11-15。然而，临床前和临床工作已阻碍了其可用性，它是目前在其天然来源和许多complic的非常低的金额ations负担其化学合成。我们已合成和筛选的7-deoxypancratistatin的合成类似物，并观察到类似的抗癌活性中的C-1乙酰衍生物，JC - TH-乙酸-4（JCTH-4）16。我们现在手边有一个强有力的抗肿瘤活性的人工合成的PST模拟。其合成已标准化，可以扩大生产足够数量的临床前和临床工作。由于自然的PST和TAM两个目标的线粒体，这将是有趣的调查与谭相结合的综合效应的PST合成类似物对人乳腺癌和神经母细胞瘤细胞。
在此，我们报告在人类神经母细胞瘤的选择性杀伤-4 JCTH（SH-SY5Y细胞）和乳腺腺癌细胞（MCF7中）。 JCTH-4是能够诱导细胞凋亡的线粒体定位细胞株; JCTH-4造成耗散MMP在离体细胞线粒体活性氧（ROS）的增加生产这些癌细胞ondria。此外，自噬诱导MCF7细胞由JCTH-4。有趣的是，除了谭JCTH-4侮辱增强JCTH-4在SH-SY5Y和MCF7细胞的上述作用。通过时间推移相衬显微镜或亮场画面由JCTH-4和谭单独和组合在MCF7细胞的形态学变化进行了监测。人体正常的胎儿成纤维细胞（NFF）展出的敏感度显着下降至JCTH-4，单独和与谭相结合。因此，这些意见建议JCTH-4，单独和与谭，是一种安全，有效预防乳腺癌和神经母细胞瘤的化疗药物。
材料和方法
1。细胞培养
- 成长和文化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞（ATCC，猫。CRL-2266号，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国）Dulbecco的修改老鹰中的F-12火腿辅以2毫米（Sigma-Aldrich公司，密西沙加，ON，加拿大） L - 谷氨酰胺E，10％胎牛血清（FBS）和10毫克/毫升，庆大霉素（Gibco BRL公司，厂商VWR，密西沙加，对加拿大）。保持在37°C和5％CO 2的细胞。
- 成长和文化的MCF7人乳腺癌腺癌细胞（ATCC，猫。HTB的22号，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国的RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich公司的加拿大，密西沙加，ON，加拿大），辅以10％FBS的标准（热）科学，马萨诸塞州沃尔瑟姆）和10毫克/毫升的庆大霉素（Gibco BRL公司，厂商VWR，密西沙加，ON，加拿大）。保持在37°C和5％CO 2的细胞。
- 成长和文化Dulbecco的修改鹰的中等，高血糖（温科学，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国明显正常的人类胎儿成纤维细胞（NFF）细胞线（Coriell研究所医学研究，货号AG04431B，卡姆登，新泽西州，美国） ），辅以15％FBS和10毫克/毫升的庆大霉素（Gibco BRL公司，厂商VWR，密西沙加，ON，加拿大）。保持在37°C和5％CO 2的细胞。
2。药物制剂
- 掂量出他莫昔芬（TAM），柠檬酸盐（Sigma-Aldrich公司，货号T9262，密西沙加，ON，加拿大）和溶解在DMSO准备10毫米原液。储存在-20°C原液，直到使用。所有车辆控制使用含有少于0.5％DMSO这项研究。
- 重复步骤2.1准备溶于二甲基亚砜JC - TH-乙酸-4（JCTH-4）从溴苯生产酶法合成，如先前所述16，一个1毫米的原液。储存在-20°C原液，直到使用。所有车辆控制使用含有少于0.5％DMSO这项研究。
3。时间推移显微镜
- 板约2.0×10 5 MCF7细胞在35毫米的玻璃底培养皿（MatTek公司，猫。号P35G-014-C的，亚什兰，马，美国）在无菌条件下的II级生物安全柜，让他们成长在37°C和5％的CO 2。
- 当细胞达到60％至70％汇合，把他们与1微米使用1毫米JCTH-4原液溶于DMSO和10μM的谭耀宗使用10毫米原液溶于DMSO中，单独和组合在II级生物安全柜中。
- 细胞治疗后48小时内，在加热室的地方细胞在37°C间有5％的CO 2阶段的徕卡DMI6000荧光显微镜（徕卡公司，韦茨拉尔，德国）。
- 利用阿盟AF6000软件，设置400X倍率显微镜相衬或明场显微镜，18小时，每5分钟。
4。核染色
- 板约2.0×10 5的MCF7或SH-SY5Y细胞在每6透明底在II级生物安全柜的组织培养板的好，让他们成长在37°C和5％的CO 2。
- 当细胞达到60％至70％汇合，1微米使用1毫米的股票溶液溶解在DMSO和10μM谭用10毫米的股票溶解在DMSO JCTH-4，两个治疗独自在II级生物安全柜的组合。
- 与上述处理的细胞在37℃，5％CO2，48小时（SH-SY5Y细胞）或72小时（MCF7细胞）2。
- 药物治疗和细胞培养后，直接加入Hoechst 33342荧光染料（分子探针，尤金，或美国）媒体处理后的细胞终浓度为10μm的染色细胞核。
- Hoechst染料为5至10分钟，避光孵育细胞。
- 将盘阶段的Leica DM IRB计算倒置荧光显微镜（徕卡公司，韦茨拉尔，德国）。
- 以荧光灯和相位在400倍放大倍率的显微镜。
5。 Annexin V的结合分析
- 板约5.0×10 5 MCF7中，SH-SY5Y细胞，或NFF的细胞在10毫升组织培养板在II级生物安全柜，并允许他们成长在37°C和5％的CO 2。
- W母鸡细胞达到60％至70％汇合，治疗1微米使用1毫米的股票溶液溶解在DMSO和10μM的谭耀宗使用10毫米原液溶于DMSO中，单独和组合，在II级生物安全JCTH-4内阁。
- 与上述处理的细胞在37°C和5％CO 2 48小时（SH-SY5Y细胞）或72小时（MCF7和NFF的细胞）。
- 准备在DDH 2 Annexin V的结合缓冲液，用10毫米肝素钠，氢氧化钠10毫米，140毫米氯化钠， 氯化钙 1毫米，在pH 7.6和商店在4°C间，直到使用。
- 细胞的药物治疗和孵化后，从含有悬浮细胞板块的媒体和妥善处理标记为每个不同的治疗组放入一个单独的15 mL锥形管。
- 从板使用胰蛋白酶分离的贴壁细胞。
- 从板块解除胰蛋白酶的结果细胞后，吸放置在15毫升锥形媒体在步骤5.4人管，放置在其原板回用胰蛋白酶悬浮细胞。
- 随着电子移液器填料和血清移液器，媒体和胰细胞溶液混合，这种混合物放入相应的15 mL锥形管。
- 在600 XG细胞离心5分钟，在4°C间，从每管上清液，在PBS重悬细胞。
- 离心5分钟，在600 XG的细胞，去除上清，每管约50至70μLAnnexin V的结合缓冲液重悬细胞标记的离心管中。
- Annexin V的AlexaFluor-488（1:50）（Sigma-Aldrich公司，密西沙加，ON，加拿大）和Hoechst染料加入终浓度为10μm和15分钟避光孵育。
- 以下孵化，涡旋的离心管，7日至10μL的细胞混合物添加到显微镜玻片，放置在细胞混合物microscop盖玻片上层建筑é幻灯片，并利用荧光显微镜，Annexin V和赫斯特图像的每一个观点，在倒置荧光显微镜的Leica DM IRB计算400X放大倍率（徕卡公司，韦茨拉尔，德国）。其余的离心管，每年为每个实验样品重复。
6。水溶性四唑盐（WST-1）法测定细胞活力
- Trypsinize 1合流的T75瓶或10厘米的组织培养皿中对MCF7，SH-SY5Y细胞，或在II级生物安全柜NFF的细胞。
- 细胞已被解除后，加5至10毫升媒体的胰蛋白酶和将在15 mL锥形管媒体的细胞悬液。
- 离心5分钟，在600 XG细胞，管放入生物安全柜，取出上清液，每管和媒体取决于细胞颗粒大小约1至3毫升悬浮细胞。
- 地方10μL细胞悬液在离心管，加入10μL台盼蓝染料（SIGMA-Aldrich公司，米西索加，加拿大），并与微管组合。
- 载入10μL台盼蓝暂停血球细胞（豪塞尔科学，美国），计数细胞，并计算在原有的15 mL锥形管细胞悬液的细胞浓度。
- 使用此浓度，以确定需要创建稀释细胞悬液浓度为1.5×10 5细胞/毫升MCF7和SH-SY5Y细胞和5.0×10 4 NFF的细胞需要电镀的原始细胞悬浮量。
- 使用稀释细胞悬液板15×10 3的MCF7或SH-SY5Y细胞/孔或5.0×10 3 NFF的细胞/孔加入100微升的稀释细胞悬液，每96清澈见底组织培养板以及。在37°C和5％CO 2过夜孵育细胞。
- 1的μMJCTH-4和10μM谭单独和在II级生物安全柜的组合为72小时的细胞治疗MCF7和NFF的细胞和SH-SY5Y细胞48小时。
- 药物治疗和潜伏期后，添加10μL的CCK-1试剂（罗氏应用科学部，印第安纳州，美国），每孔培养板为4个小时，在37°C和5％CO 2。
- 1 Wallac维克多3 1420多标记计数器（珀金埃尔默，伍德布里奇，ON，加拿大）在450 nm处的吸光度读数，并表达他们作为溶剂对照组的百分比。
7。四甲甲酯（TMRM）染色
- 盖玻片放入每6透明底组织培养板和板MCF7细胞在每6孔组织培养板在II级生物安全柜以及良好。允许他们增长在37°C和5％CO 2。
- 当细胞达到60％至70％汇合，把他们与1微米使用溶解在DMSO原液1毫米和10μM谭耀宗使用10毫米股票溶液溶解在DMSO JCTH-4，两个单独在II级生物安全柜的组合。
- 与上述处理的细胞在37°C和5％CO 2的 72小时。
- 药物治疗和细胞培养后，直接加入Hoechst 33342荧光染料（分子探针，尤金，或美国）媒体处理后的细胞终浓度为10μm，染色，细胞核以及四甲甲酯（TMRM ）（Gibco BRL公司，厂商VWR，密西沙加，对加拿大）在终浓度为200 nm。
- 在5％CO 2和37°C间为45分钟，避光孵育与染料的细胞。
- 吸管8μL到显微镜玻片媒体或PBS，并采取从盖玻片的6孔板上面临向下用镊子细胞的显微镜幻灯片放置在顶部的媒体或PBS。
- 以徕卡DM IRB计算倒置荧光显微镜荧光显微镜，赫斯特，并为每个视图TMRM显微（徕卡显微系统，韦茨拉尔，德国）在400倍放大倍率。
8。线粒体的分离
- 准备约10毫升的低渗缓冲（甘露醇210毫米，5毫米的Tris-HCl，1 mM的EDTA，蔗糖70毫米，10μM的亮氨酸-PEP，PEP-10μM的，和100μMPMSF）和反应缓冲液，并保持这两种解决方案在冰上。
- 与融合的T75约8至10 SH-SY5Y细胞组织培养瓶中，trypsinize细胞，添加媒体中的胰蛋白酶，在50 mL锥形管收集细胞悬液，离心管，5分钟600 XG 4° C。
- 除去约10至20毫升冷PBS上清，重悬细胞沉淀，离心管600 XG 5分钟，在4°C，并重复此一次洗涤过程。
- 去除上清，悬浮细胞，在寒冷的低渗缓冲。均质细胞手动玻璃组织磨床和细胞裂解离心5分钟，在600 XG在4°C。
9。 amplex红检测
- 隔离从细胞线粒体后，估计样品分离线粒体蛋白的浓度，用已知浓度为1mg/ml牛血清白蛋白与BioRad公司的蛋白质检测（Bio-Rad公司实验室，美国大力士，CA）（牛血清白蛋白）的标准曲线。
- 使用浓度蛋白质分离线粒体解的估计，这一解决方案，让20微克蛋白量计算。吸取到每一个不透明的96孔板加载20微克/蛋白质以及音量。
- 中板填补每口井到100μL反应缓冲液，药物治疗（终浓度为1 mM-4 JCTH，和/或10μM谭耀宗，或250微米PQ（Sigma-Aldrich公司，密西沙加，就可以与总量，C穴田）作为阳性对照），在终浓度为50μMAmplex红试剂，辣根过氧化物酶（HRP）（Sigma-Aldrich公司，密西沙加，ON，加拿大）比6 U/200微升。
- 经过2个小时的潜伏期，在EX荧光读数。 560 nm和EM。 590纳米上的荧光光谱仪（SpectraMax双子座的XPS，分子器件，桑尼维尔，加利福尼亚，美国）。
10。细胞裂解液的制备
- MCF7细胞生长到60％至70％，在10厘米的组织培养板的汇合处。
- 治疗1μM的JCTH-4和10μM谭单独和结合治疗组板约10至15％在72小时的细胞。
- 准备细胞裂解液（10毫米，在pH 7.2的Tris盐酸，氯化钾5毫米，1毫米氯化镁 ，1％TRITON-X-100的1毫米EGTA 10μM亮氨酸-PEP，PEP-10 M和100μMPMSF ），并储存于4°，直到使用C。
- 机械逐出用细胞刮刀板表面的细胞，并收集细胞标记50mL锥形管。
- 在4°C 5分钟离心管600 XG，除去约10至20毫升冷PBS，离心管600 XG上清，重悬细胞沉淀5分钟，在4°C，并重复这一清洗过程一次。
- 去除上清，在寒冷的细胞裂解液重悬细胞。均质细胞手动玻璃组织磨床和细胞裂解离心5分钟，在600 XG在4°C。
- 丢弃的颗粒和细胞裂解物储存在-20°C，直到使用。
11。免疫印迹分析
- 确定使用BioRad公司的蛋白质检测（Bio-Rad公司实验室，美国大力士，CA）的细胞裂解蛋白的浓度。受到SDS-PAGE和蛋白转移到硝酸纤维素膜蛋白样品。
- 转移后，与5％W / V奶粉TBST（Tris缓冲生理盐水吐温-20）1小时解块膜。
- 与蚂蚁探讨膜鼠标（1:1000）（圣克鲁斯提出兔提出I-LC3的抗体（1:500）（Novus公司生物制品，货号，利特尔顿，一氧化碳，美国NB100-2220），或抗β-肌动蛋白抗体生物技术公司，货号SC-81178，帕索罗布尔斯，美国加利福尼亚州）一夜之间在4°C
- 15分钟和TBST孵育两个5分钟清洗与反鼠标（1:2000）或抗兔（1:2000）辣根过氧化物酶标记的第二抗体（Abcam，货号ab6728及主题膜ab6802，剑桥，麻省，美国）1小时，在4°C。
- 连续三个5分钟的TBST清洗和可视化，增强化学发光试剂（Sigma-Aldrich公司，CPS160，米西索加ON时，加拿大）的蛋白条带的主题膜。
- 进行密度分析使用ImageJ的软件。
12。 monodansylcadaverine（MDC）染色
- 6以及在每个盖玻片放入每6透明底组织培养板和板以及MCF7细胞清澈见底的组织培养板在II级生物安全柜。允许他们增长在37°C和5％CO 2。
- 当细胞达到60％至70％汇合，把他们与1微米使用溶解在DMSO原液1毫米和10μM谭耀宗在II级生物安全使用10毫米原液溶于DMSO中，单独和组合JCTH-4内阁。
- 与上述处理的细胞在37°C和5％CO 2的 72小时。
- 细胞与药物治疗后孵化，直接添加Monodansylcadaverine的（MDC），（Sigma-Aldrich公司，密西沙加，ON，加拿大），终浓度为15分钟，每口井的0.1毫米。
- 在5％CO 2和37°C间为15分钟避光孵育与染料的细胞。
- 吸取30μL到显微镜玻片媒体或PBS和盖玻片的6孔板上与细胞FACI显微镜幻灯片放置在顶部的媒体或PBS与镊子吴向下。
- 荧光MDC和显微阶段，每个观点，与400X倍率的Leica DM IRB计算倒在荧光显微镜（徕卡公司，韦茨拉尔，德国）。
13。代表结果
选择性诱导细胞凋亡在人类乳癌细胞和神经母细胞瘤由JCTH-4：由谭活性增强
结果表明，在各种癌症细胞选择性诱导凋亡，自然PST（ 图1a）11-13。因为PST的低可用性，我们已合成类似物7 deoxypancratistatin（JCTH-4， 图1b）和类似的防癌在人类乳癌细胞（MCF7细胞）和神经母细胞瘤（SH-SY5Y细胞）的活性筛选。在实验的第一阶段，我们希望随着时间的推移监察形态学变化治疗JCTH-4和TAM在MCF7细胞结合第MCF7细胞，18小时监控，在时间推移显微镜相衬图片制作视频1，溶剂处理48小时（对照组），这些细胞在形态上没有发生重大变化。相比之下，1微米JCTH-4治疗48小时后，这些细胞表现出与如收缩凋亡的形态学变化，出泡，凋亡小体形成视频2。另一方面，谭治疗，仅在MCF7细胞产生非常明显的形态包括与自噬相关的自噬（ 视频3）指示的点状夹杂物。很小的凋亡形态学观察和细胞普遍表现出健康的形态与溶剂对照处理MCF7细胞。有趣的是，在谭存在，凋亡诱导由JCTH-4大幅提升增加MCF7细胞凋亡形态后表示作为illustrat 48小时视频署在4。
在实验的第二阶段，我们利用荧光染料评估诱导凋亡。 1μM的JCTH-4在MCF7和SH-SY5Y细胞分别处理72小时和48小时后，用Hoechst染料和监测核形态。结果表明：简明，明亮的彩色核伴随着凋亡小体在MCF7和SH-SY5Y细胞，诱导细胞凋亡的指标（ 图2A，B）。谭单独治疗取得最小MCF7和SH-SY5Y细胞凋亡核形态;细胞核用Hoechst与溶剂对照组（ 图2A，B）大而圆，染色昏暗。协议显示在视频4，原子核对MCF7和SH-SY5Y细胞在凋亡形态结合治疗后72小时（ 图2A，B）的显着增加。
以验证诱导细胞凋亡，细胞对p进行评估hosphatidylserine的外，对细胞凋亡的标记，通过Annexin V的结合实验17。 MCF7和SH-SY5Y细胞处理1μM单独JCTH-4，并在10μM的谭结合Annexin V的结合呈阳性反应，表明绿色荧光，证实了诱导细胞凋亡（ 图3A，B分别为72和48小时）。在MCF7观察没有明显的外磷脂和SH-SY5Y细胞治疗与谭孤独，以及在上述所有的治疗组，72小时后（ 图3c）NFF的细胞治疗。因此，JCTH-4单独和组合与谭选择性诱导MCF7和SH-SY5Y细胞凋亡。
量化单独JCTH-4的影响，谭相结合，CCK-1基于比色法测定细胞活力，活跃细胞的新陈代谢指标，进行72小时和SH-SY5Y细胞MCF7和NFF的细胞治疗治疗48小时。1μM的JCTH-4与溶剂对照组相比，下降50％以上，活跃细胞的新陈代谢，而10μM的谭单独展出MCF7和SH-SY5Y细胞（ 图4A，B）没有显着性差异。有趣的是，在MCF7和SH-SY5Y细胞中，除了谭JCTH-4侮辱导致在细胞代谢中的协同减少。 NFF的细胞大幅减少敏感都JCTH-4单独和JCTH-4谭耀宗（ 图4c）。因此，JCTH-4演示谭耀宗在MCF7和SH-SY5Y细胞选择性增效活动。
线粒体定位JCTH-4
要看到，如果JCTH-4瞄准的是在整个细胞，并在分离线粒体ROS生成诱导细胞凋亡的线粒体膜电位线粒体进行了监测。 MCF7细胞，72小时内处理与TMRM染色。 1μM的JCTH-4降低基质金属蛋白酶，显示红色荧光（ 图5A）的损失。然而，与日北京时间10微米谭此外，更大的MMP耗散观察，而仅10μM的谭没有明显的影响，对MMP。
作为增加ROS的产生已经关联到线粒体膜通透性和诱导凋亡，活性氧的生产评估Amplex红色染料从1μMJCTH-4和10μM的谭耀宗，单独处理SH-SY5Y细胞分离线粒体和组合18 -20。荧光读数为相对荧光单位（RFU）的表达。 ROS生成增加，观察与JCTH-4和TAM（ 图5b）。有趣的是，综合治疗，取得了在ROS产生更大的提高。一个知名的诱导ROS的产生，在线粒体中，PQ，利用作为阳性对照。
自噬由JCTH诱导-4和谭
由许多不同的化合物，已自噬诱导化疗侮辱关联
在自体吞噬，微管相关蛋白1轻链3（LC3的）通常坐落在细胞质（LC3-I），磷脂，脂化与随后本地化的autophagosomal膜（LC3-II）2。 MCF7细胞在72小时通过免疫印迹分析处理，以验证诱导自噬，LC3-Ⅱ水平进行了评估。 1μM的JCTH-4稍微诱导LC3的我LC3-II的转换，而10μM的谭产生更大的自噬反应（ 图6B）。有趣的是，联合治疗导致最大的自噬的诱导，产生了LC3-II LC3的我比大于3。因此，这些结果表明JCTH-4和TAM单独和组合自噬诱导MCF7细胞，与细胞结合治疗的最大响应。
补充视频1。MCF7细胞治疗与溶剂对照组的细胞形态。 MCF7细胞被监测的48至66小时后溶剂对照（DMSO）的使用时间推移显微镜相衬图片。细胞维持在37℃，5％CO 2。图像被抓获400X的放大倍率。 点击这里观看视频 。
参考影片2。MCF7细胞治疗与JCTH-4细胞凋亡形态的感应。 48至66小时后治疗机智MCF7细胞进行了监测H 1μM的JCTH-4使用时间推移显微镜相衬图片。细胞维持在37℃，5％CO 2。图像被抓获400X的放大倍率。 点击这里观看视频 。
补充视频3。用TAM治疗MCF7细胞自噬细胞形态的感应。介于48和66小时与10μM的使用时间推移显微镜相衬图片谭治疗后MCF7细胞进行了监测。细胞维持在37℃，5％CO 2。图像被抓获400X的放大倍率。 点击这里观看视频 。
补充视频4。谭MCF7细胞的形态与增强由JCTH-4细胞凋亡。 MCF7细胞被监测的48至66小时治疗后，都为1微米JCTH-4和10μM的谭相续使用时间推移显微镜RAST图片。细胞维持在37℃，5％CO 2。图像被抓获400X的放大倍率。 点击这里观看视频 。
图1。结构比较PST一种人工合成的7 -脱氧模拟。（）pancratistatin的化学结构（PST）。（二）JC - TH-乙酸-4（JCTH-4）的化学结构。
图2。JCTH-4诱导核与谭增强活动的凋亡形态。 （一）核形态MCF7和（二）SH-SY5Y细胞与谭指示的浓度，并用Hoechst染料JCTH-4染色分别为72和48小时内处理。对照组，治疗与溶剂（DMSO）的。在荧光显微镜放大400X图像。比例尺= 15微米。
图3。磷脂的外单独和组合与谭选择性地在肿瘤细胞中JCTH-4的原因。 Annexin V的结合外向磷脂进行了评估，以核实（一）MCF7中（72小时），（二）处理的SH-SY5Y（48小时），（三）NFF的细胞（72小时）与JCTH-4诱导细胞凋亡的诱导谭耀宗在指定的浓度。对照组分别用溶剂（二甲基亚砜）。在荧光显微镜放大400X图像。比例尺= 15微米。
图4。谭JCTH-4在癌细胞的选择性增强细胞活力下降。 96孔板种子无线第（一 ）MCF7中的SH-SY5Y（二），（三）NFF的细胞，并与JCTH-4和在指定的浓度谭治疗。 MCF7和NFF的细胞治疗为72小时和48小时内处理的SH-SY5Y。发布的戒毒治疗和孵化，WST-1试剂加入到每口井，并在450 nm处的吸光度读数，并表示作为控制的百分比（DMSO）。使用GraphPad棱镜版本5.0进行统计。值表示为平均值±SD由3个独立的实验一式四份。 MCF7中：* P <0.001，** P <0.0001与对照组相比，＃P <0.05比1μMJCTH-4;†P <0.0001与10μM谭。 SH-SY5Y细胞：* P <0.0005与对照组相比，＃P <0.005比1μMJCTH-4;†P <0.005与10μM谭。 NFF的：* P <0.005与10μM的谭+ 1微米的MCF7细胞JCTH-4;＃P <0.01与10μM的谭+ 1μM的JCTH在SH-SY5Y细胞4。
图5。JCTH-4和谭线粒体的行为。（一）MCF7细胞生长盖玻片上，并指定浓度的药物治疗，72小时与TMRM染色评估的MMP。对照组细胞经溶剂（二甲基亚砜）。在荧光显微镜放大400X图像被抓获。比例尺= 15微米。（二）隔离SH-SY5Y细胞线粒体治疗JCTH-4和TAM在指定的浓度和活性氧的产生与辣根过氧化物酶（HRP）的存在Amplex红色衬底的评估。对照组细胞经溶剂（二甲基亚砜）。百草枯（PQ）的使用浓度为250μM作为阳性对照。治疗的前2小时后，获得的荧光读数。 560 nm和EM。 590 nm和表示相对fluorescencE单位（RFU）的。统计获得使用GraphPad棱镜版本5.0。数据是代表3个类似的趋势独立实验。值表示为平均值±1个独立的实验一式四份SD。 * P <0.05，** P <0.005，*** P <0.001与对照组相比，＃P <0.05比1μMJCTH-4;†P <0.05与10μM谭耀宗; @ P <0.05与250微米PQ的。
图6。谭增强自噬诱导JCTH-4。（一）MCF7细胞生长盖玻片上，并受到侮辱JCTH-4和TAM在72小时指示的浓度。对照组细胞经溶剂（二甲基亚砜）。治疗后，MCF7细胞与MDC染色检测自噬泡。在荧光显微镜放大400X图像被抓获。比例尺= 15微米。（B）Western blot分析进行LC3和β-肌动蛋白上指示的72小时药物浓度处理MCF7细胞的细胞裂解物。光密度分析，使用ImageJ的软件执行。使用GraphPad棱镜版本5.0进行统计。值表示为平均值±SD。 * P <0.05，** P <0.005，*** P <0.0005与控制;＃P <0.001比1μMJCTH-4;†P <0.001与10μM谭。
缩略语。
| 雌激素受体 | 雌激素受体 |
| FMN的 | 黄素单核苷酸 |
| JCTH-4 | JC - TH-乙酸-4 |
| LC3的 | 微管相关蛋白1轻链3 |
| 民运 | monodansylcadaverine |
| 基质金属蛋白酶 | mitochondrIAL膜电位 |
| 湄公河委员会 | 线粒体呼吸链 |
| NFF的 | 人体正常的胎儿成纤维细胞 |
| PQ的 | 百草枯 |
| 太平洋标准时间 | pancratistatin |
| 俄罗斯足协 | 相对荧光单位 |
| 活性氧 | 活性氧 |
| 谭耀宗 | 他莫昔芬 |
| TMRM | 四甲甲基酯 |
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Discussion
PST和类似的化合物已被证实具有抗癌特性11-15,21。我们以前曾报道自然的PST线粒体选择性破坏肿瘤细胞，从而诱导细胞凋亡12,14凋亡因子的释放。这是最有可能的，JCTH-4的行为，通过相同的机制;造成JCTH-4 TMRM染色（ 图5a），并增加从SH-SY5Y细胞中分离出线粒体ROS生成在MCF7细胞基质金属蛋白酶的崩溃（ 图5B），线粒体功能障碍的指标。因此，诱导细胞凋亡由JCTH-4是最有可能通过在肿瘤细胞中的线粒体定位。
服务由JCTH-4可作为癌症选择性的基础上的非癌和癌细胞之间存在许多差异。癌细胞是高度依赖于糖酵解和线粒体减少能源生产;这种现象被称为一个的Warburg效应22。这种癌细胞的代谢活动，导致细胞质中的高酸度。因此，细胞内酸性环境有利于癌细胞线粒体超极化，已与能力增强，入侵和逃避凋亡23。癌细胞线粒体hyperpolariztion然而，可能会导致癌细胞到JCTH 4脆弱，一旦进入细胞，JCTH-4有可能获得一个正电荷，通过酶处理，并可能选择性地考虑到癌细胞线粒体由于其极化性质。此外，已被证明要高度表达在肿瘤细胞中，禁止线粒体膜通透性和随后的执行，如抗凋亡蛋白BCL-2家族蛋白24-26凋亡线粒体抗凋亡相关蛋白质阵列。
在存在各种形式的细胞应激，细胞自噬被触发有利于生存的反应，使细胞的不利条件下存活2。然而，超过这一途径的刺激可导致广泛的细分内重要组件，从而产生自噬细胞死亡3。亲生存和亲死亡自噬反应相关的化疗侮辱3。导致氧化应激JCTH-4的线粒体功能障碍可能会引发自动默认的自噬反应。事实上，我们做了一些自噬诱导JCTH-4治疗（ 图2A，B 3A，B 6A，B）与细胞凋亡的观察。虽然谭以及建立在ER阳性乳腺癌细胞的雌激素受体 拮抗剂，它最近与线粒体的结合复我10 FMN的网站互动。此外，TAM是一个著名的自噬诱导在许多癌症细胞类型3。事实上，谭导致孤立的细胞线粒体ROS生成增加ondria（ 图5b）。然而，这种相互作用被证明是不足以引起基质金属蛋白酶的崩溃（ 图5a），但足以引起一个典型的亲生存的自噬反应。广泛的自噬诱导当JCTH-4和TAM结合使用（ 图6A，B），这是伴随着增强细胞毒性反应（ 图4A，B），暗示亲死亡自噬反应，然而，癌细胞最终死于细胞凋亡作为线粒体通透性和apoptogenic的因子释放的结果。由谭到JCTH 4侮辱等可以归因于增加ROS的产生，由谭敏。因为既谭耀宗和JCTH-4能够产生氧化应激，两种化合物的组合生产的这种压力可能会导致广泛的自噬诱导产生了不利的自噬反应和/或广泛的线粒体通透性和随后的细胞凋亡。日相结合的治疗不会影响非癌成纤维细胞（ 图4c）的可行性。这些结果表明，JCTH-4单独和谭相结合，可以有效地用于治疗乳腺癌和非癌变细胞，而不会造成不利影响神经母细胞瘤。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作已经得到了哥伦布章9671（安大略省温莎市），以及CIHR弗雷德里克班廷和查尔斯·加拿大研究生奖学金颁发给丹尼斯·马骑士。感谢他们的协助，你罗伯特·霍奇和伊丽莎白菲达尔戈达席尔瓦随着时间推移显微镜。谢谢凯蒂Facecchia时间推移显微镜视频编辑。我们也想感谢这个手稿的严格审查Sudipa六月查特吉和Phillip特伦布莱。这项工作是致力于记忆凯文Couvillon谁失去了对抗癌症的斗争，他在2010年。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC | CRL-2266 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM | Sigma-Aldrich | 51448C | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| MCF7 cell line | ATCC | HTB-22 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R 0883 | |
| Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) | Coriell Institute for Medical Research | AG04431B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30022.01 | |
| Tamoxifen citrate salt | Sigma-Aldrich | T9262 | |
| 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek Corp. | P35G-014-C | |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| H–chst 33342 dye | Molecular Probes, Life Technologies | H3570 | |
| Leica DM IRB inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Annexin V AlexaFluor-488 | Invitrogen | A13201 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| Haemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| WST-1 reagent | Roche Group | 11644807001 | |
| Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter | PerkinElmer, Inc. | 1420-011 | |
| Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) | GIBCO, by Life Technologies | T-668 | |
| Glass tissue grinder | Fisher Scientific | K8885300-0002 | |
| BioRad protein assay | Bio-Rad | 500-0001Bottom of Form | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Horseradish peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8125 | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | 3126666 | |
| Anti-LC3 antibody raised in rabbit | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6728 | |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6802 | |
| Chemiluminescence peroxidase substrate | Sigma-Aldrich | CPS160 | |
| Monodansylcadaverine | Sigma-Aldrich | 30432 |
References
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