Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Verbetering van de apoptotische en autofagocytische Inductie door een nieuwe synthetische C-1-analoog van 7-deoxypancratistatin in de moedermelk Darmkanker en Neuroblastoom Cellen met Tamoxifen

doi: 10.3791/3586 Published: May 30, 2012

Summary

We hebben gesynthetiseerd een nieuwe analoog van pancratistatin met vergelijkbare anti-kanker activiteit als native pancratistatin, interessant, combinatorische behandeling met tamoxifen leverde een drastische verbetering in de apoptotische en autofagocytische inductie door mitochondriale richten met minimale effecten op goedaardige fibroblasten. Zo kon JCTH-4 in combinatie met tamoxifen zorgen voor een veilige anti-kanker therapie.

Abstract

Borstkanker is een van de meest voorkomende vormen van kanker onder vrouwen in Noord-Amerika. Vele huidige antikankerbehandelingen, zoals ioniserende straling, apoptose via DNA-schade. Helaas is een dergelijke behandeling niet-selectief voor kankercellen en produceren soortgelijke toxiciteit in normale cellen. Wij hebben gemeld selectieve inductie van apoptose in kankercellen door de natuurlijke verbinding pancratistatin (PST). Onlangs is een nieuwe PST analoog een C-1 acetoxymethyl derivaat van 7 deoxypancratistatin (JCTH-4), die door de novo synthese en vertoont vergelijkbare selectieve apoptose inducerende activiteit in verscheidene cellijnen. Onlangs heeft autofagie betrokken bij maligniteiten als zowel pro-overleving en pro-dood mechanismen in reactie op chemotherapie. Tamoxifen (TAM) heeft altijd aangetoond inductie van pro-survival autofagie in tal van vormen van kanker. In deze studie werd de effectiviteit van JCTH-4 alleen en in combinatie met TAM om celdood te induceren in de moedermelk Cancer (MCF7) en neuroblastoom (SH-SY5Y) cellen werd geëvalueerd. TAM alleen autofagie veroorzaakt, maar onbeduidend celdood terwijl JCTH-4 alleen al veroorzaakt significante inductie van apoptose met een aantal inductie van autofagie. Interessant is dat de combinatorische behandeling leverde een drastische toename van apoptotische en autofagocytische inductie. We tijdsafhankelijke morfologische veranderingen in MCF7 cellen die door TAM-geïnduceerde autofagie, JCTH-4-geïnduceerde apoptose en autofagie, en versnelde celdood bewaakt met behulp van combinatorische behandeling met behulp van time-lapse microscopie. We hebben aangetoond dat deze verbindingen apoptose / autofagie induceren door mitochondriale targeting in deze kankercellen. Belangrijker is dat deze behandelingen geen invloed op de overleving van goedaardige menselijke fibroblasten. Zo geven deze resultaten aan dat JCTH-4 in combinatie met TAM kunnen worden gebruikt als een veilig en zeer krachtige anti kanker therapie tegen borstkanker en neuroblastoomcellen.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Introductie

Apoptosis, of typ ik geprogrammeerde celdood, is een fysiologisch proces dat extrinsiek kunnen werken, via binding van een ligand de dood van een death receptor, of intrinsiek. De intrinsieke route van apoptose is een initiatief van intracellulaire stress, zoals DNA-schade en mitochondriale dysfunctie, dit uiteindelijk leidt tot de permeabilisatie van de mitochondriën, dissipatie van de mitochondriale membraanpotentiaal (MMP), vrijlating van apoptotische factoren uit de mitochondriale intermembrane ruimte, en de daarop volgende uitvoering van apoptose 1.

Autofagie is een proces waarbij een cel breekt, degradeert, en recycleert zijn eigen intracellulaire componenten met behoud van plasma membraan integriteit, het wordt veroorzaakt door verschillende types van cellulaire stress waaronder oxidatieve stress, hypoxie, eiwit aggregaten, nutriënten ontbering, groeifactor ontbering, en beschadigde organellen 2. In de beginfasevan dit proces, wordt cytosolische materiaal overspoeld door autofagosomen, dubbel-membraned blaasjes, die samensmelten tot lysosomen te autolysosomes te vormen. Bericht lysosomale fusion, cytosolische materialen die eerder in beslag genomen door autofagosomen worden afgebroken door lysosomale enzymen 2. Uitgebreide activering van deze route levert aanzienlijke verslechtering van intracellulaire componenten die kunnen leiden tot autofagocytische celdood of type II geprogrammeerde celdood 3.

Evasion van celdood is beschouwd als een van de kenmerken van kanker 4. Kanker is een ziekte die gekenmerkt wordt door ongecontroleerde celgroei en proliferatie 5. In het bijzonder, neuroblastoom komt voort uit de ontwikkeling van zenuwcellen van het sympathische zenuwstelsel van de neurale lijst 6. Het is de meest voorkomende vaste tumor voorkomen bij jonge kinderen, goed voor ongeveer 9% van alle kanker bij kinderen 7. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt tot op heden deze ziekte blijft een probleemaan zowel fundamentele wetenschappers en clinici. Anderzijds, borstkanker de meest voorkomende kanker bij vrouwen 8. Tamoxifen (TAM) is vaak gebruikt voor therapie in hormoon-responsieve borstkanker als een oestrogeenreceptor (ER) antagonist 9. Toch, andere rapporten het bewijs leveren van extra onafhankelijke mechanismen van apoptose inductie door TAM. In het bijzonder, TAM interactie met Complex I van de mitochondriale ademhalingsketen (MRC) op haar flavinmononucleotide (FMN) site 10.

PST is een natuurlijke stof geïsoleerd van de Hymenocallis littoralis plant. Tegenover van vele chemotherapeutica in gebruik, is gebleken om apoptose te induceren in een niet-genotoxisch wijze selectief in verschillende typen kankercellen via mitochondriale gericht 11-15. Echter preklinische en klinische praktijk gehinderd door de beschikbaarheid, is aanwezig in zeer geringe hoeveelheden in de natuurlijke bron en vele compliceidingen last zijn chemische synthese. We hebben gesynthetiseerd en gescreend synthetische analoga van 7 deoxypancratistatin en dergelijke waargenomen anti-kanker werking in een C-1 acetoxymethyl derivaat, JC-TH-acetaat-4 (JCTH-4) 16. We hebben nu in de hand een synthetisch PST-analoog met krachtige anti-kanker activiteit. De synthese is gestandaardiseerd en kan worden opgeschaald om voldoende hoeveelheden te produceren voor de preklinische en klinische werk. Aangezien de natuurlijke PST en TAM zowel de streefwaarde als de mitochondriën, zou het interessant zijn om het gecombineerde effect van een synthetisch analoog van PST te onderzoeken op de menselijke borstkanker en neuroblastoom cellen in combinatie met TAM.

Hierin melden wij selectief cytotoxiciteit van JCTH-4 in de menselijke neuroblastoom (SH-SY5Y) en borstkanker adenocarcinoom (MCF7) cellen. JCTH-4 kon apoptose te induceren in beide cellijnen van mitochondriaal targeting; JCTH-4 veroorzaakte afbraak van MMP en een toename van reactieve zuurstofspecies (ROS) productie geïsoleerde mitochondria van deze kankercellen. Verder werd autophagy geïnduceerd door JCTH-4 MCF7 cellen. Interessant is dat de toevoeging van TAM tot JCTH-4 belediging versterkt de bovengenoemde effecten van JCTH-4 SH-SY5Y en MCF7 cellen. Morfologische veranderingen veroorzaakt door JCTH-4 en TAM alleen en in combinatie met MCF7 cellen werden gecontroleerd met behulp van time-lapse microscopie van fase-contrast-of helderveld foto's. Normale menselijke foetale fibroblasten (NFF) vertoonden een duidelijke afname in de gevoeligheid voor JCTH-4 zowel alleen en in combinatie met TAM. Daarom zijn deze waarnemingen suggereren JCTH-4, alleen en in met TAM, om een ​​veilige en effectieve chemotherapeutische middel tegen borstkanker en neuroblastoom te zijn.

Materialen en methoden

1. Cel Cultuur

  1. Groei en cultuur SH-SY5Y humane neuroblastoom cellen (ATCC, Cat. No CRL-2266, Manassas, VA, USA) met Dulbecco's Modified Eagles Medium F-12 HAM (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada), aangevuld met 2 mM L-glutaminee, 10% foetaal bovine serum (FBS) en 10 mg / ml gentamicine (Gibco BRL, VWR, Mississauga, Canada). Handhaaf cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Groei en cultuur MCF7 menselijke borst adenocarcinoma cellen (ATCC, Cat. No HTB-22, Manassas, VA, USA) in RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich Canada, Mississauga, ON, Canada) aangevuld met 10% FBS-standaard (Thermo Wetenschappelijke, Waltham, MA) en 10 mg / ml gentamicine (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada). Handhaaf cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
  3. Groei en cultuur de ogenschijnlijk normale humane foetale fibroblasten (NFF) cellijn (Coriell Instituut voor Medisch Onderzoek, Cat. No AG04431B, Camden, NJ, USA) in Medium Dulbecco's Modified Eagle's, High Glucose (Thermo Scientific, Waltham, MA, Verenigde Staten ) aangevuld met 15% FBS en 10 mg / ml gentamicine (Gibco BRL, VWR, Mississauga, Canada). Handhaaf cellen bij 37 ° C en 5% CO2.

2. Drug Voorbereiding

  1. Weeg tamoxifen (TAM) citraat zout (Sigma-Aldrich, Cat. No T9262, Mississauga, ON, Canada) en los het op in DMSO om een ​​10 mM stockoplossing bereiden. Store voorraad oplossing bij -20 ° C tot gebruik. Alle besturingsorganen in deze studie opgenomen DMSO op minder dan 0,5%.
  2. Herhaal stap 2.1 tot 1 mm voorraadoplossing opgelost in DMSO van JC-TH-acetaat-4 (JCTH-4), die door chemoenzymatic synthese van broombenzeen zoals eerder beschreven 16 bereiden. Store voorraad oplossing bij -20 ° C tot gebruik. Alle besturingsorganen in deze studie opgenomen DMSO op minder dan 0,5%.

3. Time-lapse microscopie

  1. Plate ongeveer 2,0 x 10 5 MCF7 cellen in 35 mm met glazen bodem cultuur gerechten (MatTek Corporation, Cat. No P35G-014-C, Ashland, MA, USA) in steriele omstandigheden van een klasse II bioveiligheid kast en laat ze groeien 37 ° C en 5% CO2.
  2. Wanneer cellen 60 tot 70% confluentie bereiken behandelen met 1 uM JCTH-4 een 1 mMvoorraadoplossing opgelost in DMSO en 10 uM TAM een 10 mM voorraadoplossing opgelost in DMSO, alleen en in combinatie in een klasse II bioveiligheid kast.
  3. Na behandeling van cellen gedurende 48 uur plaats cellen in een verwarmde kamer bij 37 ° C met 5% CO2 in een stadium van een Leica DMI6000 fluorescentiemicroscoop (Leica Microsystems Wetzlar, Duitsland).
  4. Met behulp van LAS AF6000 software, stelt u de microscoop om fasecontrast of helderveld microfoto nemen op 400x vergroting om de 5 minuten gedurende 18 uur.

4. Nucleaire kleuring

  1. Plaat ongeveer 2,0 x 10 5 MCF7 of SH-SY5Y cellen in elk putje van een 6 en duidelijk beneden weefselkweek plaat een klasse II bioveiligheid kast en laten groeien bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Wanneer cellen 60 tot 70% confluentie bereiken behandelen met 1 uM JCTH-4 een 1 mM voorraadoplossing opgelost in DMSO en 10 uM TAM een 10 mM opgelost in DMSO voorraadoplossing zowelalleen en in combinatie met een klasse II bioveiligheid kast.
  3. Incubeer cellen met genoemde behandelingen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48 uur (SH-SY5Y cellen) of 72 uur (MCF7 cellen).
  4. Na behandeling en incubatie van cellen met drugs, deze direct Hoechst 33342 kleurstof (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) de media van de behandelde cellen tot een eindconcentratie van 10 uM de kernen vlek.
  5. Incubeer de cellen met Hoechst kleurstof 5 tot 10 minuten van licht.
  6. Plaats de plaat op het podium van een Leica DM IRB omgekeerde fluorescentiemicroscoop (Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland).
  7. Neem TL-en fase microfoto bij 400x vergroting.

5. Annexine V bindingsbepaling

  1. Plaat ongeveer 5,0 x 10 5 MCF7, SH-SY5Y of NFF cellen in 10 ml weefselkweekplaten een klasse II bioveiligheid kast en laten groeien bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Wkip cellen oplopen tot 60 tot 70% confluentie, behandel ze met 1 uM JCTH-4 met een 1 mM stockoplossing in DMSO opgelost en 10 uM TAM met een 10 mm stockoplossing in DMSO opgelost, zowel alleen als in combinatie in een klasse II bioveiligheid kast.
  3. Incubeer cellen met genoemde behandelingen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48 uur (SH-SY5Y cellen) of 72 uur (MCF7 en NFF cellen).
  4. Bereid Annexine V bindingsbuffer in DDH 2 O met 10 mM HEPES, 10 mM NaOH, 140 mM NaCl, 1 mM en CaCl2 bij pH 7,6 en bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
  5. Na de behandeling en incubatie van cellen met drugs, verwijder het materiaal uit de platen met gesuspendeerde cellen en plaats deze in een aparte 15 ml conische buis voor elke andere behandeling groep gelabeld met de juiste behandeling.
  6. Verwijder hechtende cellen van de platen met trypsine.
  7. Nadat de cellen opgetild de plaat tengevolge van de trypsine zuig de media geplaatst in de 15 ml conischeAl buis in stap 5.4 en plaats deze terug in hun originele platen met de trypsine opgeschort cellen.
  8. Met de elektronische pipet vulmiddel en serologische pipetten, meng de media met de trypsine cel oplossing en terug te plaatsen dit mengsel in de overeenkomstige 15 ml conische buizen.
  9. Centrifugeer de cellen bij 600 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C, de bovenstaande vloeistof van elke buis, en hersuspenderen cellen in PBS.
  10. Centrifugeer de cellen bij 600 g gedurende 5 minuten, de bovenstaande vloeistof van elke buis, en hersuspenderen cellen gelabeld microfuge buizen met 50 tot 70 ul van annexine V bindingsbuffer.
  11. Voeg Annexine V AlexaFluor-488 (1:50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, Canada) en Hoechst kleurstof tot een eindconcentratie van 10 uM en gedurende 15 minuten incuberen van licht.
  12. Na incubatie vortex een van de microcentrifuge buizen 7 tot 10 pi van de cel aan een mengsel microscoopglaasje, plaats een dekglaasje overtop van de cel mengsel op de microscoope slide en neem fluorescerende microfoto, zowel Annexine V en Hoechst beelden voor elke weergave, op 400x vergroting op een Leica DM IRB omgekeerd fluorescentiemicroscoop (Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland). Herhaal voor elke experimentele monster in elke resterende microcentrifuge buizen.

6. Water Oplosbare tetrazoliumzout (WST-1) test voor de levensvatbaarheid van de cellen

  1. Trypsinize een confluente T75 fles of 10 cm weefselkweek schotel van MCF7, SH-SY5Y, of NFF cellen in een klasse II bioveiligheid kast.
  2. Nadat de cellen zijn opgeheven, voeg 5 tot 10 ml van media aan de trypsine en plaats media celsuspensie in een 15 ml conische buis.
  3. Centrifugeer de cellen op 600 xg gedurende 5 minuten, terug te plaatsen van de buis in de bioveiligheid kast, schenk de bovenstaande vloeistof uit alle buizen, en resuspendeer de cellen in ongeveer 1 tot 3 ml van de media, afhankelijk van de celpellet grootte.
  4. Plaats 10 pi van de celsuspensie in een microcentrifuge buis wordt 10 pi van trypan blauw kleurstof (SIGMA-Aldrich, Mississauga, ON, Canada), en meng met een micropipet.
  5. Plaats 10 pi van Trypan blauwe gesuspendeerde cellen op een hemocytometer (Hausser Scientific, USA), tellen de cellen en de concentratie van cellen van de celsuspensie in de oorspronkelijke 15 ml conische buis.
  6. Met deze concentratie het volume van de oorspronkelijke celsuspensie nodig verdunde celsuspensies maken van concentraties van 1,5 x 10 5 cellen / ml voor MCF7 en SH-SY5Y en 5,0 x 10 cellen 4 voor NFF nodig plating bepalen.
  7. Gebruik verdunde celsuspensies te plaat 15 x 10 3 MCF7 of SH-SY5Y cellen / well of 5,0 x 10 3 NFF cellen / putje door toevoeging van 100 pi van het verdunde celsuspensies aan elk putje van een 96 duidelijke bottom weefselkweek plaat. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende de nacht.
  8. Behandel de cellen met 1 uM JCTH-4 en 10 uM TAM zowel alleen en in combinatie in een klasse II bioveiligheid kast voor 72 uurs voor MCF7 en NFF cellen en gedurende 48 uur SH-SY5Y cellen.
  9. Na behandeling en incubatie van drugs, voeg 10 pi WST-1 reagens (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) in elk putje en de plaat gedurende 4 uur incuberen bij 37 ° C en 5% CO2.
  10. Neem absorptie metingen bij 450 nm op een Wallac Victor 3 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canada) en drukken ze als percentages van het oplosmiddel controlegroepen.

7. Tetramethylrodamine Methyl Ester (TMRM) kleuring

  1. Plaats een dekglaasje in elk putje van een 6 uit de buurt onder weefselkweek plaat en de plaat MCF7 cellen in elke well van een 6 goed weefselkweek plaat in een klasse II bioveiligheid kast. Laat te groeien bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Wanneer cellen 60 tot 70% confluentie bereiken, te behandelen met 1 uM JCTH-4 een 1 mM voorraadoplossing opgelost in DMSO en 10 uM TAM een 10 mM voorraadoplossing opgelost in DMSO,zowel alleen als in combinatie in een klasse II bioveiligheid kast.
  3. Incubeer cellen met genoemde behandelingen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 72 uur.
  4. Na behandeling en incubatie van cellen met drugs, deze direct Hoechst 33342 kleurstof (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) de media van de behandelde cellen tot een eindconcentratie van 10 uM de kernen en tetramethylrhodamine methylester (TMRM vlek ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, Canada) bij een eindconcentratie van 200 nM.
  5. Incubeer de cellen met de kleurstoffen in 5% CO2 en 37 ° C gedurende 45 minuten van licht.
  6. Pipetteer 8 ul van de media of PBS op een objectglaasje en neem een ​​dekglaasje van de 6 goed bord en plaats deze op de top van de media of PBS op het objectglaasje met de cellen naar beneden met een pincet.
  7. Neem fluorescerende microfoto, zowel Hoechst en TMRM microfoto voor elke weergave, met een Leica DM IRB omgekeerd fluorescentiemicroscoop (Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland) bij 400x vergroting.

8. Mitochondriale Isolatie

  1. Bereid 10 ml hypotone buffer (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCl, 210 mM mannitol, sucrose 70 mM, 10 pM Leu-pep, 10 pM Pep-A en 100 pM PMSF) en het reactieproduct buffer te houden en beide oplossingen op ijs.
  2. Met ongeveer 8 tot 10 confluente T75 weefselkweekflessen SH-SY5Y cellen trypsinize de cellen media toevoegen aan de trypsine neutraliseren verzamelen celsuspensies in 50 ml conisch en centrifugeer de buis 600 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  3. Verwijder de supernatant en hersuspenderen celpellets ongeveer 10 tot 20 ml koude PBS gecentrifugeerd buizen 600 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C en wanneer herhalen wasproces.
  4. Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de cellen in een koude hypotone buffer. Handmatig homogeniseren cellen met een glasvlies molen en gecentrifugeerd cellysaat 600 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.

9. Amplex Red Assay

  1. Na het isoleren mitochondria van cellen, de mogelijke concentratie eiwit van het monster van geïsoleerde mitochondria een standaard curve van bekende concentraties van 1mg/ml BSA (runderserumalbumine) met de BioRad eiwit assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA) .
  2. De geschatte concentratie van eiwit van de geïsoleerde mitochondria oplossing berekenen volume van de oplossing tot 20 ug eiwit te geven. Pipetteer dit volume in elk putje van een ondoorzichtige 96-wells plaat met 20 ug eiwit / well laden.
  3. Vul elk putje in de plaat tot een totaal volume van 100 pi met reactiebuffer, medicatie (met een uiteindelijke concentratie van 1 pM JCTH-4 en / of 10 pM TAM of 250 uM PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, , Canada) gebruikt als positieve controle), Amplex Red reagens in een eindconcentratie van 50 uM, en mierikswortel-peroxidase (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, Canada) in de verhouding van 6 U/200 ul.
  4. Na een 2 uur durende incubatie, neem fluorescentie metingen op Ex. 560 nm en Em. 590 nm op een spectrofluorometer (SpectraMax Gemini XPS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

10. Cellular Lysate Voorbereiding

  1. Groei MCF7 cellen 60 tot 70% confluence in 10 cm weefselkweekschalen platen.
  2. Behandel cellen met 1 uM JCTH-4 en 10 uM TAM alleen of in combinatie 72 uur met 10 tot 15 platen per behandelingsgroep.
  3. Bereid cel lysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100, 10 uM Leu-pep, 10 pM Pep-A en 100 pM PMSF ) en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
  4. Mechanisch los cellen van de plaat oppervlakken met een cel schraper en het verzamelen van cellen in geëtiketteerde 50mL conisch.
  5. Centrifugeer de buizen 600 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C, de bovenstaande vloeistof en hersuspenderen celpellets ongeveer 10 tot 20 ml koude PBS centrifuge de buizen 600 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C, en herhaal wasproces keer.
  6. Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de cellen in een koude cel lysis buffer. Handmatig homogeniseren cellen met een glasvlies molen en gecentrifugeerd cellysaat 600 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  7. Gooi de pellets en opslaan cellysaten bij -20 ° C tot gebruik.

11. Western Blot Analyses

  1. Bepaal de eiwitconcentratie van cellysaten met de BioRad eiwit assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA). Onderwerpen het eiwit monsters SDS-PAGE en overdracht eiwit naar een nitrocellulose membraan.
  2. Na overdracht blok membranen met 5% w / v melk TBST (Tris-gebufferde zoutoplossing Tween-20) oplossing gedurende 1 uur.
  3. Probe membranen met een mieri-LC3 antilichaam opgewekt bij konijnen (1:500) (Novus Biologicals, Cat. No NB100-2220, Littleton, CO, USA), of een anti-β-actine antilichaam getogen in muis (1:1000) (Santa Cruz Biotechnologie, Inc, Cat. No sc-81178, Paso Robles, Californië, USA) overnacht bij 4 ° C.
  4. Onder membranen een 15 minuten en twee wasbeurten 5 minuten in TBST Incubeer met een anti-muis (1:2000) of een anti-konijn (1:2000) mierikswortel peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam (Abcam, Cat. Nr. ab6728 & ab6802, Cambridge, MA, USA) gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  5. Onder voorbehoud van membranen voor drie opeenvolgende 5 minuten wassen in TBST en visualiseren eiwitbanden met verbeterde chemiluminescentie reagens (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Canada).
  6. Uitgevoerd densitometrie analyses met behulp van ImageJ software.

12. Monodansylcadaverine (MDC) kleuring

  1. Plaats een dekglaasje in elk putje van een 6 uit de buurt onder weefselkweek plaat en de plaat MCF7 cellen in elk putje van een 6goed duidelijk onder weefselkweek plaat in een klasse II bioveiligheid kast. Laat te groeien bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Wanneer cellen 60 tot 70% confluentie bereiken behandelen met 1 uM JCTH-4 een 1 mM voorraadoplossing opgelost in DMSO en 10 uM TAM een 10 mM voorraadoplossing opgelost in DMSO, zowel alleen en in combinatie in een klasse II bioveiligheid kast.
  3. Incubeer cellen met genoemde behandelingen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 72 uur.
  4. Na behandeling en incubatie van cellen met drugs, deze direct Monodansylcadaverine (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, Canada) tot een eindconcentratie van 0,1 mM aan elk putje gedurende 15 minuten.
  5. Incubeer de cellen met de kleurstof op 5% CO2 en 37 ° C gedurende 15 minuten van licht.
  6. Pipetteer 30 ul van de media of PBS op een objectglaasje en neem een ​​dekglaasje van de 6 goed bord en plaats deze op de top van de media of PBS op het objectglaasje met de cellen FACIng naar beneden met een pincet.
  7. Neem TL-MDC en fase microfoto, voor elke weergave, met een Leica DM IRB omgekeerd fluorescentiemicroscoop (Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland) bij 400x vergroting.

13. Representatieve resultaten

Selectieve inductie van apoptose in de moedermelk Darmkanker en neuroblastomacellen door JCTH-4: Versterking van de activiteit door TAM

Selectieve inductie van apoptose werd aangetoond in verschillende kankercellen door natuurlijke PST (Fig. 1a) 11-13. Door de geringe beschikbare PST hebben wij gesynthetiseerd analogen van 7 deoxypancratistatin (JCTH-4, Fig. 1b) en gescreend ze vergelijkbare anti-kanker werking in menselijke borstadenocarcinoom (MCF7) en neuroblastoma cellen (SH-SY5Y). In de eerste fase van experimenten wilden we morfologische veranderingen in de tijd na de behandeling met JCTH-4 en TAM alleen te controleren en in combinatie met MCF7 cels. MCF7 cellen werden gevolgd gedurende 18 uur, zoals te zien in Video 1 geproduceerd door time-lapse microscopie met fase-contrast-foto's, met oplosmiddel behandeling (controle) voor 48 uur; deze cellen vertoonden geen grote veranderingen in de morfologie. Daarentegen na 48 uur van 1 pM JCTH-4 behandeling vertoonden deze cellen morfologische veranderingen bij apoptose zoals krimp, blebbing apoptotische lichaam vorming gezien in Video 2. Anderzijds, TAM behandeling alleen in MCF7 cellen die een uitgesproken morfologie met gestippelde insluitsels indicatief autofagosomen verbonden autofagie (Video 3). Zeer weinig apoptotische morfologie waargenomen en cellen algemeen getoond gezonde morfologie vergelijkbaar met oplosmiddel behandelde controle MCF7 cellen. Interessant is dat in aanwezigheid van TAM werd de apoptotische inductie door JCTH-4 drastisch versterkt zoals door de verhoogde apoptotische morfologie MCF7 cellen na 48 uur illustrated in de Video-4.

In de tweede fase van experimenten gebruikt fluorescerende kleurstoffen de inductie van apoptose te evalueren. Na 72 uur en 48 uur van 1 pM JCTH-4 behandeling MCF7 en SH-SY5Y cellen respectievelijk werd Hoechst kleurstof gebruikt en nucleaire morfologie volgen. De resultaten geven gecondenseerd helder gekleurd kernen samen met apoptotische lichamen in MCF7 en SH-SY5Y cellen indicatief apoptotische inductie (Fig. 2a, b). TAM behandeling alleen leverde minimale apoptotische nucleaire morfologie in MCF7 en SH-SY5Y cellen, kernen waren grote, ronde, en vaag gekleurd met Hoechst vergelijkbaar met oplosmiddel controlegroep (afb. 2a, b). In overleg met Video 4 kernen van MCF7 en SH-SY5Y cellen vertoonden een duidelijke toename van apoptotische morfologie met de combinatie behandeling na 72 uur (afb. 2a, b).

Om apoptotische inductie te controleren, werden de cellen onderzocht op phosphatidylserine uitbesteding, een marker voor apoptose, via een Annexine V bindingsassay 17. MCF7 en SH-SY5Y cellen behandeld gedurende 72 uur en 48 uur respectievelijk 1 uM JCTH-4 alleen en in combinatie met 10 pM TAM positief voor annexine V binding aan het groene fluorescentie, hetgeen de inductie van apoptose (figuur 3a, b ). Nr. duidelijk externalisering fosfatidylserine waargenomen in MCF7 en SH-SY5Y cellen behandeld met TAM alleen en in NFF cellen behandeld met de genoemde behandelingen groepen na 72 uur (fig. 3c). Daarom JCTH-4 alleen en in combinatie met TAM induceert apoptose in selectief MCF7 en SH-SY5Y cellen.

Om het effect van JCTH-4 alleen kwantificeren en in combinatie met TAM een WST-1 gebaseerde colorimetrische analyse voor levensvatbaarheid van de cellen, een indicator van actieve cel metabolisme, werd uitgevoerd op MCF7 en NFF cellen behandeld gedurende 72 uur en SH-SY5Y cellen behandeld gedurende 48 uur.Vergeleken met het oplosmiddel controlegroepen, 1 pM JCTH-4 daalde actieve cel metabolisme meer dan 50% en 10 uM TAM alleen vertoonden geen significant verschil in zowel MCF7 en SH-SY5Y cellen (Fig. 4a, b). Interessant in MCF7 en SH-SY5Y cellen toevoeging van TAM tot JCTH-4 belediging resulteerde in een synergistische vermindering in cel metabolisme. NFF cellen drastisch minder gevoelig voor zowel JCTH-4 alleen en JCTH-4 TAM (Fig. 4c). Daarom JCTH-4 toont selectieve synergetische activiteit TAM in MCF7 en SH-SY5Y cellen.

Mitochondriale Targeting van JCTH-4

Om te zien of JCTH-4 is gericht op de mitochondriën om apoptose mitochondriale membraanpotentiaal te induceren in hele cellen en ROS generatie in geïsoleerde mitochondria werd gevolgd. MCF7 cellen werden behandeld gedurende 72 uur en gekleurd met TMRM. 1 pM JCTH-4 daalde MMP, aangegeven door het verlies van rode fluorescentie (Fig. 5a). Echter, met the toevoeging van 10 uM TAM, werd een grotere afvoer van MMP waargenomen, terwijl 10 uM TAM alleen had geen duidelijk effect op de MMP.

Als verhoogt ROS generatie in verband zijn gebracht op het mitochondriale membraanpotentiaal permeabilisatie en apoptose inductie, werd de productie van ROS beoordeeld met Amplex rode kleurstof in geïsoleerde mitochondria van de SH-SY5Y cellen behandeld met 1 uM JCTH-4 en 10 uM TAM, alleen en in combinatie 18 -20. Fluorescentie metingen werden uitgedrukt als relatieve fluorescentie-eenheden (RFU). Stijgingen in ROS-productie waargenomen met JCTH-4 TAM alleen (Fig. 5b). Interessant is dat combinatiebehandeling leverde een grotere toename van de ROS productie. Een bekende inductor van ROS productie in de mitochondriën, PQ, werd gebruikt als een positieve controle.

Inductie van autofagie door JCTH-4 en TAM

Autofagocytische inductie wordt in verband gebracht met chemotherapeutische belediging door een groot aantal verschillende verbindingen (fig. 6a). Met name de intensiteit van de MDC kleuring was het grootst bij de combinatie behandeling, gevolgd door TAM alleen, en JCTH-4 alleen.

Tijdens autofagie, microtubuli-geassocieerde eiwit 1 lichte keten 3 (LC3) normaal gelegen in het cytosol (LC3-I), wordt lipidated met fosfatidylethanolamine en vervolgens gelokaliseerd aan de autophagosomal membranen (LC3-II) 2. Om de inductie van autofagie verifiëren werden niveaus LC3-II beoordeeld MCF7 cellen behandeld gedurende 72 uur via western blot analyse. 1 uM JCTH-4 iets veroorzaakt de omzetting van LC3-I om LC3-II, terwijl 10 uM TAM produceerde een grotere autofagocytische respons (Fig.6b). Interessant combinatiebehandeling resulteerde in de grootste inductie van autofagie, waarbij een LC3-II LC3-ratio groter dan 3. Daarom zijn deze resultaten tonen aan autofagocytische inductie in MCF7 cellen door JCTH-4 en TAM alleen en in combinatie, met de grootste respons in cellen met de combinatie behandeling.

Aanvullende Video 1. Cellulaire morfologie van MCF7 cellen behandeld met oplosmiddel controle. MCF7 cellen werden gevolgd tussen 48 en 66 uur na de oplosmiddel controle behandeling (DMSO) met behulp van time-lapse microscopie met fase contrast foto's. Cellen werden bij 37 ° C en 5% CO2. Beelden werden vastgelegd op 400x vergroting. Klik hier om de video te bekijken .

Aanvullende Video 2. Inductie van apoptotische cellulaire morfologie in MCF7 cellen behandeld met JCTH-4. MCF7 cellen werden gevolgd tussen 48 en 66 uur na de behandeling with 1 uM JCTH-4 met behulp van time-lapse microscopie met fase contrast foto's. Cellen werden bij 37 ° C en 5% CO2. Beelden werden vastgelegd op 400x vergroting. Klik hier om de video te bekijken .

Aanvullende Video 3. Inductie van autofagocytische cellulaire morfologie in MCF7 cellen behandeld met TAM. MCF7 cellen werden gevolgd tussen 48 en 66 uur na de behandeling met 10 uM TAM met behulp van time-lapse microscopie met fase contrast foto's. Cellen werden bij 37 ° C en 5% CO2. Beelden werden vastgelegd op 400x vergroting. Klik hier om de video te bekijken .

Aanvullende Video 4. Enhanced apoptotische morfologie door JCTH-4 met TAM in MCF7 cellen. MCF7 cellen werden gevolgd tussen 48 en 66 uur na de behandeling met zowel 1 uM JCTH-4 en 10 uM TAM met behulp van time-lapse microscopie met fase contRast foto's. Cellen werden bij 37 ° C en 5% CO2. Beelden werden vastgelegd op 400x vergroting. Klik hier om de video te bekijken .

Figuur 1
Figuur 1. Structurele vergelijking van PST een synthetisch 7-deoxy analoge. (A) Chemische structuur pancratistatin (PST). (B) Chemische structuur JC-TH-acetaat-4 (JCTH-4).

Figuur 2
Figuur 2. JCTH-4 induceert nucleaire apoptotische morfologie met verhoogde activiteit met TAM. Nuclear morfologie van (a) MCF7 en (b) SH-SY5Y cellen behandeld gedurende 72 uur en 48 uur respectievelijk de aangegeven concentraties TAM en JCTH-4 gekleurd met Hoechst kleurstof. Controlegroepen werden behandeld met oplosmiddel (DMSO). 's Werden genomen op 400x vergroting van een fluorescentiemicroscoop. Schaal bar = 15 pm.

Figuur 3
Figuur 3. JCTH-4 oorzaken fosfatidylserine externalisering alleen en in combinatie met TAM selectief in kankercellen. Annexine V binding uitwendige fosfatidylserine werd geëvalueerd door inductie van apoptose inductie verifiëren (a) MCF7 (72 uur), (b) SH-SY5Y (48 uur), en (c) NFF (72 uur) cellen behandeld met JCTH-4 en TAM in de aangegeven concentraties. Controlegroepen werden behandeld met oplosmiddel (DMSO). 's Werden genomen op 400x vergroting van een fluorescentiemicroscoop. Schaal bar = 15 pm.

Figuur 4
Figuur 4. TAM verbetert levensvatbaarheid daling van JCTH-4 selectief in kankercellen. 96 putjes werden geënt wie (a) MCF7, (b) SH-SY5Y en (c) NFF cellen behandeld met JCTH-4 TAM in de aangegeven concentraties. MCF7 en NFF-cellen werden behandeld gedurende 72 uur en SH-SY5Y werden behandeld gedurende 48 uur. Plaats medicatie en incubatie werd WST-1 reagens toegevoegd aan elk putje en de absorptie-aflezingen werden genomen op 450 nm, uitgedrukt als percentage van de controle (DMSO). De statistieken werden uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism versie 5.0. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD van quadruplicates van 3 onafhankelijke experimenten. MCF7: * p <0,001, ** p <0,0001 versus controle; # p <0,05 versus 1 uM JCTH-4; † p <0,0001 versus 10 uM TAM. SH-SY5Y: * p <0,0005 versus controle; # p <0,005 versus 1 pM JCTH-4; † p <0.005 versus 10 uM TAM. NFF: * p <0.005 versus 10 uM TAM + 1 uM JCTH-4 MCF7 cellen # p <0,01 vergeleken 10 uM TAM + 1 uM JCTH-4 SH-SY5Y cellen.

Figuur 5
Figuur 5. JCTH-4 TAM werken op de mitochondria. (A) MCF7 cellen werden gegroeid op dekglaasjes en behandeld met de aangegeven concentraties van geneesmiddelen 72 uur en gekleurd met TMRM aan MMP evalueren. Cellen van de controlegroep werd behandeld met oplosmiddel (DMSO). Beelden werden vastgelegd met 400x vergroting op een fluorescentie microscoop. Schaal bar = 15 pm. (B) geïsoleerd mitochondria van SH-SY5Y cellen werden behandeld met JCTH-4 TAM in de aangegeven concentraties en ROS productie bepaald met Amplex Red substraat in aanwezigheid van horseradish peroxidase (HRP). De controlegroep cellen werden behandeld met oplosmiddel (DMSO). Paraquat (PQ) werd gebruikt bij een concentratie van 250 uM als positieve controle. Fluorescentie waarden werden verkregen na 2 uur behandeling Ex. 560 nm en Em. 590 nm, uitgedrukt als relatieve fluorescence-eenheden (RFU). De statistieken werden verkregen met behulp van GraphPad Prism versie 5.0. De gegevens representatief is voor 3 onafhankelijke experimenten met gelijkaardige trends. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD van quadruplicates van een onafhankelijk experiment. * P <0,05, ** p <0.005 *** p <0,001 versus controle; # p <0,05 vergeleken 1 pM JCTH-4; † p <0,05 vergeleken 10 uM TAM; @ p <0,05 versus 250 uM PQ.

Figuur 6
Figuur 6. TAM verbetert autofagocytische inductie van JCTH-4. (A) MCF7 cellen werden gegroeid op dekglaasjes en onderworpen aan JCTH-4 TAM belediging in de aangegeven concentraties voor 72 uur. Controlegroep cellen werden behandeld met oplosmiddel (DMSO). Na de behandeling, werden MCF7 cellen gekleurd met MDC om autofagocytische vacuolen op te sporen. Beelden werden vastgelegd met 400x vergroting op een fluorescentie microscoop. Schaal bar = 15 pm. (b) Western blot analyses werden uitgevoerd LC3 en β-actine op cellysaten van MCF7 cellen behandeld met de aangegeven concentraties van geneesmiddelen voor 72 uur. Densitometrische analyses werden uitgevoerd met behulp van ImageJ software. De statistieken werden uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism versie 5.0. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. * P <0,05, ** p <0.005 *** p <0,0005 versus controle; # p <0,001 versus 1 pM JCTH-4; † p <0,001 versus 10 uM TAM.

Lijst van afkortingen.

ER oestrogeen receptor
FMN flavinmononucleotide
JCTH-4 JC-TH-acetaat-4
LC3 microtubuli-geassocieerde eiwit 1 lichte keten 3
MDC monodansylcadaverine
MMP mitochondrial membraanpotentiaal
MRC mitochondriale ademhalingsketen
NFF normale menselijke foetale fibroblasten
PQ paraquat
PST pancratistatin
RFU relatieve fluorescentie-eenheden
ROS reactive oxygen species
TAM tamoxifen
TMRM tetramethylrhodamine methylester

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PST en soortgelijke verbindingen is aangetoond om anti-kanker eigenschappen 11-15,21. We hebben eerder gemeld natuurlijke PST om selectief te destabiliseren de mitochondriën in kankercellen, die veroorzaakt daarbij apoptose door het vrijkomen van apoptotische factoren 12,14. Het is zeer waarschijnlijk dat JCTH-4 werkt via hetzelfde werkingsmechanisme heeft; JCTH-4 veroorzaakt MMP ineenstorting van de MCF7 cellen gezien met TMRM kleuring (afb. 5a), en een verhoogde productie van ROS in geïsoleerde mitochondria van de SH-SY5Y cellen (Fig. 5b), indicatief zijn voor mitochondriale dysfunctie. Zo inductie van apoptose door JCTH-4 waarschijnlijk door mitochondriale targeting in kankercellen.

Tal van verschillen tussen goedaardige en kanker cellen die kunnen als basis voor kanker selectiviteit te dienen door JCTH-4. Kankercellen sterk afhankelijk glycolyse en minder op mitochondriën voor energiewinning, dit verschijnsel wordt eens het Warburg effect 22. Dergelijke metabolische activiteit in de kankercellen tot hoge zuurgraad in de cytosol. Bijgevolg is de zure cytosolische omgeving draagt ​​bij kankercellen de mitochondriën hyperpolarisatie die is gekoppeld aan een versterkt vermogen om binnen te vallen en te ontwijken apoptose 23. Hyperpolariztion van kanker cel mitochondriën kan echter kankercellen kwetsbaar voor JCTH-4 maken, eenmaal opgenomen in de cel, JCTH-4 kan een positieve lading te verwerven door middel van enzymatische verwerking en kunnen selectief worden opgenomen in kankercellen mitochondriën als gevolg van hun gehyperpolariseerde de natuur. Bovendien zijn een reeks bijbehorende mitochondria anti-apoptotische eiwitten aangetoond zeer uitgedrukt in kankercellen mitochondriale membranen en permeabilisatie verdere uitvoering van apoptose zoals anti-apoptotische eiwitten van Bcl-2 familie van eiwitten 24-26 verbieden.

In de aanwezigheid van verschillende vormen van celspanning wordt opgewekt als autofagiepro-survival reactie, waardoor cellen overleven onder ongunstige omstandigheden 2. Overstimulatie van dit pad kan echter tot uitgebreide afbraak van vitale intracellulaire componenten aanleiding geven tot autofagocytische celdood 3. Zowel de pro-survival en pro-dood autofagocytische reacties zijn geassocieerd met chemotherapeutische belediging 3. Mitochondriale dysfunctie door JCTH-4 leidt tot oxidatieve stress kan leiden tot een automatische standaard autofagocytische reactie. Inderdaad we wel een aantal autofagocytische inductie, samen met apoptose met JCTH-4 behandeling (afb. 2a, b 3a, b 6a, b). Hoewel TAM is goed gevestigd als een ER-antagonist in ER positieve borstkanker cellen, is onlangs aangetoond dat interactie met de mitochondriën, de binding aan de FMN site van Complex I 10. Bovendien, TAM is een bekende inductor van autofagie in vele typen kankercellen 3. Inderdaad, TAM deden leiden tot een toename van de ROS generatie in geïsoleerde mitochondria (Fig. 5b). Echter, een dergelijke interactie bleek onvoldoende te zijn om MMP collaps (afb. 5a), maar voldoende om een typisch pro-survival autofagocytische respons te induceren veroorzaken. Uitgebreide autofagocytische inductie werd waargenomen wanneer JCTH-4 en TAM werden gebruikt in combinatie (Fig. 6a, b), die gepaard ging met een verbeterde cytotoxische respons (Fig. 4a, b), die wijzen op een pro-dood autofagocytische reactie; toch de kankercellen uiteindelijk sterven apoptose als gevolg van mitochondriale permeabilisatie en apoptotische factoren afgifte. Een dergelijke opname door de TAM naar JCTH-4 belediging kan worden toegeschreven aan de toename van de ROS generatie door TAM. Omdat zowel TAM en JCTH-4 kunnen oxidatieve stress genereren, kan de productie van combinatoriële deze spanning met beide verbindingen tot uitgebreide autofagocytische inductie waardoor een nadelige autofagocytische reactie en / of grote mitochondriale permeabilisatie en vervolgens apoptose. Thwordt gecombineerd behandeling heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van goedaardige fibroblasten (afb. 4c). Deze bevindingen geven aan dat JCTH-4 alleen en in combinatie met TAM efficiënt kunnen worden gebruikt om borstkanker en de behandeling van neuroblastoom zonder nadelige effecten op de goedaardige cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de Ridders van Columbus Hoofdstuk 9671 (Windsor, Ontario), en een CIHR Frederick Banting en Charles Best Canada Graduate Scholarship uitgereikt aan Dennis Ma. Hartelijk dank aan Robert Hodge en Elizabeth Fidalgo da Silva voor hun hulp bij de time-lapse microscopie. Bedankt aan Katie Facecchia voor het bewerken van de time-lapse microscopie video's. Wij zouden ook graag Sudipa juni Chatterjee en Phillip Tremblay bedanken voor de kritische beoordeling van dit manuscript. Dit werk is opgedragen ter nagedachtenis van Kevin Couvillon die zijn strijd tegen kanker verloren in 2010.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SH-SY5Y cell line ATCC CRL-2266
Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM Sigma-Aldrich 51448C
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 16000-044
MCF7 cell line ATCC HTB-22
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R 0883
Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) Coriell Institute for Medical Research AG04431B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30022.01
Tamoxifen citrate salt Sigma-Aldrich T9262
35 mm glass bottom culture dishes MatTek Corp. P35G-014-C
Leica DMI6000 B inverted microscope Leica Microsystems N/A
H–chst 33342 dye Molecular Probes, Life Technologies H3570
Leica DM IRB inverted fluorescence microscope Leica Microsystems N/A
Annexin V AlexaFluor-488 Invitrogen A13201
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-20ML
Haemocytometer Fisher Scientific 267110
WST-1 reagent Roche Group 11644807001
Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter PerkinElmer, Inc. 1420-011
Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) GIBCO, by Life Technologies T-668
Glass tissue grinder Fisher Scientific K8885300-0002
BioRad protein assay Bio-Rad 500-0001Bottom of Form
Amplex Red Invitrogen A12222
Horseradish peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8125
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices 3126666
Anti-LC3 antibody raised in rabbit Novus Biologicals NB100-2220
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6728
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6802
Chemiluminescence peroxidase substrate Sigma-Aldrich CPS160
Monodansylcadaverine Sigma-Aldrich 30432

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
  2. Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
  3. Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
  6. Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
  7. Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
  8. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
  9. Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
  10. Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
  11. Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
  12. McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
  13. Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6 (2010).
  14. Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
  15. Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
  16. Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
  17. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
  18. Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
  19. Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
  20. Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
  21. Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. an, Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
  22. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  23. Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
  24. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  25. Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
  26. Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).
Verbetering van de apoptotische en autofagocytische Inductie door een nieuwe synthetische C-1-analoog van 7-deoxypancratistatin in de moedermelk Darmkanker en Neuroblastoom Cellen met Tamoxifen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).More

Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter